方法論記事

表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮

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DOI：

10.3791/55382

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2017年2月16日

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1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 3Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 4Department of Biomedical Research, National Jewish Health

この記事について

サマリー

機能的および表現型分析のために、抗原反応性B細胞を検出し、豊かに磁性ナノ粒子を使用するシンプルで効果的な方法が記載されています。

要約

特定の抗原と反応する

B細胞は、通常、リンパ球の<0.05%の頻度で発生します。何十年もの間、研究者たちは、表現型や生物学の研究のために、これらの希少な細胞を単離し、濃縮する方法を模索してきました。アプローチは必然的に、B細胞は、分化した娘によって最終的に分泌される抗体の特異性を代表する細胞表面受容体によって天然抗原を認識するという原則に基づいています。おそらく、この問題に対する最も明白なアプローチは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)と組み合わせた蛍光色素標識抗原の使用です。ただし、これらの方法の有用性は、細胞の周波数と、電子ソーティングによる分析と分離の達成可能な速度によって制限されます。磁性ナノ粒子を用いて希少抗原特異的B細胞を濃縮する新しい方法が記載されており、その結果、大きな開始細胞集団から抗原反応性B細胞が高収率で濃縮されます。この方法により、免疫後や自己免疫の発現中など、in vivo抗原との遭遇前およびその後の抗原反応性細胞の表現型と生物学のモニタリングを改善することができます。

概要

限界希釈する抗体分泌細胞の前駆体頻度の分析は、特定の抗原に対して反応性B細胞は、典型的には、ワクチン接種の状態と抗原上に存在するエピトープのサイズ/数に応じて、通常のレパートリーは0.05〜0.005％の頻度で起こることを示唆しています。これらの細胞の低頻度は、それが難しいような外来抗原、または自己免疫の開発中に、次のワクチン接種または暴露のような免疫応答の開発中にその状態の変化を研究するために作られました。以前に、研究者らは、抗原被覆プレートまたはカラムの吸着剤から、抗原でコーティングされた赤血球のリセットに、1、2、3、4、5を蛍光活性化細胞選別、6の範囲の技術を用いて抗原反応性B細胞の単離を行っています。 Thougこれらの技術は、抗原反応性B細胞を同定及び単離に成功している時間は、その結果は、収率、純度およびスケーラビリティの点で変化しています。最近では、両方の検出および磁性ナノ粒子を用いた希少なBリンパ球亜集団を豊かにする新規な方法を開発しました。この方法は、大きな始動集団からの比較的高い収率および純度で濃縮を可能にし、抗原に対する応答の解析と互換性があります。懸濁液中の細胞の集団から豊かにすることで、この方法は、抗原をコーティングしたプレートまたは列、および限界スループットのジオメトリに関連付けられている制約を排除します。濃縮された細胞は、抗原および蛍光レポーターに関連付けられたままであるので、最終的に、彼らはさらに、FACS選別によって精製することができます。本明細書に記載するように、私たちは前に、末梢血破傷風トキソイド反応性B細胞の研究のために、このアプローチを使用し、様々なautoiを有する被験者からヒト被験者の免疫化、ならびに自己反応性B細胞を、次のしています1型糖尿病、バセドウ病、橋本病7を含むmmune障害、。この方法は、マウスおよびヒトで同様に動作し、種々の組織（原稿準備中）からの抗原反応性B細胞の解析と互換性があります。

その基本的な形式では、末梢血単核細胞を、最初に表現型分析のために必要な表面抗原、細胞に対する抗体と一緒にビオチン化抗原と共にインキュベートします。この標識工程は、洗浄及び固定に続いて、ストレプトアビジンを添加する（ 図1）ビオチン化抗原結合細胞の検出のための遠赤色蛍光色素に結合されています。以前の研究は同様に、抗原特異的B細胞を同定したが、直接蛍光色素8、9、10、11に結合させた抗原を用いています。これは価値があるが、アプローチは、ストレプトアビジンと組み合わせたビオチン化抗原の使用は、抗原は12、13、14小さい場合は特に、大きな信号増幅（結合および非結合細胞の、したがってより良い差別化）を可能にします。追加の考慮事項は、ストレプトアビジンの代わりにストレプトアビジンが脱グリコシル化されているので、非特異的結合を減少させるの使用です。さらに、我々は、その光安定、量子収率（明るさ）、およびその小さなサイズ（〜1.3キロダルトン）に蛍光色素として遠赤蛍光染料を使用しています。彼らは潜在的に多くの抗原性エピトープを含んでいるので、このようなフィコエリトリン（〜250キロダルトン）およびアロフィコシアニン（〜105 kD）の15のようなタンパク質の蛍光色素は最適ではありません。このような遠赤色蛍光色素として、単一のエピトープからなる小有機蛍光色素の使用は、単離された細胞集団の複雑性を低減します。

細胞がされるとビオチン化-Antigenと遠赤蛍光色素 - ストレプトアビジン吸着は、それらが抗遠赤蛍光色素結合磁性ナノ粒子を使用して濃縮されています。シングルナノ粒子は、ほとんどのフローサイトメーターによって検出されていないため、FACSソーティングと下流のアッセイ16による精製の前に除去する必要はありません。抗原特異的なB細胞のための磁気選択、フローサイトメーターを使用して稀なイベントを選別する時間とコストを排除する、関心の集団を濃縮します。

我々は前と7日破傷風トキソイドの追加免疫後に被験者からの破傷風トキソイド特異的B細胞の濃縮から代表的な結果を示し、以下に。我々は、in vivo刺激における急性以下の抗原特異的B細胞を濃縮するために、この方法の能力を実証するために、一例として、この特定のアプリケーションを選択しました。フローサイトメトリーと組み合わせると、この方法は、抗原特異的ナイーブ、メモリを濃縮し、分化することが可能であり、かつ形質B細胞および研究者が時間をかけて自分の周波数の変化に追従することができます。また、我々は、 例えば、細胞は、濃縮後の抗体を分泌する能力を保持することを実証するELISPOTアッセイ、別の可能な下流アッセイを含みます。この方法の別の用途は、宿主に濃縮された細胞の養子移入を伴う可能性があります。我々は以前に、細胞が単離および転送次抗原特異的T細胞を抗原提示細胞として作用する能力を維持示した（データ示さず）。したがって、一緒に抗原特異的免疫応答の理解を通知する方法、に結合することができる可能な下流アッセイの数があります。我々は全体の収率、純度、細胞特異性、および折り畳み式濃縮を決定するための制御を含む、以下の方法を、記載しています。

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プロトコル

ヒトPBMCの1の単離

  1. ヘパリン処理した採血管を用いて血液30〜50ミリリットル集めます。
    注：使用される血液の量は、目的の抗原特異的B細胞の血液中の特定の実験的な質問と周波数に依存します。ヘパリン化血液はすぐに処理されるか、または翌日処理するために、室温で一晩穏やかに揺動させることができます。処理の遅延は、濃縮の効率にはほとんど影響があり、生存能力の最小の損失と関連しています。
  2. 無菌、室温マグネシウムおよびカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1：全血1を混ぜます。
  3. 50ミリリットル滅菌コニカルチューブで、室温密度勾配溶液10mlを加えます。 4℃で暗所で開かれた密度勾配ボトルを保管しますが、使用前に室温に温めます。
  4. 可能であれば、ゆっくりと遅い設定にピペットガンを設定し、および/または非常に少ない、まだ一貫性を適用し、トリガ圧2を混ぜないように注意しながら、密度勾配の上に希釈した血液30〜35ミリリットル層。
    注：希釈血液を添加しながら、50ミリリットルの円錐形の端にピペットの先端を配置するには、一貫性のある安定した流れを確保するのに役立ちます。
  5. ブレーキと20℃で30分間、400×gで遠心分離がオフになっています。
  6. 以下の単核細胞層を乱さないように注意しながら、血漿および血小板が含まれている上層を、削除します。
  7. 滅菌ピペットを用いて、単核細胞層（軟膜）を収集し、別々の滅菌50mlコニカルチューブに配置します。
  8. 50ミリリットルの体積に細胞懸濁液にPBSを追加します。ブレーキと20℃で10分間、400×gで遠心分離します。
  9. 上清を除去し、10mlのPBSでペレット化した細胞を再懸濁します。細胞を計数し、血球計または自動細胞カウンターを用いて生存率を測定。
  10. さらなる処理のための直前まで、10 7細胞/ mlで、氷上での場所で細胞を再懸濁し。

細胞の2染色

  1. 該当する場合は、必要に応じて各蛍光補正/ FMOの制御のために1〜2×10 6個の細胞を除去します。ブレーキと4℃で10分間、400×gで細胞の遠心分離余り。
  2. 3-6×10 7細胞/ mlで滅菌濾過し、冷FACS緩衝液（PBS + 1％ウシ血清アルブミン（BSA）+ 0.01％アジ化ナトリウム）中で再懸濁細胞を（1.5 ml遠心チューブに取り除きます）。 FACS緩衝液が冷えていることを確認し、染色手順を通じて氷上に保管してください。
    1. アッセイを最適化する際に四分の（AD）への細胞集団を分割します。濃縮/染色の特異性を決定するために、関心、使用画分BとCの抗原特異的B細胞を濃縮するために、画分Aを使用して、抗原特異的細胞の頻度および数を決定するために、使用画分D（2.5以下2.6を参照のこと）利回りの計算を可能にし、折り畳み式濃縮をする未濃縮集団。
  3. 人間のFcγR遮断再追加Fc受容体に対する抗体の結合を防ぐために、氷の上での分画のADへの薬剤。
    注：適切な条件については、製造元の指示に従ってください。
  4. クロスする蛍光色素を含まないように注意しながら、暗所で氷上で30分間の分画のADへの関心の細胞表面抗原に対する蛍光標識抗体を加えるには、磁性ナノ粒子に結合した抗遠赤蛍光色素抗体と反応します。
    注：これらは、近赤外蛍光色素、Cy5を、Cy5.5標識、及びCy7のに抗体複合体が含まれます。追加された生存能力の汚れは固定液の使用に適合するものでなければなりません。一つELISPOTによって、例えば、FACSを用いて細胞を分析したが、抗体分泌周波数を決定することを意図していない場合は、抗体を用いた表面染色は不要です。
  5. アッセイの特異性を試験氷上で30分間、未標識の抗原の十分な量の画分Bをインキュベートし、その結果の親和性を有する受容体の大部分は、少なくとも10 -6 Mはブロックされます。
    注：一般的に、良い出発濃度（ 例えば 50〜100μM）を下回る2.6で十分とみなされる抗原の量の50から100倍過剰です。これは、このように濃縮された細胞の特異性の確認を可能にする、以下のステップ2.6で添加されるビオチン化抗原に結合する非標識抗原に対して高い親和性を有する任意のB細胞を阻止すべきです。このステップは、ステップ上記2.4と組み合わせて完成させることができます。
  6. 30分間氷上で画分A、B、およびDインキュベートにビオチン化抗原を追加します。
    注：ビオチン化抗原の濃度は、適切な検出および非特異的バイスタンダー細胞から結合細胞の分離を確実にするために必要とされる最適量を決定するために滴定されるべきです。典型的には、テストに良い出発濃度は1〜5μMです。
    注：画分AとDの場合、このステップは、ステップ上記2.4と同時に行うことができます。画分Bの場合は、このステップはbetwのステップ2.5（洗浄後に行われるべきですEENステップ）が不要です。
  7. そのようなストレプトアビジン遠赤蛍光色素や磁性ビーズなどのプロトコルで他の試薬へのB細胞の結合を決定するために、画分Cからのビオチン化抗原を省略します。
  8. 4℃で5分間、400×gでの冷FACSの5×10 7個の細胞当たりのバッファと遠心分離の1ミリリットル中に細胞懸濁液により細胞を2回洗浄します。
  9. 最終洗浄後、5×10 7個の細胞当たり1ミリリットルの2％ホルムアルデヒド中で濃縮された細胞懸濁液を希釈し、5分間氷上で暗所に放置します。
    注：この時点で細胞の固定は、ビオチン化抗原は、手順の残りのためのBCRに結合したままであることが保証されます。生細胞について - 下流の分析のために、このようなELISPOTSまたは養子の転送のように、固定工程を省略します。
  10. 4℃で5分間、400×gで二回コールドFACSの5×10 7個の細胞当たりのバッファと遠心機の1ミリリットルで細胞を洗浄。 1ミリリットル中に再懸濁し、5×10あたりの冷FACS緩衝液7細胞。
  11. 1-2μgのストレプトアビジン - 遠赤蛍光色素/ mlの追加、暗所で20分間氷上でインキュベートします。各アプリケーションのためのストレプトアビジンの量を滴定します。
  12. 4℃で5分間、400×gで1ミリリットルの冷FACSの5×10 7個の細胞当たりのバッファと遠心で細胞を2回洗浄します。それは、磁気ビーズを使用して濃縮を受けないように、画分Dの調製は、この時点で終了します。
    注：このサンプルは、サンプル中の抗原特異的B細胞の頻度および数を決定するために使用されます。これは、濃縮することにより達成-濃縮を倍収量を決定するために使用されます。

3.磁性ナノ粒子ベースの濃縮

  1. 5×10 7個の細胞当たりの冷分離緩衝液の1ミリリットル（PBS + 0.5％BSA + 2mMのEDTA）中のサンプルACからの細胞を再懸濁し、カラムを詰まらせる可能性の塊を除去するために40μmのフィルターを通過します。
  2. アンチのCy5 /アンチ遠赤蛍光色素ナノ粒子を追加します。フォー最適な結果をR、ナノ粒子の濃度は、それぞれの使用のために滴定されるべきであるが、良好な出発点は、5×10 7細胞/ ml当たり50μlの懸濁液です。 10分間、4℃で暗所に回転させます。
  3. 4℃で5分間、400×gでで1 mlの冷分離緩衝液で2回洗浄します。 5×10 7個の細胞当たりの冷分離緩衝液1ml中の細胞を再懸濁し。

LSまたはLDカラムを用い4.磁気濃縮

  1. 磁気分離器の磁場中で3 LSまたはLD列を配置し、列を濡らす分離緩衝液の3ミリリットルを追加（列の型が最適であるかを決定するには製品の説明を参照してください）。すべての3ミリリットルがカラムを通過し、収集した後に破棄できるようにします。
    注：磁性ナノ粒子の分離標識された細胞は、市販されている磁気分離装置のいずれかを使用して達成することができるが、実験室ではTEに、LSカラムを用いて、最も成功を収めています濃縮の収率、純度、および効率のrms。
  2. 列の下、マイナスに選択したセルのために標識3 15ミリリットルコニカルチューブ「画分A /（B）/（C）負」を配置します。それぞれの列に磁性粒子標識細胞を追加し、ボリューム全体を通過させます。
  3. 上に冷たい分離バッファーの3ミリリットルを追加し、これはカラムを通過し、2ミリリットルで繰り返すことができます。負の選択された細胞を収集し、氷上に取っておきます。
  4. 磁場から列を削除し、積極的に選択したセルのための「画分A /（B）/（C）正」は、標識された15ミリリットルコニカルチューブの上に置きます。
  5. 約6ミリリットル分離緩衝液ので先頭に列を記入し、すぐに提供するプランジャーを用いた磁気フィールドにバインドした細胞を収集するために、カラムを介してこのボリュームを急落。
  6. 純度を高めるために、積極的に選択された細胞は、さらにproceを繰り返し、第二の清浄なカラムを用いて濃縮することができますdure。
  7. 4℃で10分間、400×gで負及び正に選択された画分の両方を回転し、所望の最終容積に懸濁します。このようなFACS、ELISPOTまたは養子移入として、下流の分析を進めてください。

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結果

純度、収量の分析、および倍富化フローサイトメトリーを用いて、

必然的に、ストレプトアビジン遠赤蛍光色素を結合しなかったが、マトリックス中に捕捉されている混入細胞が含まれている上記のように濃縮された集団。これらの不純物は、FACSソーティングにより濃縮された集団から除去することができます。濃縮された集団の純度を推定するために、生細胞にゲートが前方および側方散乱に基づいて、および/または生/死染色と遠赤蛍光染料+細胞頻度を分析します。この後者のゲート内の割合は、純度の指標です。これらの細胞の特異性および抗原親和性のさらなる分析は、発現された免疫グロブリン遺伝子および組換え抗体産生および分析のクローニングおよび配列決定に続いて、単一細胞のFACSソーティングを必要とします。

収量は、単離されたantigeの数を指し出発集団（画分D）における数に...

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ディスカッション

ここでは、ヒト末梢血由来の抗原結合性B細胞の単離および濃縮を達成する新規な方法を記載します。この方法は、マウスに、そのような脾臓およびリンパ節など他の組織に容易に適用可能であり、細胞表現型および機能（原稿準備中）の後濃縮分析と互換性があります。

ユーザーは、この手順の成功に影響を与えることができる変数の数を認識すべきです。経験から死んだ細胞は、非特異的バックグラウンドの増加につながる、磁気ビーズに付着し、そのようなストレプトアビジン遠赤蛍光色素などの蛍光色素を、「取る」する傾向があります。この手順を開始する前に、可能なサンプルから、などの多くの死細胞を除去することが重要です。分析からゲートアウト死細胞の生/死の判別を可能に汚れの使用が役に立つかもしれないが、死んだ細胞の存在は、細胞頻度を分泌する抗体のアッセイの解釈を損なう可能性があり、および養子移入次の関数。

また、我々は、追加されたビオチン化抗原の注意深い滴定は、抗原特異的および非特異的結合を区別するために不可欠であることを見出しました。あまりにも多くの抗原が偽陽性検出/濃...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、JDRF(1-2008-994, 27-2012-450)および国立衛生研究所(R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, F30OD021477)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
対象抗原変数100 μgは容易にビオチン化すること。タンパク質を使用する場合は、ELISAによって検証されたタンパク質を使用してみてください。キャリア プロテインフリー。
例えば EZ link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335ビオチンは、さまざまな長さのスペーサーを含むものなど、さまざまな配合で入手可能であるため、使用されるタイプは研究者によって決定されるべき
Streptavidin-Alexa Fluor 647InvitrogenS21374他の供給者から入手できる。
反Cy5/反Alexaの蛍光細胞647のMicrobeadsMiltenyiのバイオテクノロジー130-091-395
LSコラムMiltenyiのバイオテクノロジー130-042-401
MACSの手動分離器Miltenyiのバイオテクノロジーの可変
的なホルムアルデヒドPBSと2%に薄めなさい; 下流の試金
カルシウムおよびマグネシウムなしで生きた細胞PBSを必要とする場合任意
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
ヘパリン処理された収集チューブ
FACS緩衝液(PBS + 1% BSA + 0.01%アジ化ナトリウム)
分離緩衝液(PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA)
50 mlコニカルチューブ
15 mlコニカルチューブ
1.5 ml エッペンドルフチューブ
表面マーカー反応性抗体、Fc Block、生/死識別染色、必要に応じて
ELISPOT供給
少なくとも である がの全血

参考文献

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