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方法論記事

サイトカイン形質導入ストローマ細胞株注入による患者由来異種移植片における外因性サイトカインの発現

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DOI:

10.3791/55384

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2017年5月10日

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1Department of Pathology and Human Anatomy, Loma Linda University, 2Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 3Department of Medicine, Loma Linda University

この記事について

サマリー

ここで、サイトカイン形質導入間質細胞株の毎週腹腔内注射による患者由来異種移植（PDX）マウスにおける外因性サイトカインの産生方法を記載する。この方法は、PDXの有用性を広げ、多数のPDXモデルにおける一過性または持続性外因性サイトカイン送達の選択肢を提供する。

要約

患者由来の異種移植片（PDX）マウスは、ヒト細胞を免疫不全マウスに移植することによって産生される。これらのモデルは、正常および悪性の造血のメカニズムを研究するための重要なツールであり、多くの悪性腫瘍の有効な化学療法を特定するためのゴールドスタンダードです。多くのマウスサイトカインもまたヒト細胞に作用するので、PDXモデルが可能である。しかし、これは、ヒト細胞の正常および悪性造血を研究するために重要な多くを含む、すべてのサイトカインの場合ではない。ヒトサイトカイン（トランスジェニックモデルおよびノックインモデル）を産生するようにマウスを操作する技術は、モデルの有用性が証明されるまでにかなりの経費を必要とする。他の技術は、労働集約的（組換えサイトカインまたはレンチウイルスの注射）であり、場合によっては、高度な技術的専門知識（DNAの流体力学的注射）を必要とする。このレポートは、外因性のヒトcyを有するPDXマウスを生成するための簡単な方法を記載しているこのサイトカインを過剰発現するように形質導入された間質の週1回の腹腔内注射を介して 、トキソプラズマ（TSLP、胸腺間質リンパ球ポエチン）この方法の使用はマウスの循環ヒトサイトカインの生理学的レベルを達成する連続サイトカイン産生のインビボ供給源を提供する。ヒトサイトカインの血漿レベルは、注入された間質細胞の数に基づいて変化させることができ、サイトカイン産生を実験の任意の時点で開始することができる。この方法はまた、同様に産生されるが、対照ベクターで形質導入された間質の腹腔内注射によって、サイトカイン陰性対照マウスを含む。我々は以前に、対照PDXと比較してTSLPを発現するPDXから採取した白血病細胞が元の患者のサンプルよりも遺伝子発現パターンを示すことを実証した。一緒に、この方法によって生成されたサイトカイン産生およびサイトカイン陰性PDXマウスは、我々が正常に使用したモデル系を提供する正常および悪性造血におけるTSLPの役割。

概要

患者由来異種移植片（PDX）は、「ネイティブ」哺乳動物環境において正常および悪性の造血細胞の産生を研究するための強力なin vivoモデルである。ほとんどの場合、PDXはヒトの細胞を免疫不全マウスに注入または移植することによって産生される。正常なヒト造血幹細胞を用いたPDXの産生は、正常なヒト血液および免疫細胞発生のインビボ研究を可能にする 。白血病または他の癌細胞から産生されたPDXは、発癌機構を研究し、ヒト集団に存在する遺伝的景観および突然変異の範囲に関連して有効な治療法を同定することを可能にする。結果として、PDXは、効果的な治療法を特定するための翻訳生物医学研究の現在のゴールドスタンダードであり、癌進行のメカニズムを理解するための重要なツールです。 PDXモデルは、特定の要因による健康格差の病気の研究を支援するための不可欠なツールです遺伝的病変、または患者の遺伝的景観の変化が発癌および治療結果に実質的に寄与し得る任意の疾患を含む。

多くのマウスサイトカインはマウスの中にある間にヒト細胞のサイトカイン受容体を活性化する際にヒト類似体を適切に模倣するので、マウス - ヒトPDXモデルが可能である。例えば、インターロイキン-7（IL-7）は、ヒトB細胞発生のための重要なシグナルを提供する。 2この場合、マウスIL-7は、マウスサイトカインがヒトB細胞前駆体のシグナル伝達経路を刺激するという、ヒトIL-7と十分な相同性を有する。 IL-3、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、幹細胞因子（SCF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の中でも特に、 、マウスおよびヒトサイトカインが低い相同性を示す場合、マウスサイトカインは、ヒト細胞上のそれぞれの受容体を活性化しない。この障害を克服するために、いくつかの戦略が使用されているPDXマウスにおけるヒトサイトカインの発現をエンジニアリングするために、組換えヒトサイトカインの注射、DNAの流体力学的注入、レンチウイルスの発現、トランスジェニック発現およびノックイン遺伝子の置換が含まれる。サイトカイン送達（ 図1 ）。

本明細書に示す方法において、PDXマウスは、ヒトサイトカイン、TSLPを発現するように、またはサイトカイン陰性対照として機能するように操作される。 TSLPを発現するPDXは、高レベルのヒトTSLPを発現するように形質導入された間質細胞の毎週腹腔内注射によって達成される。サイトカイン陰性PDX「対照」マウスも同様に操作される;対照間質は対照ベクターで形質導入される。この方法は、TSLP +間質を注射されたPDXマウスにおいてヒトTSLPの正常な生理学的レベルを達成する。サイトカイン陰性間質を受けるPDXマウスでは、検出可能なTSLPは観察されない。私たちは、ヒトの間質細胞株HS-27Aを培養で強く増殖し、共培養で単離した前駆細胞の増殖を支持しない非常に低いレベルのサイトカイン産生を示すので、本発明者らの研究に選択した。ヒトTSLP発現のために、間質には、先に説明した骨格9由来の先進的な自己不活性化レンチウイルスベクターを形質導入し、トランスジーン発現を増加させるためのcPPT / ctsエレメントおよびウッドチャック肝炎後転写調節エレメント（WPRE）を含む。ヒトTSLP遺伝子を伸長因子-1の制御下でこのベクターに構築した（EF-1）アルファプロモーターを使用して、強力な、構成的な、および長期の発現を達成する。

このヒト - サイトカイン増強PDXモデルの工学は、4つの主要なステップからなる。第1に、形質導入された間質をインビトロで拡大し 、安定した高レベルのサイトカイン産生のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって評価する。第二に、形質導入された間質細胞によって産生されたヒトサイトカインの活性（および対照間質からのサイトカイン活性の欠如）は、リン - フローサイトメトリーを用いて検証される。目的のサイトカイン（この例では、TSLP）に応答することが知られている細胞株を間質細胞上清と共にインキュベートし、サイトカイン誘導リン酸化についてアッセイする。第3に、形質導入されたヒト間質をマウスに注射し、次いで、マウス血漿をELISAによってヒトサイトカインのレベルについて毎週評価する。第4に、ヒト造血細胞を移植し、ヒトサイトカインのインビボでの機能的効果を、既知の標的（例えば、 例えば。細胞集団）。

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図1：マウスの外因性ヒトサイトカインを産生するように設計されたPDXモデル。 （ 1A ）設計実験および形質導入ヒト間質細胞の取得（ 1B ）ヒト細胞（造血幹細胞、白血病細胞など ）を入手してPDX（患者由来異種移植片）マウスを作製する。 （ 2A ）操作された間質を注入し、（ 2B ）ヒト細胞を実験スケジュールに従って免疫不全マウスに移植する。 （ 3A-B ）ストロマ上清およびマウス血漿中のサイトカイン濃度をELISAでモニターする。 （ 4 ）ヒト細胞を採取し、PDX中に存在するヒトサイトカインのin vivo機能的効果を評価する。 ここをクリックしてくださいこの図のより大きなバージョンを表示します。

間質細胞を介するヒトサイトカインの送達は、PDXマウスにおいてヒトサイトカインを送達/産生する他の方法と比較した場合、長所と短所の両方を提供する。ストローマ媒介性送達は、組換えヒトサイトカインの注射と比較して、一般に安価であり（間質細胞培養のコストは組換えサイトカインのコストよりも低い）、労働集約性はより低い（1週間に1回の注射と週に複数回の注射）。間質は外因性サイトカインを絶え間なく産生するので、短いサイトカイン半減期の問題も緩和される。 DNAの流体力学的注入によるサイトカインの送達は、間質を介する送達よりも安価であり得る。しかし、それは同様に一過性であり、間質媒介性送達に必要とされる単純な週1回の腹腔内注射よりも多くの技術的能力を必要とすることがある。マウスにおけるレンチウイルス遺伝子発現は、サイトカイン送達の新しい方法;しかし、私たちの手で生理学的TSLPレベルは達成されなかった。さらに、この方法は労働集約的であり、レンチウイルスベクターの連続生産を必要とする。トランスジェニックまたはノックインマウスは、サイトカインの安定した長期発現を提供し、組織特異的発現のために操作することができ、これは利点となり得る。他方、PDXマウスに必要な免疫不全マウスのバックグラウンド上のヒトサイトカイン遺伝子のトランスジェニック発現は、モデルの価値が確立される前に、膨大なリソースの投資を必要とする。さらに、トランスジェニックモデルは、一般に、サイトカイン開始のタイミングまたはインビボサイトカイン産生のレベルを変化させる選択肢を許容しない。これらは、間質細胞注入の開始時期または注入された間質細胞の用量を単に変化させることによって、間質媒介性送達によって達成することができる。

間質細胞媒介サイトカイン送達法本明細書中に詳述されたものは、正常なヒトB細胞発生4,6および高リスクB細胞急性リンパ芽球性白血病におけるTSLPの役割を評価するためのPDXを開発するために使用された。この方法は、TSLP以外のヒトサイトカインで類似のモデルを作製する際に使用するための代替サイトカイン送達方法を提供する。このモデルはまた、サイトカイントランスジェニックまたはサイトカインノックインPDXモデルの価値が相当な時間と費用を投資する価値があるかどうかを判断するのに役立つ予備的データを生成するのに有用であり得る。

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プロトコル

研究は、ローマリンダ大学の施設内動物管理および使用委員会（IACUC）および施設審査委員会（IRB）承認プロトコルに従って、すべての連邦ガイドラインに従って実施した。

注意：PDXおよびヒトの組織は、血液媒介病原体の伝播を防ぐために安全手順に従って取り扱う必要があります。

1.サイトカイン形質導入ストロマ細胞の培養と増殖

注：間質を継代するたびに、培養上清（1mLアリコート）を採取し、ELISAアッセイを介してサイトカインレベルの将来の定量化のために-80℃で保存する。

  1. 材料の表に記載されているように、R10培地と凍結培地を調製する。
  2. 10,11を生成するか、対照間質（空ベクターで形質導入）およびサイトカイン産生（TSLP +）間質を得る。使用するまで液体窒素（LN 2 ）で保存する12記載のようにストロマ細胞を解凍し、別のT-25細胞培養フラスコ中のR10培地5 mLにプレートする。37℃、5％ CO 2。これは解凍後「通過＃1」である。
  3. ストロマがコンフルエントになると（24〜48時間）、1×トリプシンEDTA（0.25％）を用いてトリプシン処理し、T-150培養フラスコに再プレーティングすることによって細胞を通過させる。これは解凍後の「継ぎ目＃2」です。
  4. ストローマがT-150フラスコ（3〜4日後）でコンフルエントになる場合、トリプシン処理により細胞を通過させる。この細胞懸濁液を実験的ニーズに使用する。
    1. 複数のフラスコへの細胞の拡大
      1. 収穫した細胞を3つのT-150フラスコに分け、コンフルエントになるまで培養する。ストロマ展開が必要な場合は、この手順を繰り返します。 T-150フラスコ中のコンフルエンスでの典型的なヒト間質（HS-27A）細胞数は約5×10 6である。
    2. セルストレージ
      1. 収穫した細胞懸濁液を円錐管に移し、500xgで5分間遠心分離し、上清を傾瀉し、凍結培地で細胞を再懸濁する。凍結し、バイアルあたりLN 2〜1.5×10 6個の細胞に保存する。
    3. マウスへの腹腔内ストロマ注射については、ステップ4.1に進む。

2.形質導入された間質からのインビトロサイトカイン産生をモニターするためのELISAアッセイ

  1. 関心のあるサイトカインを検出するために、市販のELISAアッセイキットを購入する。
  2. 早期、中期および後期継代時に収穫された対照およびサイトカイン産生（TSLP +）間質からの間質細胞上清を解凍する（ 図2 ）。
  3. 上清サンプル中のTSLP濃度を、ELISAキットを用いて製造者の指示に従って決定する。 13これらの連続データを編集し、細胞培養中のサイトカイン産生の安定性をモニターする e（ 図2A-B ）。
    1. サイトカイン産生の間質の減少または準最適なサイトカイン発現だけでなく、保存中の任意の対応するバイアルを同定し、廃棄する（ 図2A-B ）。
    2. 安定した高レベルのサイトカイン濃度を示すサイトカイン産生ストローマを同定し、維持する。これらの解凍を実験に使用します。
  4. 安定したサイトカイン産生を確実にするため、または間質の場合はサイトカイン産生がないことを確実にするために、ELISAキットを使用して、細胞培養期間中、間欠的にストローマをモニターする（初期、中期および後期の解凍後の継代中に少なくとも1回） 。

間質によって産生されるサイトカインの活性を評価するためのホスホフローサイトメトリーアッセイ

注：個々の実験の間質生成サイトカインの関連する生物活性を確認するために、最初の実験の前に操作された間質からの上清を評価する。設計された間質が確認されたら、新しいベクターで生産された間質が導入されていない限り、さらなる試験は必要ではない。

  1. 適切な下流のリン酸化ターゲットを検出するために、MUTZ5および/またはMHH-CALL4白血病細胞株（TSLP反応性）、 14組換えヒトサイトカイン、およびリン酸化フローサイトメトリーアッセイでの使用が承認された抗体を購入する。
  2. 対照およびサイトカイン発現間質から上清を回収した。
  3. 96ウェル組織培養プレート中の0.2×10 6細胞/ウェルの濃度でR20培地（材料の表参照）中の白血病細胞株をプレートする。条件ごとに3つのウェルをプレートし、3回アッセイを可能にする。 37℃で2時間インキュベートする。この時間は、以前の培養条件の間に起こった任意のリン酸化の喪失を可能にする。
    注：細胞株あたり12ウェルは、ステップ3.4に示される各実験条件について3回のアッセイを提供する。
    4. <培養2時間後、各ウェルの細胞を4mLチューブに分注し、500xgで5分間、4℃で遠心分離します。上清を傾瀉する。
    1. 1）陰性対照培地のみ、2）飽和濃度での組換えサイトカインを含む陽性対照培地（15ngでTSLP）（以下の実験条件の各々について200μLで細胞を再懸濁する： / mL など ）、3）対照間質からのストローマ上清のコントロール、および4）サイトカイン産生間質由来のサイトカイン - ストローマ上清。
  4. 特異的な市販のリン酸化アッセイ（ 例えば 、TSLPに応答してMUTZ5またはMHH-CALL4中のリン酸化STAT5については30分）で指定された時間、細胞をインキュベートする。
  5. 4℃で5分間500 xgで遠心分離し、上清を傾瀉する。
  6. 製造業者のプロトコールに従ってリン酸化フローサイトメトリー染色を行い、フローサイトメトリーデータを収集する。 15
  7. フローサイトメトリーデータを解析します。 15
    1. フォワード（FSC、細胞サイズを示す）およびサイド（SSC、細胞細分性を示す）光散乱に基づいて無傷細胞上のゲート。
    2. 各サンプルのインタクトな細胞の中央蛍光強度（MFI）を決定する。ストローマ細胞上清の三重値から得られた平均MFIと、陽性および陰性の培地対照のそれとを比較する。

サイトカイン形質導入された間質のマウスへの注射

注：健康な細胞と適切なサイトカイン産生を確実にするためにマウスに注射する前に、最低3回の解凍後の継代でHS-27A間質を培養する。

  1. 間質の調製
    1. 収穫した間質細胞懸濁液を円錐管に移し、血球計数を10μLとする。トリパンブルーを用いて生細胞数を得る。 16残りの細胞を遠心分離する500×gで5分間、懸濁させる。
    2. ペレット化細胞から上清を吸引し、マウス注射のために必要な量の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に細胞を静かに再懸濁する（注射するマウスの数に依存する）。
      注：マウス注射のための典型的な間質細胞濃度：200μLのPBS中、マウスあたり0.5×10 6〜5×10 6細胞。
    3. 間質細胞懸濁液を注射直前まで4°C（または氷上）に保ちます。細胞懸濁液は、少なくとも室温（RT）（〜25℃）でマウス注射用であることを確認してください。
  2. 間質細胞注入
    1. 生物安全フードを消毒し、注射用の材料を組み立て、マウスケージを内側に置きます。
    2. ツベルクリン注射器に200μLを集める前に、細胞懸濁液を静かに混合する。
    3. 標準的な腹腔内注射技術を用いて、 17マウスを拘束し、200μLの細胞懸濁液を腹膜腔に投与する。詳細は以前にMachholz et al。 18

5.マウスにおける外因性ヒトサイトカインの連続採取と血漿モニタリング

  1. テール・スニップによる血液収集
    1. バイオセーフティフードを消毒し、手順のためにマウスの拘束具、はさみ、および他の道具/消耗品を集める。
    2. マウスを拘束具に置き、マウスの動きを最小限に抑えるためにチューブを固定します。
    3. 尾および外科用はさみをイソプロピルアルコールで消毒する。尾に局所麻酔クリームを塗布する。
    4. 非常に鋭い外科用ハサミを使用すると、マウスの尾の先端の約0.5〜1mmを切断する。ヘパリン処理された毛細血管を使用して約80μLの末梢血を収集する。
      注：この方法で血液が採取される場合、6回以上mes、tail除去は、削除されたtailの量に関して控えめでなければなりません。尻尾が上がるにつれて直径が大きくなり、出血が早くなり、治癒に時間がかかります。
  2. 血漿分離
    1. バルブシリンジを使用して（キャピラリーチューブから血液を排出するために）標識されたK 2 EDTAマイクロテナーチューブに血液を移す。凝固を防ぐために20回転倒させる。
      注：通常、テールニップからの血液凝固は速い。しかし、出血が〜2分以上持続する場合、凝固を助けるためにスタティックペンシル/パウダーを使用する。
    2. 製造者の指示に従って血液採取管を遠心分離し、ELISAアッセイの準備が整うまで保存用の血漿（-20℃）を分注する。
    3. マウス - ヒト細胞キメラデータがマウス血液から必要とされる場合、ステップ6.3.1に記載されているように残りのペレットを処理する。そうでなければ、血球ペレットを捨てる。
  3. ミクロ容積に対する改変ELISAマウス血漿のume
    注：メーカーのELISA手順をマウスから採取したマイクロボリュームを収容するために推奨される100μLサンプル量から40μL容量に変更しました。これらの限られた容量では、インビボマウス血漿サンプルを三重に操作することは不可能である。実験の終了時に、500μLの死後の血液を心臓穿刺により採取する。 100μLの安楽死血漿中で評価されたサイトカイン濃度を用いて、各マウスの40μL のin vivoデータを検証する。
    1. 凍結マウス血漿サンプルを解凍する。
    2. 連続的にELISA標準液を希釈し、1ウェルあたり40μLで3回プレートする。
    3. 各マウス血漿サンプル40μLをELISAプレートに加える。
      注：マウスサンプルが40μL未満の場合は、ELISAバッファーで最大40μLにしてください。この希釈液の量を記録し、希釈した各試料の希釈係数を計算するために使用します。いつELISAデータを分析することにより、希釈サンプル濃度にサンプルの希釈率を乗じて、元のサンプル中の実際のサイトカイン濃度を決定する。
    4. 製造者の指示に従って完全なELISAアッセイ。

6.造血細胞のマウスへの移植

  1. 移植のために骨髄を治癒するための致死的照射
    注：Loma Linda University（LLU）はCobalt-60放射源を使用しています。動物は、20×20cmの野で放射線源から80cm、拘束具の上に0.5cmのLexan層を置いたパイ拘束具に置く。最新の較正線源（この線源については現在2〜3分）に基づいて225cGy線量を達成するように曝露時間が計算される。
    1. 致死量以下のマウスに照射する（免疫欠損マウスでは最大225cGyの全身照射線量）。
    2. 24時間後に造血細胞を移植する。/ em>静脈内尾静脈注射。
  2. 静脈内造血細胞移植
    1. CD34 +造血幹細胞（HSC）：マウス1匹あたり1×10 5〜5×10 5個の細胞および白血病細胞株/患者サンプル：1×10 6〜1×10 6個のマウスの滅菌PBS200μLの容量で移植用ヒト細胞懸濁液を調製する。 1マウスあたり5×10 6個の細胞。
    2. 移植直前まで細胞を4°C（氷上輸送）に保つ。細胞が移植前に少なくともRTであることを確認する。
    3. 生物安全フードを消毒し、移植注射用のフードエリアを準備します。
    4. 尾静脈の拡張を可能にするために、少なくとも5分間、加温ケージにマウスを置く。
    5. 静かに細胞懸濁液を混合し、200μLをツベルクリン注射器に入れる。ニードルを無菌のままにしておき、安全に針を脇に置いてください。
    6. マウスを拘束具に置き、イソプロピルアルコールで尾を消毒する
    7. 標準的な静脈注射技術を用いて、ヒトの細胞懸濁液をマウスの尾静脈に注入する。
      注：尾静脈注射は、特に初心者の動物ハンドラーの場合、いくつかの試みが必要です。 KovacscicsとRaperのJoVEビデオ19は、この動物技術の詳細なデモンストレーションを提供します。
    8. マウスの回復を約5分間モニターする。注射中に有害事象があれば記録する（ 例えば、こぼれた細胞、重大な出血、過剰な尾の外傷）。
  3. マウス末梢血におけるヒト細胞キメラの解析
    1. 血漿分離（ステップ5.2.3）の後、マイクロテナーチューブに残っている血球ペレットを得る。
    2. 赤血球（RBC）溶解のために、残った血液ペレットを、血漿が除去された（血漿量を置換する）のと等しい量のPBSに再懸濁し、よく混合する（ボルテックス/ピペット）。
    3. それぞれの再懸濁した血液サンプルを標識した4mLチューブに移す。各チューブにRBC溶解バッファーを1：9の比で加えます（再懸濁した血液100μLのRBC溶解バッファー900μL）。 RTで5分間インキュベートする。遠心分離機（5分間、500×g）およびデカント。
    4. 2回目のRBC溶解バッファーインキュベーションを行います（室温で5分間）。以前と同じように遠心分離機にかけてください。
    5. 約1mLのPBS中の残りの細胞を洗浄する。以前と同じように遠心分離機にかけてください。
    6. ペレットを、標準的なフローサイトメトリー染色に適したPBSの容量に再懸濁する（これは、製造業者および個々のラボプロトコールに従って異なる）。 20マウス細胞（マウスCD45 +）およびヒト細胞（ヒトCD45 +）を同定するために、フローサイトメトリー用に検証された免疫表現型検査用抗体を使用する6,21 関心対象の細胞系統に特異的な追加のヒト白血球マーカーを含む。
      注： "プールされたサンプル"を作成するには、各マウスサンプルから少量（5μL〜20μL）を取ることをお勧めします;無染色、生存率、およびアイソタイプコントロールサンプルに使用します。それぞれの実験条件に対して染色されていないアイソタイプコントロールを持つことがベストプラクティスです。

インビボサイトカイン活性の機能評価

  1. マウス安楽死および組織収穫
    1. 所定の実験時点でCO 2窒息によりマウスを安楽死させる。
    2. 心臓穿刺によって血液を採取し、ステップ5.2.1〜5.2.2のように血漿を採取する。
      注：他の組織の前に血液を採取するのは、死亡直後に凝固を開始するためです。
    3. ステップ5.2.2のように、マウス血液、アリコートおよび貯蔵血漿を処理する。
      1. 後で、安楽死時に得られた血漿中の外因性サイトカイン濃度を ELISAにより製造業者のプロトコールに従って評価する。 インビボでのマウス血漿中の外因性サイトカイン濃度を評価して比較する血液採取および安楽死の血漿サンプル（セクション5.3に記載）。
    4. 残りの血液サンプルにPBSを加えて、血漿量を置き換え、ステップ6.3.1および6.3.2に記載されているように処理する。直ちにフローサイトメトリーアッセイを実施するか、またはLN 2保存のために凍結培地に細胞を再懸濁する。
  2. PDXマウスから骨髄（BM）および脾臓を採取し、前述のように単細胞懸濁液を調製する。 22
  3. 1：1の希釈でメチレンブルー（溶解細胞膜およびRBCは生存細胞の無傷の核を残す）を有する3％酢酸を用い、血球計数器を用いて細胞を計数することにより、各PDXマウス組織サンプルの細胞数を得る。各動物の骨髄および脾臓サンプルの総細胞数を表にする。
  4. 細胞懸濁液（500xg、15分）を遠心分離し、上清をデカントする。直ちに骨髄細胞および/または脾臓細胞のフローサイトメトリーアッセイを実施するか、LN細胞の凍結培地に再懸濁する。サブ2ストレージ。
    注：10個のBMアリコート（将来の生化学アッセイ用）および〜5個の脾臓アリコート（将来のPDX移植用）をマウス1匹につき固定する。
  5. インビボにおける機能的効果を同定するための免疫表現型解析
    1. 目的のサイトカインに応答する免疫表現型造血集団およびアイソタイプ対照抗体の第2のMM（ 図5および表の表）に対するフローサイトメトリー抗体の1つのマスターミックス（MM）を調製する。
    2. ステップ7.4で調製したPDX組織アリコート（37℃ビーズバス）を解凍する。
    3. 解凍された細胞をコニカルチューブに移し、少なくとも3倍量のPBSを加えることにより洗浄する。遠心分離（500×g、5分）し、上清を傾瀉する。
    4. 洗浄工程（7.5.3）を繰り返します。
    5. 無染色対照、生存率コントロール、およびアイソタイプ対照について、各PDXサンプルから約10μL〜20μLの細胞を採取することによりプールされたアリコートを作成する（6.4.6節参照）。あなた以外のすべてのサンプルを染色する固定可能な生存能力のある色素（死細胞マーカー）でインキュベートし、メーカーのプロトコールに従って洗浄する。
    6. 標準的なフローサイトメトリー染色プロトコールに従って、各PDX細胞サンプルを表現型決定MMで染色する。アイソタイプ-MMでプールされたアイソタイプ対照サンプルを同様に染色する。すべてのサンプルをインキュベートし、PBSで洗浄し、1％パラホルムアルデヒドで再懸濁してサンプルを固定する。
    7. フローサイトメトリーデータを収集し、目的の細胞集団に適したゲーティング戦略を用いてデータを分析する（ 図5 ）。典型的なゲーティングは次のとおりです。
      1. 破片を除くFSCおよびSSCゲートを描くことによって、無傷の細胞を定義する。
      2. 死細胞マーカー（これは「全生存細胞」）に対して陰性である細胞をゲーティングすることによって、生存細胞集団を同定する。
      3. 「全生存細胞」内のサブゲートを使用して、所望の免疫表現型を有する細胞ポピュレーションを定義する（図5参照）。
      4. 取得するフローサイトメトリー分析からの全生存細胞数内のサブセット細胞集団の頻度。 6,21
    8. 全生細胞（ステップ7.5.6.4で得られたもの）内のB細胞サブセットの頻度に、ステップ7.3で得られた組織あたりの生存細胞総数（％B細胞サブセットx "）を掛けて、各組織における標的細胞の数を計算する。血球計数細胞数」; 表1参照）
    9. 対照PDXマウスとサイトカイン発現（TSLP +）PDXマウスとの間の標的細胞集団の細胞数を比較して、外因性ヒトサイトカインのin vivo機能的効果を決定する（ 表1 ）。

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結果

モデルの概要を図1に示します。サイトカイン産生（TSLP +間質）およびコントロールストロマが得られたら、それらを培養で増殖させる。マウスにストローマを注入する前に、間質細胞上清をELISAで評価してサイトカイン産生を確認し（ 図2 ）、ホスホフローサイトメトリー（Protocol＃3）を用いて間質によって産生されるサイトカインの活性を確認する。細胞を継代すると、コンフルエント間質細胞培養物（対照支質およびTSLP +間質）から上清が収集される。 ELISAを用いて、初期、中期および後期継代の間に少なくとも1回、上清中のTSLPの濃度をモニターする。対照間質由来の代表的なデータを図2Aに示す 。 TSLPの発現を示すストローマ細胞培養物（およびそれらから冷凍されたバイアル）は廃棄する必要があります。検出されないTSLPを有する対照培養物は、将来の使用のために拡大および凍結される。図2Bに示すように、低レベルのTSLP産生を示すTSLP +...

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ディスカッション

この原稿は、外因性ヒトサイトカインを発現するようにPDXを工学するための、単純で、迅速で、比較的費用対効果の高い方法を記載している。ここに記載されている戦略は、ヒトサイトカインであるTSLPを発現するように形質導入されたストローマ細胞株の毎週腹腔内注射に基づく。本明細書に記載の方法を実施する前に、高レベルの目的のサイトカイン（TSLP）を発現するように操作されたストローマおよび同様に操作された対照間質が生成された。ここに提示されるプロトコールでは、間質を培養中で増殖させ、経時的に（または対照間質の場合にはサイトカイン産生がない場合）安定した高レベルのサイトカイン産生を提供する能力についてスクリーニングする。ストローマ生成サイトカインの活性を検証するためのアッセイを実施し、生理的ヒトTSLP（およびヒトTSLPを欠く対照マウス）を用いてPDXを産生するために間質細胞注入の実験的タイムラインを開発した。ヒトTSLPの血漿レベルをモニターするための手順およびサイトカイン応答性細胞集団に対するインビボでのその機能的効果を確認するための実験を行った。

ここに提示されたプロト...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、NIH R21CA162259、NIH R01CA209829、NIH P20 MD006988、NIH 2R25 GM060507、Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant、ロマリンダ大学医学部の病理学・人体解剖学部門、基礎科学部、健康格差・分子医学センター、およびロマリンダ大学(KJP)からの共同研究とトランスレーショナル研究を促進するための助成金によって支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウェットラボ用試薬 
T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, 7 mL 容量,  25cm² 培養エリアThermo Scientific / Fisher156367
T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, 250 mL capacity, 75 cm² 培養エリア & ベントキャップCorning Inc. / Fisher353136
T-150 Falcon Tissue Culture処理フラスコ、容量600 mL、150 cm²カルチャーエリア&ベントキャップCorning Inc. / Fisher355001
10 mL 血清ピペットFalcon357551
15 mL  ポリプロピレン円錐形チューブFisher05-539-12
5 mL 丸底ポリスチレンチューブFalcon352054
50 mL ポリプロピレン円錐形チューブFalcon352098
2.0 mL 極低温バイアル, おねじCorning Inc. / Fisher4230659
1 mL ピペットチップFisher2707509
200 μLピペットチップ デンビルサイエンティフィックP3020-CPS
10 μLピペットチップデンビルサイエンティフィックP-1096-CP
滅菌使い捨てフィルターユニット、SFCAメンブレン、Nalgene Rapid-FlowFisher09-740-28D
2 NH2SO4 バイオレジェンド423001
ダルベッコ」カリシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、1回。コーニング セルグロ/ Mediatech21-031-CV
Human TSLP ELISA Max Deluxe SetBioLegend434204
3% 酢酸 with メチレンブルーStemcell Technologies7060
トリパンブルー コーニング25-900-CL
「トリプシン」 1x 0.25% トリプシン 2.21 mM EDTA HBSSThermoFisher25-053
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP-7949
」R10インチ細胞培養培地、全容量の% (565 mL) (565 mL) -->Lab Recipe
RPMI, 88.5% (500 mL) メディアテック10-040-CV  
FBS、9.9%(56 mL) Mediatech35-011-CV
L-グルタミン、0.99% (5.6 mL) Mediatech25-005-CL
ペニシリン-ストレプトマイシン、0.50% (2.8 mL) Mediatech30-002-Cl
2-メルカプトエタノール、0.10% (560 µL) MP190242
<ストロング>」R20インチ細胞培養培地、全容量の割合(195 mL)--Lab Recipe
    RPMI、76.84%(150  mL)上記参照
    FBS、20.49%(40 mL)上記参照
    2mM L-グルタミン、1.02%(2 mL)上記参照
    1 mM Naピルビン酸、1.02%(2 mL)上記参照
    ペニシリン-ストレプトマイシン、 0.51%(1 mL)上記参照
    2-メルカプトエタノール、0.10% (0.1 M)、 0.10%(200 µL)上記参照
"凍結媒体」、「総体積の割合--Lab Recipe
"R10インチ中、45%「R10」レシピ-
FBSを参照、20%上記35-011-CV
DMSOを参照、10%Corning25-950-CQC
D(-)(+)-トレハロース二水和物、5%フィッシャーサイエンティフィックBP2687-100
名前CompanyCatolog番号コメント
Biologics 
"HS-27" HS-27A ヒト間質株ATCCCRL-2496
"CALL-4" MHH-CALL-4 細胞株、ヒト B 細胞前駆体白血病DSMZACC 337
"NSGマウス」頷く。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ、男性または女性、6歳 –8週間JAXマウス #005557
MUTZ-5細胞株、ヒトB細胞前駆体白血病DSMZACC 490
換えヒトTSLPタンパク質R&D Systems1398-TS-010
名前会社Catolog番号コメント
Flow cytomery antibodies (clone)*
Anti-mouse CD45 FITC (30F11)Miltenyi Biotec130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (別名はIL-7Rα)ミルテニーバイオテック130-098-094
CD34 APC(8G12)BDバイオサイエンス340667
CD45 PE-Cy7 (ハイ30)eBioscience25-0459
"FVD" 固定生存率色素  eFluor 780 eBioscience65-0865
Ig κ軽鎖FITC (G20-193)BD Pharmingen555791
Ig & lambda; light chain FITC (JDC-12)BD Pharmingen561379
IgD PE (IA6-2)BioLegend348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)BD Biosciences551079
pSTAT5 PE,  マウス抗STAT5 (pY694)BD PhosphoFlow612567
Name会社Catolog番号コメント
その他の資料&機器 
Canula Trovan付き動物用埋め込み型ナノトランスポンダー ID-100B(1.25)
EMLAリドカイン麻酔クリーム(動物飼育施設を通じて処方することにより取得)処方患
BD½ cc LO-DOSE U-100インスリン注射器28G½ BD#329461
BDマイクロテーナーチューブ K2EDTABD #365974
遠心分離機ベックマン・コールターアレグラ X-15R 
FisherBrand毛細管(ヘパリン化)Fisher Scientific22-260-950
血球計算盤Fisher02-671-6
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
Mouse Pie CageBraintree Scientific, Inc.MPC-1
マウステールイルミネーター レストレインブレインツリーサイエンティフィック社MTI STD
ピストルグリップインプランタートロバン IM-300(1.25)
&マイクロ;クォンツ バイオテック・インスツルメンツ株式会社MQX200
FlowJo フローサイトメトリー解析ソフトウェアFlowJo, LLCVersion 10
*特に記載のない限り、すべての抗体は抗ヒトです。
組罹

参考文献

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