Aβの絶対定量 1-42 CSFに質量分析リファレンス測定手順を使用して

Summary

固相抽出と液体クロマトグラフィータンデム質量分析に基づくヒトCSF中の_Aβ1-42の絶対定量のための参照測定手順が説明されています。

Abstract

アルツハイマー病(AD)は、高齢者の間で最も一般的な神経変性疾患であり、認知症の全症例の60-80%を占めています。現在、ADの診断は認知テストや精神状態検査がベースとなっていますが、脳脊髄液(CSF)中のペプチドであるアミロイドベータ(Aβ)は、臨床試験や臨床現場での利用が増えています。ほとんどのタンパク質およびペプチドバイオマーカーと同様に、定量は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの抗体ベースの技術を使用して行われます。しかし、これらのアッセイの検査室内および検査室間のばらつきは、臨床ルーチンにおける診断マーカーとしての使用を妨げています。

固相抽出(SPE)と液体クロマトグラフィー(LC)タンデム質量分析(MS/MS)に基づいて、抗体に依存しない参照測定法(RMP)が開発されました。そこでは、安定した同位体標識Aβペプチドを内部標準として使用し、絶対定量を可能にしました。測定には、高分解能四重極/Orbitrapハイブリッド装置を使用しました。この分析法により、CSF Aβ_1-42 を 150-4,000 pg/mL で定量できます。

Introduction

アルツハイマー病（AD）は、認知症の最も一般的な形態であり、全世界で約35万人^1に影響^を与え^ます 。広くADの病因の中心に位置するように考えられて疾患の神経病理学的特徴は、過リン酸化タウ蛋白質²の細胞内神経原線維変化および凝集したアミロイドβ（Aβ）ペプチド³からなる細胞外斑です。これに伴い、バイオマーカーによって、in vivoでのプラーク病変の評価は最近、AD ⁴のための研究診断基準に含まれています。 _Aβ1-42のCSF測定のために、いくつかのイムノアッセイが利用可能であり、多くの臨床検査室⁵で使用されています。 CSF中の_Aβ1-42の濃度は、BRでのプラーク中のペプチドの沈着を反映し、認知正常な高齢者に比べてAD患者では約50％低くなっていますAIN ^6、7。

これらのバイオマーカーは、主に免疫アッセイ（ すなわち、抗体ベースの技術）を用いて....

Protocol

注：このプロトコルは、出発物質として、各Aβペプチドのために50μg/ mLの濃度で、少なくとも50μLのアリコートを必要とします。 Aβペプチドは、脱イオン水中の20％アセトニトリル（ACN）、4％濃アンモニア溶液（V / V）に溶解し、80℃で保存されるべきです。

注意：安全情報については、 表1を参照してください。

ソリューションの調製

1. 脱イオン水中でACN、濃縮アンモニアの4mLの（〜25％）の20 mLで希釈し、脱イオン水中の20％ACN、4％濃アンモニア溶液（v / v）を100mLのを準備します。脱イオン水で100mLへの最終的な音量を調整します。新鮮な毎日を行います。
2. 50 mLの最終容量まで脱イオン水にグアニジン塩酸塩の26.08グラムを溶解することにより、5 Mグアニジン塩酸50mLのを準備します。 20℃で保存し、新鮮な毎月を作ります。
3. 脱イオン水中の4％リン酸（V / 200mLのを準備v）で脱イオン水中に濃リン酸（〜85％）の9.4 mLで希釈し。脱イオン水で200ミリリットルの最終容量を調整します。冷蔵庫に保管し、新鮮毎週行います。
4. 脱イオン水中でACN 37.5 mL及び濃アンモニア5mLの（〜25％）を希釈して、脱イオン水中で75％ACNおよび10％....

Results

図1のプレート設定は、サンプルの完全版のために使用されます。少数の未知の試料を分析する場合は、第二校正器、RF、およびQCセットは未知サンプルの前半の後に配置する必要があります。

図2に見られるように、校正器は、低い標準偏差を用いて、回帰直線に近いです。この方法は、150 pg / mlで4,000 pg / mlでの定量化の上位レベルの定量化のより低いレベルを有します。キャリブレーションの残余の標準偏差は、もちろん、可能な限り低くあるべきです。キャリブレーションが非線形である場合、ランは、（重症度に応じて）破棄されるべきであり、偏差が不正確なピペット操作技術および/またはキャリブレーターの希釈でのエラーによる可能性が最も高いです。複製の変動係数（CV）は20％以下、好ましくは10％未満であるべきです。

ペ.......

Discussion

記載された方法のために、代わりに代理母材を使用して、我々は、ヒトCSF中にキャリブレーションを可能にする、代用分析物アプローチ^{13、14、15、16を}用います。サロゲートの検体のアプローチは、二つの異なる同位体標識された規格を必要とします。別の_{^{（13CAβ142）}を}内部標準として使用され、一方の_{^{（15NAβ142）}は} 、ヒトCSF中の較正曲線を生成するために使用されます。未知の内因性_Aβ142の濃度は、その後、較正曲線から推定されている計算された_{^Aβ13分の142}内在性_CAβ142比で_{^15NAβ13分の142CAβ142}の比.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Protein LoBind微量遠心チューブ、0.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind微量遠心チューブ、1.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind微量遠心チューブ、2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind微量遠心チューブ、5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0.75 mL ポリプロピレンチューブ、V-bottom	Micronic	MPW32071BC3	チューブ SPE溶出液の収集に使用されますが、96ウェルプレートなどの他の収集デバイスも使用できます。
Micronic スプリット TPE Capcluster for 96 in. tubes	Micronic	MP53026	Caps for Micronic tubes.
Micronic Loborack-96ホワイトwハイカバーバーコード	Micronicチューブ用Micronic	MPW51015BC3	ホルダー。
Biohit Optifitチップ 1.2 mL	ザルトリウス	791210	LoBindディープウェルプレート(96ウェル)の底まで到達するために使用します。他の細い先端もうまくいくかもしれません。
ウォーターズオアシスMCX 96ウェル&マイクロ;溶出プレート	ウォーターズ	186001830BA
ウォーターズプレートマニホールドリザーバートレイ	オ
抽出プレートマニホールド	ウォーターズ	186001831
水酸化アンモニウム溶液、puriss。ISO、リーグ。Ph. Eur., ~25% NH3 basis	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
アセトニトリル, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
オルトリン酸 85%, ACS,ISO,Reag.Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
グアニジン塩酸塩、500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive ハイブリッド四重極 Orbitrap 質量分析計	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	Dionex Ultimate 3000 LC & オートサンプラーのバンドル付き。
Dionex ProSwift RP-4H モノリスカラム (1.0 x 250mm)	Dionex	066640
ウシ血清アルブミン、凍結乾燥粉末、(分子生物学用)、非アセチル化	Sigma-Aldrich	B6917
ベータアミロイド (1-42)、ウルトラピュア、TFA	rPeptide	A-1002-2
15N ベータアミロイド (1-42)、均一に標識	rPeptide	A-1102-2
13C β-アミロイド (1-42)、均一に標識	rPeptide	A-1106-2
マイクロプレートシェーカー、TiMix 2	Edmund Bü	ラー6110 000