プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

サマリー

ここでは、我々は簡単に、低コストを提供し、時間効率のよいプロトコルは、化学的に透過型電子顕微鏡のための免疫組織化学を事前に埋め込むと互換性のある長期保存を可能に、アクロレイン固定液と霊長類の脳組織を修正します。

要約

光学顕微鏡レベルでのすべての技術の進歩にもかかわらず、電子顕微鏡は、シナプスの連絡先などの神経細胞の超微細構造および形態学的な詳細を検討し、特徴づけるための神経科学における唯一のツールのまま。電子顕微鏡のための脳組織の良好な保存が厳しい低温定着方法によって得ることができるが、これらの技術は、かなり高価であると同定された神経系の接続性を理解することが重要である免疫標識の使用を制限します。凍結置換法は、免疫標識とクライオ固定の組み合わせを可能にするために開発されています。しかし、これらの方法論的アプローチの再現性は、通常は高価な凍結デバイスに依存しています。また、この技術の信頼性の高い結果を達成することは非常に時間がかかり、スキル困難です。したがって、特にアクロレイン固定伝統的な化学的に固定された脳は、電子を結合する時間効率および低コストの方法のままで免疫組織化学と顕微鏡。ここでは、霊長類の脳組織の維持につながり、プレ埋め込み免疫組織化学および透過型電子顕微鏡検査と互換性のある化学アクロレイン固定を使用して信頼性の高い実験プロトコルを提供します。

概要

共焦点及び二光子顕微鏡を含む光学顕微鏡は、他のものの^1、2のうち、 インビボ神経プロセスで研究するための効率的なツールであることが証明されました。光学顕微鏡（LM）レベルでの典型的な空間分解能は約200nmであるが、このような極紫外線および軟X線顕微鏡などの異なる光源を用いた最近の技術の進歩は、特に、約10 nmの空間分解能³にこの解像度を増加しています^、4、5。イメージングにおける他の技術的進歩は、組織学と組み合わせた磁気共鳴画像を含み、 インビボでミエリン鞘の厚さを測定するための新規な方法、唯一の電子顕微鏡（EM）レベル^6,7に伝統的に測定可能であったパラメータを提供します。 AlthouGH LMレベルでのこれらの進歩は、シナプス接触の生体プロセス、構造の詳細図および特性を研究するための優れたツールを提供し、わずか0.5ナノメートルに達することができ、解像度を提供EM、を用いて達成することができます。しかし、EMレベルでの観察は、細胞構築を維持するために、化学固定剤と脱水プロセスと、いくつかの方法で死んで、変更する標本が必要です。従って、高解像度で生体試料を検査することは、放射電子ビームによる損傷、低コントラスト、膜の構造偏差、又は^{8、9、10を}埋め込む以下脱水及びエポキシ起こり得るアーチファクトのも存在に挑戦することができます。

構造解析のために彼らの本来の形で標本を保存する「クライオビトリファイドセクションのEM」またはCEMOVIS、切片化アプローチを用いることによって達成することができます急速凍結及び硝子体氷で試料を埋め込み、極低温^11、12にEM下のセクションを調べることを含みます。彼らはまだ固体と完全に水和している間、この手順は、このように脱水工程¹³に起因するアーチファクトを除去する、試料の検査を可能にします。しかし、この方法では、重要な追加コストを発生させる非常に低い温度でこの観察を可能にするために、凍結超薄切片のための追加の装置と同様に、標準のEMに関する追加のデバイスを必要とします。また、CEMOVISアプローチは、抗体は、通常、室温でインキュベートしなければならないため、技術を免疫標識の使用を妨げます。また、凍結固定した標本をゆっくりと凍結防止化学薬品に浸しながら解凍し、目されている、その間、凍結置換法を使用して免疫組織化学的方法で超微細構造解析を組み合わせることが可能ですエンなどLowicrylsなどの特殊な樹脂に包埋しました。ポスト埋め込み免疫標識は、その後、材料¹²上で実行することができます。しかし、凍結置換とクライオ固定技術は時間がかかります。彼らは、追加の装置の設置を必要とし、依然として低温^14,15の使用にもかかわらず、有機溶媒および細胞構築を変更することができる化学固定液に露出されるようにサンプルを必要とします。したがって、特にアクロレインとLMとEMレベル、脳組織の化学的固定、の両方ですべての技術的進歩にもかかわらず、EM ¹⁶で免疫組織化学を結合する低コストおよび時間効率的な方法のままです。

過去数十年間で、多くの試みが最高の組織保存を提供アルデヒドの混合物を見つけるために行われました。 1960年代の前に、EMのために許容可能な結果を​​与えただけで化学固定液は、四酸化オスミウムました。しかし、四酸化オスミウムは、脳のような臓器を修正するために血管系を通してその使用を排除し、毒性の高い、高価です。アクロレインは、細胞構造¹⁷のEM観察に適した動物組織の保存のための信頼性の高い方法として、1950年代後半に導入されました。これは、より深く組織を貫通し、浸漬によって固定のために使用され、組織¹⁷の最小の収縮と細胞質成分の良好な保存を可能にする他のアルデヒドよりも速く反応します。そのような酵素および他のタンパク質¹⁸の生体分子化合物のより正確な局在化を可能にすることにより、新鮮な組織で使用される場合、このような特徴は、アクロレイン固定を他のアルデヒドを超える明確な利点を与えます。確かに、それは効率的stabiliとして、両生類及びげっ歯類を含む多くの種でEMレベルで可視化のための固定の、簡単で効率的かつ低コストの方法として、年間を通じて検証されていますZESペプチドおよびタンパク質は、抗原性を保持し、他のアルデヒド固定剤^{16、18、19、20、21}と組み合わせて使用される場合、比較的無傷の超微細構造を提供します。げっ歯類におけるアクロレイン固定用プロトコルは、それ以来EM ^16、22二重免疫標識を実施するために、特にPickel基によって、広範囲に標準化に使用されてきました。いくつかのグループは、ヒト以外の霊長類の脳組織²³にアクロレイン固定を使用していました。しかし、我々の知る限り、効率的にEMが^24を免疫標識と互換性のある非ヒト霊長類におけるアクロレインとの化学的固定を記述する一つだけ発表されたプロトコルがあります。

この記事では、我々は、効率的、化学的に非ハムを修正するための簡単で信頼性の高い方法を提供します免疫標識および送信EM検査を事前に埋め込むとともに、潜在的に長期保存を可能にアクロレインと霊長類の脳、。

プロトコル

倫理文：動物を含むすべてのプロトコルは、Comitéデ保護デAnimauxドゥ大学ラバルによって承認されたと実験動物の管理と使用（エド2。）への動物管理者ガイドのカナダの協議会に合わせて行われました。ここで説明するプロトコルは、約800グラムの成体動物のために最適化しました。固定液の量は、動物の大きさに応じて調整する必要があります。

経心臓灌流用の溶液の調製

1. 以下の手順に従って、50mMのリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（PBS）溶液の1リットル調製。灌流前に、ほとんどの24時間で溶液を準備し、使用するまで4℃で維持します。
   1. 1Lのビーカー中で蒸留水800mLを測定します。二塩基性無水リン酸ナトリウムの5.87グラムを追加し（Na ₂ HPO _4）、一塩基一水和物リン酸ナトリウム1.20gの（のNaH ₂ PO _{4・H 2} O）、および9グラム塩化ナトリウム（NaCl）での。溶解するように攪拌します。
   2. 徐々に5NのNaOHを添加することによりpHを7.4に調整します。 1 L.の総量に到達するために蒸留水を追加します。
      注意：NaOHを腐食性の化学化合物です。適切な個人保護具を着用（PPE;実験室コート、手袋、保護眼鏡など ）。
2. 以下の手順に従って、4％パラホルムアルデヒド（PFA）の2リットルを調製。このソリューションは、手術の前に、ほとんどの24時間で調製し、使用するまで4℃で保存する必要があります。
   1. 2リットルのビーカーに蒸留水1.5 Lを測定します。二塩基性無水リン酸ナトリウム23.48グラム（のNa ₂ HPO _4）、一塩基一水和物リン酸ナトリウムの4.80グラム追加（のNaH ₂ PO _{4・H 2} O）。溶解するように攪拌します。 2 L.の総量に到達するために蒸留水を追加します。
   2. 55°C - 温度が約45に達するまで排気フードの下で溶液を加熱します。 60°C以上に加熱しないでください。
   3. 徐々に溶液にPFAの80グラムを追加し、完全に溶解するまで撹拌する（約30から60分）。 60℃以下に保つために、温度を監視してください。
      注意：PFAは、その粉末状の揮発性が高いです。これは、目や皮膚に接触した場合に非常に有毒であり、吸入または経口摂取の場合に危険です。 PPEを着用し、換気フードの下、注意して使用します。
   4. 4°Cとフィルターにソリューションをクールダウン。 4°Cで保存。
3. 以下の手順に従って0.1 Mリン酸緩衝液（PB）中の3％のアクロレインの1 Lを準備します。 PB溶液を灌流前に、ほとんどの24時間で調製しなければなりません。
   注意：アクロレインを吸入すると非常に有毒であるとすぐに損傷を生成することができます。皮膚から吸収された場合、それはまた、腐食性及び毒性が高いです。これは、発がん性物質や変異原性です。適切なPPEを着用し、換気フードの下に使用します。
   1. 蒸留水800mLを測定します。二塩基性無水リン酸ナトリウムの8.66グラムを追加し（Na ₂ HPO _4）、一塩基一水和物リン酸ナトリウム（のNaH ₂ PO _{4・H 2} O）の5.38グラム。全ての塩が溶解するまで攪拌します。 4℃で溶液をキープ1 L.の総量に到達するために蒸留水を追加します。
   2. 手術前に、1Lのガラス容器にPB液900mLのを転送し、排気フード下で97％のアクロレイン溶液30.94 mLを加え。 1 Lと攪拌の総量に到達するためにPBのソリューションを追加します。溶液を濾過し、4℃で保管してください。

2.経心臓灌流し、脳の解剖

1. 全体の外科的処置の間、氷の上で解決策をしてください。使用された最初の溶液中にチューブを配置することによって、ポンプを準備し（PBS; 50mMの）と全く空気がホース内に残っていないまでにポンプをオン。マカクザルの経心臓灌流のために、21 G針を使用し、約80 mL /分の流出を設定します。
2. ミックスの筋肉内注射で動物を麻酔ケタミンのトゥーレた（20mg / kg）を、キシラジン（4mg / kg）、およびアセプロマジン（0.5ミリグラム/キログラム）。イソフルラン（3％）鎮静下に動物を維持します。
3. 通気表に、動物の手足を取り付けます。
4. メスで、脇の下に皮膚を取り除きます。腹部の筋肉をカット。慎重に重要な臓器を避けて横方向にリブをカットする大型外科はさみを使用してください。
5. 手術用ハサミで横隔膜をカットし、心臓を露出させ胸郭を上げます。ダイヤフラムが切断されると、心臓が数分以内に暴行を停止しますので、、、速やかに進行。
6. メスの刃と心膜を取り外し、左心室に針を挿入します。メスで、慎重に右心房に小さな切除を行います。迅速に72 mL /分でポンプを起動し、所定の位置に針を保持します。可能であれば、心より低いレベルにその頭を持つために動物を傾けます。
   注：針を挿入するときに心室中隔を貫通しないように注意してください。
   1. Rins肺までPBSの約300mlで電子血が白であり、何の血液が右心房から出てきません。
7. ポンプを停止し、すぐに3％アクロレイン溶液にホース/チューブを転送し、再びポンプを起動します。心臓が鼓動を停止した後、徐々に80 mL /分に排気速度を増加させます。アクロレイン溶液の約500mLのを灌流。
8. すぐに、ポンプを停止し、4％PFA溶液にホースを転送し、再びポンプを起動します。このステップでは、PFAの約1リットルが必要です。
   注：前肢が硬く、首が硬いときに固定が完了しています。
9. 頭をカットし、慎重に頭蓋骨の外に脳を解剖。手術器具で脳に損傷を与えないように注意してください。脳が淡い（血液の痕跡）と剛性（ 図1A）である場合、灌流が最適です。
10. 4℃で1時間、4％PFAで無傷の脳を浸します。
11. 連続冷却ビブラトーム（4°C）で脳を切断と厚さ50μmの切片に、所望の平面内にPBS（0.1 M）（ 図1B）でそれらを集めます。
    注：このステップは、所望のプロトコルに応じて多くの方法で行うことができます。半球を切断ビブラトーム前分離、又は全部を維持することができます。脳はビブラトームプラットフォームに対して大きすぎる場合、それは小さなブロックに切断することができます。このステップの後、切片を40％PB（50ミリモル）、30％グリセロール、30％エチレングリコールからなる不凍液に-30℃で長期間保存することができます。

3.プレ埋め込み免疫組織化学（図1C）

1. 次のようにトリス緩衝生理食塩水（TBS、50mMの、pHが7.6）の4 Lストック溶液を調製します。
   1. 4リットルのビーカーに蒸留水2Lを測定し、トリヒドロキシメチルアミノメタンを24.23グラム追加（THAMを、C ₄ H ₁₁ NO _3）、および溶解するかき混ぜます。
   2. 1 N HClを約148 mLの7.6にpHを調整します。酸は、CAUTIを添加しなければなりません7.6未満のpHに到達しないようにします。総体積はなければならない4 L.
      注意：HClは非常に腐食性です。適切なPPEを着用してください。
2. EM免疫組織化学のために処理されるべき関心領域を含有する（ステップ2.11から）セクションを選択します。
3. 不凍液をリンスし、室温で5分間、PBS中の遊離浮遊切片3X（0.1M、pH7.4）で洗浄します。
4. PBSで希釈したのNaBH ₄の0.5％溶液を調製します。
   1. NaBH ₄を0.05gを秤量し、PBS 10mL中に希釈します。ふさがないでください。使用直前に、この溶液を調製します。
5. 室温で30分間、新たに調製したNaBH _4を溶液中で切片をインキュベートします。優しくロック。ふさがないでください。
6. RTで10分間PBSで洗浄3回、反応ガス残るのいずれまで激しく揺動。
7. 2％の適当な正常血清およびPBSで希釈した0.5％コールド魚ゼラチンとEMのためにブロッキング溶液を調製します。
   注：数量shoul以下の3つのステップのための十分なを持っているために計算さdは。二次抗体をホスティングしている同じ動物種から作られた血清を使用してください。これらの方法は大幅に組織の品質を損なうとして、（抗体の浸透を高めるために）抗原の検索方法やトリトンの少量の追加の使用は避けてください。
8. RTで1時間ブロッキング溶液中で切片をインキュベートします。優しくロック。
9. ブロッキング溶液で希釈した一次抗体溶液を準備します。
   注：一次抗体の濃度は、通常LM免疫組織化学の場合と同じであるが、いくつかの一次抗体は、アクロレインでは動作しない可能性があるため、予め異なる抗体濃度で試験を行うことを検討してください。 （ - 2％0.1）、4％PFA経心臓灌流のために、同様の結果を得ている場合、グルタルアルデヒドの混合物を使用することが可能です。同様インキュベーション時間と温度を最適化します。
10. 一次抗体溶液中のセクションをインキュベート一晩、室温で穏やかに揺らしながら。以前に試験インキュベーション時間および温度を使用してください。
11. 穏やかに揺らしながら室温で5分間PBSでセクション3回洗います。
12. ブロッキング溶液に希釈したビオチン化二次抗体1000溶液：1を準備します。
    注：二次抗体は、一次抗体を生成するために使用される宿主種に対して提起されなければなりません。
13. RTで1.5時間、二次抗体溶液中で切片をインキュベートします。優しくロック。
14. 少なくとも60分前に、二次抗体のインキュベーションの終わりに、アビジン - ビオチン - ペルオキシダーゼ（ABC）溶液を調製します。
    1. 溶液AとBの8.80μL/ mLで測定し、PBSでそれらを希釈するために較正されたピペットを使用しています。
    2. アビジンとビオチン分子間の結合を完全に許可するようにRTで少なくとも60分間穏やかに揺らし。
15. 二次抗体溶液中でインキュベーションした後、室温で10分間、PBSで3回洗浄します。
16. そうABCのセクションをインキュベートRTで1時間lution。優しくロック。
17. 穏やかに揺らしながら室温で10分間TBSで一回PBSで二回洗浄してください。
18. TBS中に希釈した0.005％H ₂ O ₂での0.05％の3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）の新鮮な溶液を調製します。
    1. DABの12.5ミリグラムを秤量し、冷たいTBS 25mLにそれを希釈します。光から保護します。
       注意：DAB粉末が吸入すると、揮発性の高いと有害です。これは、発がん性や催奇形性があります。したがって、妊娠中や授乳中の女性は、希釈した場合でも、本製品を操作することはできません。操作する際にN95マスクを使用し、PPEを着用してください。
    2. 溶液を濾過し、使用直前に30％H ₂ O ₂の4.5μLを追加します。
19. 室温で3~7分間DAB溶液中で切片をインキュベートします。優しくロック。
    注：褐色の沈殿物は、バックグラウンド染色の高レベルを避けるために、暗すぎてはなりません。インキュベーション時間はそれに応じて最適化する必要があります。
20. すばやく2回洗浄して反応を停止します冷たいTBSで、2回、室温で冷たいTBSで10分間、穏やかに揺らしながらPBで二回10分間、続い。
    注：PBの使用（としないPBS）は、オスミウム、フォーム結晶と反応するように、塩化ナトリウムの痕跡を除去するために重要です。

電子顕微鏡観察のための4 Osmificationと埋め込み

1. PBで希釈した1％四酸化オスミウム（のOsO _4）の溶液を調製します。光から保護します。
   注意：オスミウムは非常に毒性があり、皮膚に接触してはならない、目、口および吸入してはなりません。摂取した場合には死を引き起こす可能性があります。それだけで換気フードの下、適切なPPEして使用する必要があります。
2. （撹拌なし）通気フードの下RTで30分間のOsO ₄溶液のセクションをインキュベートし、光から保護するためにアルミホイルでそれらを覆います。完全に前のOsO ₄溶液を添加するセクションを平ら。
   注：セクションでは、非常に暗いと里になってGIDと、この工程の後に、注意して操作しなければなりません。
3. osmification中に撥水性エポキシ樹脂を準備します。
   1. 大きいプラスチックカップにエポキシ樹脂混合物（エポキシ樹脂20gを、硬化剤を20g、アクセル0.6gの可塑剤を0.4g）の各成分の適切な量を追加します。均質な褐色の色が得られるまで、木の棒またはプラスチックピペットで攪拌します。
      注：これは、各成分の正確な割合を使用することが重要です。
   2. 処理されるセクションの数に応じて、適切な大きさのアルミカップに等しい量を転送します。それは休息することを許可します。
4. osmificatedのセクションでは、低速揺り動かしながらRTで10分間PBで3倍洗います。
5. 2分毎に段階的エタノール以下の一連のセクションを脱水：35％エタノールで2回。 50、70、80、90、および95％エタノールで1回ずつ。および100％エタノールで3倍。
6. dehydratiを完了するために、ガラスバイアルにセクションを転送プロセス上のプロピレンオキシドで2分間、切片を3回インキュベートすることによって。
   注意：プロピレンオキシドは、高揮発性及び毒性の有機溶媒です。これは、接触した場合、あるいは吸入または摂取した場合、目や皮膚に重大な損傷を引き起こす可能性があります。これは、グレード2発がん性物質として分類されています。それだけで換気フードの下とPPEして使用する必要があります。それはまた、非常に可燃性であると離れて任意の熱源から保たれるべきです。
   注：プロピレンオキシドは、有機溶媒であり、プラスチックと互換性がないので、この工程の前に、切片を慎重に、ガラスバイアルで転送されるべきです。この時点で、セクションが非常に脆弱であり、注意して操作しなければなりません。セクションは、代替的に4.5の工程の前にガラスバイアルに移すことができます。
7. アルミカップに、丁寧に一つ一つのセクションを転送し、できるだけ多くの空気との接触を避けます。フラット埋め込む先に混合した撥水性エポキシ樹脂のセクションおよびventin下で一晩、それらをインキュベートRTでグラムフード。
   注：このステップでは、セクションでは、完全に脱水し、非常に脆弱であり、注意して操作しなければなりません。
8. 鉱物油を使用して、グリースプラスチックカバースリップとともにグリースでコーティングしたスライドガラスを準備します。
9. 最大で12〜15分間、60℃でアルミカップをインキュベートすることによって、樹脂を軟化。慎重にスライドガラスの油を塗った側のセクションを平ら。油を塗ったカバースリップを置き、慎重に残っている空気を押し出します。
10. 48時間60℃でスライドをインキュベートします。
    注：樹脂はあまりにもハードになるように、48時間のインキュベーション時間を超えないようにすることが重要です。
11. プラスチック製のカバースリップを削除します。

透過型電子顕微鏡を用いて超薄セクショニングと観察用の5試料調製

1. 関心のある領域を見つけるために、双眼鏡を使用し、メスで約1mm ²の小さな四角形の部分をカット。
2. 樹脂ブロックの先端ファイルとQUを接着その上adrangularピース（ 図1C）。接着剤は、前切片に少なくとも1時間または一晩乾燥させます。
3. ウルトラミクロトームを用いて、80μmの厚さの切片（ 図1D）に四角片を切断します。
   1. 垂直位置でウルトラミクロトームデッキに樹脂ブロックを配置し、鋭利なカミソリの刃を使用して、徐々に滑らかな側面を有する台形を形成するために、樹脂ブロックの各辺を切断します。
   2. 水平位置でデッキを入れ、台形の最も長い側が下向きにされるまで、ブロックを回転させます。
   3. 四角片の表面をトリミングするためのツールをトリミングダイヤモンドやガラスナイフを使用してください。ウルトラミクロトーム/秒1mmに300μmの厚さの切片をカットするように設定。垂直四角片に平行であり、約1°の非常に小さな水平角を表示することがナイフを調整します。
      注：この角度は、ユーザーが、組織に接近することを可能にするほぼBの表面に平行な免疫標識の要素が発見される可能性が高い場合には、ロックします。ダイアモンドトリミングツールを使用してこれらのパラメータを使用する場合、樹脂は、光沢のある白色を表示します。組織が切断された場合、それは紫や緑がかった色に変化します。
   4. 、厚さ80μmの切片をカットし、蒸留水で満たされたボートを備えた超45°ダイヤモンドナイフを使用してキシレンに先端紙を吸収する部分でそれらを通過することによってセクションを平滑化し、ホルムバール被覆ニッケルスロットグリッド上の連続切片を収集したり裸の150のメッシュ銅グリッド（ 図1E）。
4. グリッドストレージボックスにグリッドを配置します。
5. クエン酸鉛でグリッドを染色。
   1. 1濾過リードクエン酸ストック溶液の溶液、濾過、蒸留水：5mLの注射器と1を調製し、0.2μmのシリンジフィルタを使用。光から保護します。
      注：リードクエン酸の原液は固形deposの形成を避けるために、毎月新鮮なされるべきですその。在庫レシピの材料データシートを参照してください。グリッドの多くのシリーズが染色する必要がある場合、それは乳白色になったときに加えて、希釈液を変更します。
   2. 溶液と接触している部分で、希釈された溶液の液滴の上に各グリッドを置き。 3分間インキュベートします。
   3. グリッドを保持するために、小さなピンセットを使用して、徹底的に蒸留水を含む二つのビーカーにそれをすすぎます。
   4. 優しく吸収紙を使用して余分な水分を取り除きます。グリッドボックスにグリッドを保管してください。透過型電子顕微鏡（; 図1F TEM）によって切片を検査する前に30分待ちます。

結果

このセクションでは、我々は、化学的に3％のアクロレインの混合物、4％PFAで固定し免疫染色霊長類の脳組織の、送信EMレベルで、観察後に得られた代表的な結果を提示します。比較的無傷のミエリン鞘と二重膜（ 図2A）のニート可視化によって示されるように、我々は、超微細構造の良好な保存を達成しました。シナプス接点は、微小環境からニューロンの要素と共に、容易に（ 図2B）を同定することができます。ジアミノベンジジン（DAB）免疫沈降物で標識されたニューロンの要素は、それらの充填された細胞質または軸索原形質によってEMレベルで認識されます。原形質膜および細胞小器官の外側表面はまた、典型的には、電子密度の沈殿物（ 図3）で裏打ちされています。

この特定の実験では、抗体のAGAを使用しましたリスザルの淡蒼球の（GPE）、外部または内部（GPI）セグメント（

ディスカッション

この記事では、我々は、ヒト以外の霊長類の経心臓灌流およびEMのサンプル検査に適した事前埋め込み免疫組織化学のための信頼性の高いプロトコルを提示します。例えばCEMOVISような典型的なクライオEMは、脳の微細構造の良好な保存を提供するが、それはまた、免疫組織化学¹²の使用を制限します。クライオ置換およびTokuyaso技術を含む他の技術は、免疫組織化学を埋め込むポストできるように、これらの技術は、デュー・プロセス中に必要な追加のデバイスに高価であり、時間がかかり^{、12、14、15の}スキルに挑戦することができます。また、効率的に凍結固定法を使用するために、試料は（大気圧²⁹で²⁸と10μmの凍結高圧を使用する場合、厚さ200ミクロンまで）は比較的小さくなければなりません。理想的には、良い取得します霊長類の脳組織の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
二塩基性無水リン酸ナトリウム(Na2HPO4)	Fisher scientific	S374-500
一塩基性一水和物リン酸ナトリウム(NaH2PO4·H2O)	EM Science	SX0710-1
塩化ナトリウム (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1 N希釈。製品は腐食性です。適切な保護具を装着して使用してください。
NaOH	EMD	SX0590-1	5 N希釈。製品は腐食性です。適切な保護具を装着して使用してください。
パラホルムアルデヒド(PFA)	Sigma	P6148	4%希釈。製品は粉末状で揮発性が高く、毒性が強いです。適切な保護を備えた通気フードの下で注意して使用してください。
アクロレイン(90%)	シグマ	110221	3%希釈。製品は非常に有毒です。適切な保護を備えた通気フードの下で使用してください。
検死通気台	Mopec	CE400
電子灌流ポンプ	コールパーマー	masterflex L/S 7523-90
針(灌流)	terumo	NN-1838R	18 G 11/2
ニードル	テルモ	NN-2713R	21 G 1/2
ケタミン			20 mg/kg
キシラジン			4 mg/kg
アセプロマジン			0.5 mg/kg
刃	羽毛          ランス	201011          J9913	No.22 手術用 No.22 および No. 11 EM
手術用ハサミ
Rongeurs
	ライカ	VT 1200S	各使用前にブレードを校正し、デバイスが許可すると
ビブラトーム カミソリ刃	ジレット	GIN 642107
グリセロール	フィッシャー 科学	G33-4	30% 希釈
エチレングリコール	フィッシャーサイエンティフィック	E178-4	30% 希釈
化ホウ素ナトリウム (NaBH4)	シグマ	S-9125
正常馬血清 (NHS)	ジャクソン免疫研究所	008-000-121	2% 希釈
冷魚ゼラチン	オーリオン	900.033	0.5% 希釈。オリジナル製品は40%に濃縮されています
一次抗体、SERT	Santa Cruz biotechnology	SC-1458	1/500
一次抗体、ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25希釈一次
抗体、TH	ImmunoStar	22941	1/1,000希釈ビ
オチン化二次抗体、ヤギ	ベクターラボラトリーズ	BA-9500	1/1,000希釈
ビオチン化二次抗体、マウス	ベクター研究所	BA-2000	1/1,000 希釈
ベクタステインエリート ABCキット	ベクター研究所	PK6100	8.8 & マイクロ;L/mL の A と B をそれぞれ
3,3'-ジアミノベンジジン (DAB)	Sigma	D5637	0.05% 希釈。製品は粉末状で揮発性が高く、有毒です。流しにゴミを捨てないでください。
過酸化物 (H2O2) 30%	フィッシャーサイエンティフィック	H-323	0.005% 希釈
四酸化オスミウム (OsO4)	電子顕微鏡科学	2% 19152 4% 19150	元の溶液は 2% または 4% のいずれかです。最終的な1%の希釈を計算するためにどちらが使用されるかに注意してください。製品は光に非常に敏感です。オスミウムは非常に有毒です。適切な保護を備えた通気フードの下でのみ使用してください。
デュルクパン撥水エポキシ樹脂	シグマ	A:Mエポキシ樹脂(44611) B:硬化剤964(44612) C:促進剤960(DY060)(44613) D:可塑剤(44614)	58°で48時間重合します。廃棄物を捨てる前にC。
アルミウムカップ	電子顕微鏡科学	70048-01
エタノール	市販アルコール	1019C	蒸留水で適切な濃度で希釈
酸化プロピレン 電子	顕微鏡科学	20401	有機溶剤。揮発性が高く、毒性があります。通気フードの下で使用してください。
コーティングされていない媒体ガラススライド脳	研究所	3875-FR	鉱物油によるグリース表面
プラスチックフィルム (Aclar 埋め込みフィルム)	電子顕微鏡科学	50425-25	鉱物油によるグリース表面
ウルトラミクロトーム	ライカ UC7	EM UC7
ダイヤモンドトリミングツール (ウルトラトリム)	珪藻	UT 1081	ガラスナイフを代わりに
ウルトラ45°使用できます。ダイアトメー ダイアモンドナイフ	Diatome		ボート
イレン	ッシャー科学	X5SK-4
150メッシュ銅グリッド	電子顕微鏡科学	G150-cu
ボックス	電子顕微鏡科学	71138	最大100グリッドを保存できます
クエン酸ナトリウム	アナケミア	81983
硝酸鉛	シグマ	L-6258	1.33 でできたクエン酸鉛の原液を作ります。gの硝酸鉛と1.76 42 で希釈したクエン酸ナトリウムのg;mLの煮沸および冷却済みの蒸留水8 1のmL N NaOHは、硝酸鉛からクエン酸鉛への変換が完了した後に添加されます。pHは約12である必要があります。溶液を密閉プラスチックボトルに保管し、光から保護します。
シリンジ	テルモ	SS-05L	5 mL
シリンジフィルター	Corning	431222	0.2 µm
吸収紙(ビビュラスペーパー)	電子顕微鏡科学	70086-1
パラフィルム	実験用フィルム	PM-999
鉱物油	Sigma	M5904