Method Article

拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

DOI:

10.3791/55406

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May 1st, 2017

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1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

In This Article

Summary

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組み合わせ前駆同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）は、アイソバリックタグのサンプル多重化機能を強化し、定量プロテオミクス戦略です。このプロトコルは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの組織へのcPILOTの適用を説明しています。

Abstract

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病気の理解とバイオマーカー探索のために多くの生物学的サンプルを分析するための需要が高まっています。複数のサンプルの同時測定を可能に定量プロテオミクス戦略が普及し、大幅に実験的なコストと時間を削減しています。私たちの研究室では、伝統的な同位体ラベルまたはアイソバリックタグ付けアプローチのサンプル多重化を強化する同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）を組み合わせ、前駆体と呼ばれる技術を開発しました。グローバルcPILOTは、細胞、組織、体液、または生物全体に由来するサンプルに適用し、異なる試料条件を横切る相対タンパク質存在量に関する情報を提供することができます。 cPILOTは（ 材料/試薬の表を参照） を選択dimethylateペプチドのN末端に低pH緩衝液条件を使用し、2）市販のアイソバリック試薬とリジン残基の一級アミンを標識するために高pH緩衝液条件を使用して）1によって働きます。度利用可能なサンプルの多重化が使用される前駆体ラベルおよび同重体標識試薬の数に依存します。ここでは、1回の分析でのマウス組織からの12個のサンプルを分析するために六プレックスアイソバリック試薬と組み合わせ軽および重ジメチル化を使用して、12プレックス分析を提示します。強化多重化は、実験の時間とコストを削減し、より重要なことには、より少ない実験バイアスとエラーを有する多くのサンプル条件を横断比較（生物学的複製、病期、薬物治療、遺伝子型、又は長手方向時点）を可能にするために有用です。この作品では、グローバルcPILOTアプローチは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの生物学的複製を越え、脳、心臓、および肝臓組織を分析するために使用されます。グローバルcPILOTは、他の生物学的プロセスを研究するために適用され、20個の以上のサンプルにサンプル多重化を増大させるために適合させることができます。

Introduction

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プロテオミクスは、多くの場合、より良い疾患プロセスを理解するために使用される多くのサンプルを、酵素反応速度、翻訳後修飾、環境刺激に反応し、治療処置、バイオマーカーの発見、または薬物のメカニズムへの応答の分析を含みます。定量的な方法は、サンプルを横切るタンパク質レベルの相対的差異を測定するために使用することができ、ラベルフリーであるか、または同位体標識（代謝的、化学的、または酵素）を含むことができます。彼らは多くのサンプルを同時に分析することを可能にし、異なる細胞、組織、体液、または生物全体からのサンプルに適しているので、安定同位体標識法は、人気が成長しています。同位体標識法1、2、3、4、5、6、7増加実験スループット、取得時間、コスト、および実験誤差を低減します。これらの方法は、ペプチドピークからのタンパク質の相対存在量を測定するために、前駆体の質量スペクトルを使用します。対照的に、同重体標識試薬は....

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Protocol

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倫理文：マウスは、独立した非営利生物医学研究機関から購入し、ピッツバーグ大学の実験動物資源部門に収容しました。全ての動物プロトコルは、ピッツバーグ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

化学タギング1.タンパク質抽出およびペプチドの生成

  1. 組織、細胞、または体液からタンパク質を抽出します。
    1. 機械式ホモジナイザーを用いて8 M尿素（500μL）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）で組織の60〜90 mgの（ 例えば 、脳、心臓、および肝臓）を均質化します。必要であれば、プロテアーゼまたはホスファターゼ阻害剤を緩衝液に添加してもよいです。このプロジェクトでは、彼らが使用されませんでした。ホモジナイザーは、次のパラメータを使用する：行列Aビーズ、4メートル/秒、20秒を溶解します。心臓組織は、均質化の最大9サイクルが必要な場合があります。
      注：プロテアーゼまたはホスファターゼ阻害剤必要であれば、Sがバッファに追加されてもよいです。彼らは、この研究で使用されませんでした。
      1. 溶解チューブから組織ホモジネートを取り外し、マイクロ遠心チューブに移します。 8 M尿素を含むPBSの100-500μLで管を溶解リンスし、組織ホモジネートと共にリンス液を組み合わせます。
    2. ホモジナイズした組織を遠心分離（9447×....

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Results

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cPILOTは、N末端およびリジン残基のラベルペプチドを化学的にアミン系化学物質を使用し、サンプル多重化機能を強化します。 図2は、アルツハイマー病のマウスモデルおよび野生型対照からの脳、心臓、および肝臓組織の12プレックスcPILOT分析から得られた代表的なMSデータを示します。 表1に示されているように、アルツハイマー病および野生型マウスのための2つの生物学的反復は、この12-プレックス解析に含まれています。 図2Aは、ペプチドに組み込まれた単一ジメチル基を表す4 のm / z間隔によって分離されて二重荷電ピークのペアを示しています。光このペアの重ジメチル化ピークの両方は、独立して単離し、CIDと断片化されています。ジメチル化ペプチドのそれぞれのためのMS / MSデータは、 図2BおよびCに示されています。検索結果は、このパイを示していますピークのrがT（ジメチル）ELNYFAK.......

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Discussion

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cPILOTは12個の以上のユニークなサンプルの同時測定が可能になります。ペプチドの両方のN末端及びリジン残基で成功したタグを確保するためには、反応の各セットのための正しいpHを有し、かつ第一のペプチド標識のためのジメチル化反応を行うことが不可欠です。 N末端での選択的ジメチル化は、（±0.2）〜2.5でpHを有することによって行われます。これは、リジンおよびN末端にアミノ基のpKaのの違いを利用することによって達成されます。 pHが2.5で、リジンが非アクティブである（PKA〜10.5）。 pHが弱酸性である場合は、（ すなわち pHが5-7）、または基本的な、両方のN末端およびリジン残基がジメチル化されます。同重体標識は、低pHで最初に実行された場合に加えて、N末端は、等圧のラベルとリジン残基がジメチル化されなければなりません。これは、Bイオンを選択する必要があるようにMS 3のために選択される以下のフラグメントを生じ得ます。ジメチルの相対的なコストエーションの反応は、市販のアイソバリック試薬に比べて安価です。 1が100μgのあたり全体のアイソバリック試薬のバイアルを使用することができます.......

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Disclosures

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著者は何の競合する利害を持っていません。

Acknowledgements

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著者はRASRにピッツバーグ大学のスタート・アップ・ファンドおよびNIH、NIGMS R01の助成金（GM 117191から01）を認めます。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
水 - MS グレードフィッシャー サイエンティフィW6-44 L 量は必要ありません
アセトニトリル - MS グレードフィッシャー サイエンティフィックA955-44 L 量は必要ありません
酢酸J.T. ベイカー9508-01
水酸化アンモニウム溶液 (28 - 30%)シグマ アルドリッチ320145-500ML
ギ酸アンモニウムアクロス オーガニックス208-753-9
ギ酸フルカ アナリティカル94318-250ML-F
BCA タンパク質アッセイキットPierce Thermo Fisher Scientific23227
尿素バイオラッド161-0731
トリスバイオラッド161-0716
ジチオスレイオトール (DTT)フィッシャーサイエンティフィックBP172-5
ヨードアセトアミド (IAM)Acros Organics144-48-9
L-CysteineSigma Aldrich, Chemistry168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK) treated Trypsin from usvine pancreasSigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
ホルムアルデヒド (CH2O) 溶液; 36.5 - 38% in H2Sigma Aldrich, Life ScienceF8775-25ML
ホルムアルデヒド (13CD2O) 溶液; 20 wt % D<>sub2O 中、98 原子 % D、99 原子 % 13CSigma Aldrich、化学596388-1G
シアノ水素化ホウ素ナトリウム; 試薬グレード、95%Sigma Aldrich156159-10G
シアノホウ素添加ナトリウム; 96 原子 % D、 98% CPSigma Aldrich, Chemistry190020-1G
強陽イオン交換 (SCX) スピンチップ サンプル調製キットProtea BioSciencesSP-155-24kit
トリエチルアンモニウム重炭酸塩 (TEAB) バッファーSigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 反応 (1 x 0.8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
ヒドロキシルアミン塩酸塩Sigma Aldrich, Chemistry255580-100G
標準ボルテックスミキサーフィッシャーサイエンティフィ2215365どのミキサーでも使用可能
オアシスHLB 1cc(10mg)抽出カートリッジウォーターズ186000383これらはC18カートリッジです
Visiprep SPE真空マニホールド、DL(使い捨てライナー)、24ポートモデルシグマアルドリッチ5726512ポートモデルでも十分
Speed-vacThermo ScientificSPD1010どのブランドのスピードvacでも十分です
ウォーターバスチャンバーThermo Scientific2825/2826  温度が制御されたウォーターバスチャンバーで十分です。
メカニカルホモジナイザー (つまり FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosamplerSciex-このモデルはもう利用できません。オートサンプラーを備えたnano LCであれば十分です。
LTQ Orbitrap Velos 質量分析計Thermo Scientific-このモデルは販売を終了しました。その他の高分解能装置(Orbitrap Elite、Orbitrap Fusion、Orbitrap Fusion Lumosなど)も使用できます。
タンパク質ソフトウェア(例: Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
分析天びんメトラー・トレドAL54
攪拌板VWR12365-382どのブランドの攪拌板でも十分
pHメーター (トリス互換性)フィッシャー・サイエンティフィック (アキュメット)13-620-183どのブランドの pH メーターでも十分
pH 10 バッファーフィッシャー・サイエンティフィック06-664-261どのブランドの pH バッファー 10 でも十分な
pH 7バッファーフィッシャー・サイエンティフィック06-664-260任意のブランドのpHバッファー7で十分
1.5 mLエッペンドルフチューブ、500 pkフィッシャー・サイエンティフィック05-408-1291.5 mL エッペンドルフチューブの任意のブランドで十分
0.6 mL エッペンドルフチューブ、500 パックフィッシャー・サイエンティフィ04-408-1200.6 mL エッペンドルフチューブの任意のブランドで十分です
0.65 µm Ultrafree MC DV 遠心フィルターユニットEMD MilliporeUFC30DV00
2 mL 微量遠心チューブ、72 ユニットThermo Scientific69720
C18 梱包材 (5 &マイクロ;メートル、100 Å)BrukerPM5/61100/000この商品はBrukerからの取り扱いは終了しました。記載されている仕様の代替梱包材は、
C18梱包材で十分です(5 &マイクロ;メートル、200 Å)BrukerPM5/61200/000この商品はBrukerからの取り扱いは終了しました。記載されている仕様の代替梱包材で十分です
ック O ック です ック

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B.

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cPILOTIsobaric TaggingDimethylation LabelingSample MultiplexingProteomics AnalysisTissue HomogenizationStrong Cation ExchangeMass SpectrometryAlzheimer Disease ModelBiological Replicates

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