方法論記事

列およびレイヤーで樹状形態を分析します

DOI：

10.3791/55410

⸱

2017年3月23日

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1Section on Neuronal Connectivity, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (NIH), 2Mathematical and Statistical Computing Laboratory, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH), 3Biomedical Imaging Research Services Section, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH)

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、列およびレイヤーにショウジョウバエ延髄ニューロンの樹状突起のルーティングを分析する方法を示しています。ワークフローは、トレース基準列配列の樹状アーバーを登録すると、3次元空間内の樹枝状構造を分析するための画像品質と計算ツールを改善するためのデュアルビューイメージング技術を含みます。

要約

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このようなフライ光学ローブと脊椎動物皮質などの中枢神経系の多くの地域では、シナプス回路が発達した動物での開発と情報の処理中に脳の配線を容易にするための層と列に編成されています。特定の層における型特異的なパターンで精巧な樹状突起シナプス後ニューロンは、適切なシナプス前終末とシナプスします。フライ髄質の神経網は10層と約750列で構成されます。各カラムは、型特異的様式で求心性のいくつかの7種類の軸索の端末と一致延髄のニューロンの38種類以上の樹状突起によって神経支配されています。このレポートでは、画像に手順を詳しく説明し、延髄の神経細胞の樹状突起を分析します。ワークフローは、次の3つのセクションを含む：（I）デュアルビュー撮像部は、樹状突起の高解像度3D画像に直交する方向で集め2の共焦点画像スタックを結合します。 （ⅱ）デンドライトはトレースと登録部は、樹状をトレース3Dでアーバーと参照列配列に樹枝状のトレースを登録します。 （iii）は、樹状分析部は、樹状アーバーの層特異的な終端と平面投影方向を含む列と層に対する樹状パターンを解析して、樹状分岐および終了周波数の推定値を導出します。プロトコルは、マトリックス研究所言語でオープンソースのMIPAV（医療画像処理、分析、および可視化）プラットフォームとカスタムツールボックス上に構築されたカスタムプラグインを利用しています。一緒に、これらのプロトコルは、層および列にショウジョウバエ髄質ニューロンの樹状経路を分析する細胞型を同定するため、および変異体の欠陥を決定するために、完全なワークフローを提供します。

概要

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開発中に複雑で、ニューロン精巧な樹状突起が、そのシナプス前パートナーとシナプスを形成するための分岐パターンをステレオタイプ。樹状分岐パターンは、ニューロンのアイデンティティと機能と相関します。樹状分岐の複雑さとフィールドのサイズは、入力された番号を管理しながら、樹状アーバーの場所は、彼らが受け取るシナプス前入力のタイプを決定します。このように、樹枝状の形態学的特性は、シナプス接続と神経計算のための重要な決定因子です。フライ視神経ローブと脊椎動物の網膜のような複雑な脳の多くの地域では、シナプス回路は、情報処理1、2を容易にするために、列およびレイヤーで構成されています。このようなコラムと層組織では、明確なモダリティプロジェクトの軸索のシナプス前ニューロンは特定の層（いわゆる層特異的標的）で終了すると整然とした2次元アレイを形成する（いわゆるのcalleD地形図）、シナプス後ニューロンは、正しい種類と数のシナプス前入力を受信するために特定の層に適切なサイズの樹状突起を拡張しながら。層と列への標的軸索は、よく3、4を研究してきたが、はるかに少ないが、樹状突起は、特定の層にルーティングし、正しいシナプス前パートナ....

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プロトコル

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注：デュアルビュー撮影（セクション1から3）、樹状トレースおよび登録（セクション4から6）、及び樹状解析（セクション7から9）（ 図1）：プロトコルは3つのセクションが含まれています。コードとサンプルファイルは、 マテリアル/機器の表に記載されています。

1.デュアル画像取得

注：この手順は、二つの直交（水平および前頭）方位への関心のニューロンの2つの画像スタックを取得するように設計されています。

  1. 以前に12を説明したように、膜GFPマーカー（mCD8GFP）でまばらに標識された延髄ニューロン（〜10細胞/脳の葉）を含有するハエの脳を準備します。前述のように、（髄質ニューロンの樹状突起のために）、ウサギ抗GFPで脳を染色し、マウスmAb24B10（感光体軸索のために）、一次抗体および蛍光二次抗体（アレクサ488抗ウサギおよびAlexa 568抗マウス抗体）13。 1×PBS中70％グリセロール中で脳をクリアします。
  2. 水平方向（ 図2A、B）で脳をマウントするには、スライドの中央に退色防止封入剤の20μLのドロップにグリセロール-クリアフライ脳を転送します。
  3. 実装時の脳試料を粉砕からカバースリップを防止するために、カバー....

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結果

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ここで提示デュアルビュー画像化手順を使用して、まばらに標識TM20ニューロンを含むハエの脳は、二つの直交する方向で画像化しました。撮影の前に、脳は、膜繋留GFPと感光体軸索を可視化するための適切な一次および二次抗体で染色しました。イメージングのために、脳の第1の水平方向に取り付けた（ 図2A、B）。 GFP標識TM20ニューロンと周囲の光受容体の軸索は、共焦点顕微鏡（ 図3A）を使用して画像化しました。脳はその後、（ 図2A、B）再整列させたと同じTM20ニューロンは前頭向き（ 図3B）に再画像化しました。イメージングプロセスの間に、TM20ニューロンの位置は右延髄神経網（RV構成）の腹側半分であると同定されました。これら2つの画像スタックは、画像復元ソフトウェアとRECを使用してデコンボリューションしました。組換え画像スタック（ 図3C '）を生成するMIPAV（ 図3C）を

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ディスカッション

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ここでは、画像にどのように表示し、 ショウジョウバエの延髄ニューロンの樹状アーバーを分析します。最初のセクション、デュアルビュー画像は、高解像度の画像をスタックに2つの画像スタックのデコンボリューションおよび組み合わせが記載されています。第二セクション、樹状突起のトレースと登録は、参照列配列に延髄の神経細胞の樹状突起のトレースと登録について説明します。第3セクション、樹状分析は、樹状パターンを分析するためのカスタムスクリプトの使用を記載しています。一緒に、これらのプロトコルは、層および列に対する樹状パターンに関する情報を抽出し、樹状分岐及び終了周波数を決定するために、完全なワークフローを提供します。

ここで提示デュアルビューイメージング法は直交収集二つ以上の画像スタックが高い軸resolutioを達成するために再結合される光シート顕微鏡で実現多視点画像化技術、概念的に類似していますnは17、18。しかし、直交細長いデンドライトを撮像するために必要と.......

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開示事項

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著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

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この作品は、国立衛生研究所の学内研究プログラムによってサポートされていた、子どもの健康と人間開発（C.-HLへの助成金HD008913）のユニス・ケネディ・シュライバー国立研究所、情報技術のためのセンター（PGM、NP、ESM 、およびMM）。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Software
Huygens ProfessionalScientific Volume Imagingversion 16.05for image deconvolution (https://svi.nl).  商用ソフトウェア
MIPAVversion 7.3.0for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); フリーウェア
MIPAV プラグイン: PlugInDrosophila
RetinalRegistration.class		フリーウェア
MIPAV プラグイン: PlugInDrosophilaStandard
ColumnRegistration.class		フリーウェア
ImarisBitplane神経突起のトレースと画像登録の基準点の割り当て (http://www.bitplane.com); 商用ソフトウェア
Vaa3Dswc ファイルを視覚化 (https://github.com/Vaa3D/release/releases/);樹
状突起(http://www.mathworks.com)の形態計測解析用のMatlabMathworksR2014b
樹状突起形態測定パラメータ(http://www.treestoolbox.org/download.html)の解析用TREES1.14v1.14
Matlabツールボックス:Dendritic_Tree_Toolboxv1.0形態測定パラメータの計算用(https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration)。フリーウェア
名義会社カタログ番号Comments
Sample files
SWC ファイル定義http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
画像の組み合わせとレジストレーションhttps://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
基準点の例 https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=
1471880596000&api=v2
NameCompanystrongカタログ番号コメント
コンピュータシステム
MS Windows Windows 7 x64 または Macintosh OS X 10.7 以降3GHz 64 ビット クアッドコア プロセッサ、16G RAM (最小)
オプション: Quadro4000 (またはそれ以上)樹状突起の立体的視覚化のためのNvidia
オプション: NVIDIA 3D vision2Nvidiahttp://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
オプション: NVIDIA 3D vision2用
NameCompanyカタログ番号Comments
試薬
24B10The Developmental Studies Hybridoma Bank24B10
GFP Tag AntibodyThermofisher ScientificG10362
ヤギ抗ウサギ (H+L), Alexa Fluor 488Thermofisher ScientificA11034
ヤギ抗マウス (H+L), Alexa Fluor 568サーモフィッシャーサイエンティフィックA21124
VECTASHIELD 退色防止マウンティング ミディアベクター ラボラトリーズH-1000
マウンティング クレイ フィッシャーS04179
70%グリセロール含有1x PBS
カバーグラス、高性能、D = 0.17 mmツァイス474030-9000-000
フリーウェア、商用ソフトウェアMatlabツールボックス:、フリーウェアのコードとサンプルファイル グラフィックカード。 120 Hz LCD ディスプレイ http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html抗体 ム

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
  2. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
  3. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H.....

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