シングル出芽酵母細胞での寿命と細胞表現型を測定するためのマイクロ流体デバイスを使用しました

サマリー

この記事では、マイクロ流体チップの生産と寿命と、単一の酵母細胞の細胞表現型を測定するためのマイクロ流体実験のセットアップのために最適化されたプロトコルを提示します。

要約

出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeは、老化研究における重要なモデル生物です。遺伝学的研究により、種を超えて寿命に保存された影響を与える多くの遺伝子が明らかになりました。しかし、老化や死の分子的原因は未だに解明されていません。酵母の老化の根底にある分子メカニズムを体系的に理解するためには、単一細胞の寿命を測定し、さまざまな細胞および分子表現型を定量化するためのハイスループットな方法が必要です。これまでに、出芽酵母の母細胞を生涯にわたって追跡し、新生児の娘細胞を洗い流すマイクロ流体デバイスを開発しました。この記事では、マイクロ流体チップの調製方法とマイクロ流体実験の設定方法について説明します。複数のチャンネルを使用して、異なる条件下で、または異なる酵母株からの細胞を同時に追跡できます。一般的なセットアップでは、チャンネルごとに数百の細胞を追跡でき、細胞の寿命全体を通じて高分解能の顕微鏡イメージングが可能になります。また、私たちの手法では、単一細胞の寿命、分子マーカー、細胞形態、細胞周期動態の詳細な特性評価も可能です。 また、当社のマイクロ流体デバイスは、下流の画像解析で同定できる新鮮な母細胞を大量に捕捉することができるため、より高精度な寿命測定が可能です。

概要

出芽酵母は、研究の高齢化で強力なモデル生物です。しかしながら、酵母における従来の寿命アッセイは労働集約的でなく、低スループット^1、2だけでなく顕微解剖、に依存しています。彼らの年齢としてまた、従来の顕微解剖のアプローチは、単一の母細胞の様々な細胞および分子機能の詳細図を提供していません。マイクロ流体デバイスの開発は、酵母寿命を測定するだけでなく、母細胞^{3、4、5、6、7、8}の寿命全体の分子マーカー及び様々な細胞の表現型に従うように自動化された手順を可能にしました。酵母細胞は、マイクロ流体デバイス内にロードされた後、それらは、自動時間ラップを用いて顕微鏡下で追跡することができます電子イメージング。寿命、サイズ、蛍光レポーター、細胞形態、細胞周期動態、 等を含む、撮像処理ツールの助けを借りて、様々な細胞及び分子表現型は^3を抽出することができ^、6、8、その多くは、使用して得ることが困難または不可能です従来の顕微解剖方法。マイクロ流体デバイスは、数年前に^{3、4、6、7}彼らの開発に成功以来、酵母の老化の研究で注目を集めています。いくつかのグループが、その後、以前のデザイン⁵のバリエーションに公開している、と多くの酵母ラボは、彼らの研究のためのマイクロ流体デバイスを採用しています。

指数関数的な成長を受けて、細胞培養では、観察のために利用可能な老人母細胞の数はminiscuですル。したがって、寿命測定のためのマイクロ流体デバイスの一般的な設計原理は、母細胞を保持し、娘細胞を除去することです。そのようなデザインは、酵母が非対称細胞分裂を受けるという事実を利用します。デバイス意志トラップ大きな母細胞内の構造と小さな娘細胞を洗い流すことを可能にします。この資料に記載のマイクロ流体チップは、トラップ母細胞へのソフトポリジメチルシロキサン（PDMS）パッド（垂直鉛筆列）（ 図1）を使用します。同様の設計のデバイスは、以前に^{3、4、6、7}報告されています。このプロトコルは、マイクロ流体デバイスとタイムラプスイメージング実験のために最適化された単純セルローディング方式を製造するために簡単な手順を使用します。マイクロ流体デバイスの重要なパラメータの一つは、トラップ母細胞に使用さPDMSパッドの幅です。当社のDeviceは、その寿命全体で追跡することができ、新鮮な母細胞のかなりの部分を含め、各パッドの下に、より母細胞を維持することができ、より広いパッドを使用しています。細胞は、多くの世代場合や全体寿命を通して観察が必要であるために追跡する必要がある場合に寿命の測定に加えて、このプロトコルは、単一細胞タイムラプスイメージング実験のために有用です。

プロトコル

1.シリコンウェーハの金型製作

注：フォトマスクは、AutoCADのソフトウェアで設計し、商業の会社によって製造されています。このデザインは異なるパターン（の三つの層が含ま補足ファイル1 ）。第一、第二、及び第三の層の高さは、それぞれ、約4ミクロン、10ミクロン、および50ミクロンです。シリコンウェハモールドは、ソフトリソグラフィー^9、10を用いてフォトマスクから作成されました。

1. 水蒸気を蒸発させ、10分間200℃でシリコンウエハを焼きます。シリコンウェハ上にコートネガフォトレジストSU-8をスピン。
   注：30秒間2000rpmで第二の層を生成するために30秒間3000rpmで第一の層、SU-8 2010を生成するために30秒間5000rpmでスピンコートSU-8 3005及びSU-8 3025を生成します第三層。
2. ソフトベークトンの前に塗布されたウェハ彼は、パターン転写。合わせ、マスクアライナを使用して「直接接触」モードでウエハを露光します。
   注：ソフトベーク第一層のために95℃で2分、第二層のために95℃で3分間、第3層のために95°Cで15分間ウェハ。第二層、第3層のために200ミリジュール/ cm ²のための第一の層、130ミリジュール/ cm ²で100ミリジュール/ cm ²の露光量を使用します。
3. 露光後、ウェハをポストベークし、SU-8現像液を使用してそれを開発。 N ₂ガン及びハードベーク30分間200℃でウエハを用いてウェハを乾燥させます。
   注：シリコンウェーハモールドは、パターン側を上に向けて、スコッチテープを用いて直径15cmのプラスチック製ペトリ皿に固定されています。通常、我々は、複数のマイクロ流体チップを同時に製造することを可能にする同じ金型、上のいくつかの同一のチップ構造を置きます。各金型は、マイクロ流体チップを製造するために何回も再使用することができます。

2.マイクロ流体チップ製造

1. バランスの上にきれいな計量ボートを置き、風袋引き。重ボートにPDMSベースの50グラムを注ぎます。
2. （PDMSベースから1:10の重量/重量比）計量ボートにPDMS硬化剤を5g加えます。
   注：このボリュームは、金型と直径15cmのペトリ皿に基づいています。異なるサイズのペトリ皿を使用する場合、試薬の量を調整します。
3. 使い捨てピペットを用いてPDMSベースと硬化剤を攪拌します。計量ボートの端からスタートし、徐々に内側に移動します。小さな気泡が混合物全体に形成されるまで、数分間十分に攪拌。完全な混合は、PDMSの重合のために不可欠です。
4. ペトリ皿にゆっくりと混合物を注ぎます。混合物を完全にシリコンウェハ型をカバーしなければなりません。
5. PDMSの混合物からすべての気泡を除去するために10分間真空中でペトリ皿を置き。気泡が混合物の表面に残っている場合は、それらを吹き飛ばすためにピペットを使用しています。
6. シリコンをインキュベート約2時間75℃のオーブンでPDMSを有するウエハー型。
7. 穏やかウエハ型の構造への損傷を回避すること、シリコンウェハモールドオフ重合PDMSの層を剥がします。あるいは、単一のエッジ工業用カミソリの刃を使用して、パターンの周囲に最小5 mmのマージンを有するシリコンウェハ型から直接PDMSを切断;穏やかウエハモールドオフPDMS層を剥離。
8. パターン面を上にしてベンチにPDMS層を配置してください。注意深く建設損傷を避けるために、各単一チップのエッジから十分なマージンを保持し、単一エッジ工業用カミソリの刃で個々のチップを切り出しました。
9. パターン面を上に向けて、チャネルの両側に入口と出口の円を通ってまっすぐに穴をパンチするパンチペン（0.75 mmのID）を使用します。
   注：これらの穴は、媒体の流れのための経路を作成します。したがって、円を通過し、PDMS層を介してすべての方法をパンチすることが重要です。に確認してください穴からPDMS列を削除します。
10. 穴に再びパンチペンニードルを挿入することにより、すべてのパンチ穴を確認してください。針が何の詰まりがないことを示し、他の側から出てくることができていることを確認します。その後、優しくダスト粒子をきれいにテープをはがし、パターン面にテープを適用します。このステップを少なくとも3回繰り返します。滅菌を維持するために、PDMS上のスコッチテープのきれいな作品を残します。
11. PDMSの反対側に、この手順を繰り返し、同様にテープの最後の部分を残します。
12. 0.13〜0.17ミリメートルの厚さ24ミリメートル×30ミリメートルのカバーガラスを準備します。表面を殺菌する除塵装置でガラス上に70％エタノールを噴霧し、乾燥しました。さらに、ガラスは、オートクレーブ水で洗浄し、除塵機で乾燥させることができます。
13. プラスチック板にカバーガラスとPDMSを転送します。 PDMSからスコッチテープを外し、上向きパターン側に配置します。転送時のパターン面との接触を避けてください。
14. プラズマ機でプラスチック板を置き。 PDMSと次のような動作パラメータを使用して親水性表面レンダリングするカバーガラスに酸素プラズマ処理を適用する：曝露を、75秒;ガスの安定化、20 CC /分;圧力、200;そして、電力、100 W.
15. 注意深く両方の親水性表面（プラズマ処理中上向き面）接続、カバーガラス上にPDMSを置きます。 PDMSとカバーガラスの間に気泡がないことを確認します。
16. 少なくとも2時間75℃のオーブン中にPDMSチップをインキュベートします。
    注：欠損マイクロフルイディクスは、実験中に顕微鏡上に液漏れの原因となります。したがって、わずかにピンセットで縁からPDMSを持ち上げてPDMSとカバーガラスとの間の結合を確認することが重要です。穏やかに成功した結合を示し、カバーガラスからそれを分離してはならないPDMSを持ち上げます。

3.テストの準備

1. チューブの準備。
   1. 別々に1日PDMSチップの製造前に70％エタノール溶液中で入力と出力管を水没。
   2. チューブを洗浄するためにオートクレーブ水で5 mLの注射器を埋めます。注射器にチューブを接続し、水でチューブを洗い流すことにより、各チューブを洗浄します。
   3. エタノール残留物をきれいに洗浄工程を少なくとも3回繰り返します。
2. 構造は一貫して無傷であることを確認するために10倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡下でPDMSチャネルを調べます。スコッチテープを使用して、顕微鏡プラットフォームにPDMSチップを安定化させます。
   注：最初にデバイスを作製する場合は特に、バックアップのチップが存在することを確認するために、ステップ2で、一度に複数のチップを作ります。
3. オートクレーブ処理水で5 mLシリンジを埋めます。シリンジポンプにシリンジを固定し、対応する入力及び出力管を挿入します。約10分間、チップを洗浄するために750μL/ hに洗浄速度を設定します。分岐流路に空気の泡この期間中に洗い流されるべきです。残留気泡がある場合、手動で気泡を除去するために速度を調整。
4. 酵母サンプル調製。
   1. 3,000×gで5分間のための2つの1.5 mlのマイクロ遠心チューブへmLで調製した酵母試料（OD ₆₀₀ 0.6〜0.8）の転送1及び遠心分離機。
   2. 各チューブからの上清の大部分を除去し、0.5 mLのサンプルを形成するために、残りを組み合わせます。
5. シリンジポンプを一時停止し、PDMSチップからの入力管を取り除きます。
6. 手動で各入力チューブに（長さ1~2センチメートル）、小さな気泡を吸引するシリンジポンプを逆転。酵母サンプルを吸引するために移動します。気泡は、サンプルの境界を示し、描かれているどのくらいのサンプルを示します。
   注：注射器内に試料を吸引しないでください。
7. バックPDMSチップに入力されたチューブを挿入し、750μL/ hの速度で細胞をロードするためにポンプを再始動。
8. 10分間にシリンジポンプを残しますnおよび顕微鏡下での細胞のローディングの進行を調べます。成功したロード柱を一時停止の60％以上下になるトラップ細胞。
9. 栄養液に切り替えて、細胞培養のための400μL/ hまでの速度を調整します。
10. 顕微鏡のための観察位置を選択します。
    注：寿命測定のために、画像は、40X対物レンズを備えた光学顕微鏡で一回15分毎に採取しました。蛍光レポーター分析のために、画像は60倍のオイル対物レンズを備えた蛍光顕微鏡で一度15分毎に採取しました。

結果

実験後、細胞および多くの細胞及び分子表現型の寿命が記録タイムラプス画像から抽出することができます。各細胞から抽出することができる異なる機能の数があるので、解析の最初のステップは、位置とセルの境界と追跡されている様々なイベントのタイミングを含む細胞およびイベントを、注釈を付けるようになっています出芽イベントとして。これらのアノテーションは、それが簡単に細胞の同じセットに戻ることにし、将来的に異なる特徴を分析します。そのようなImageJの¹¹および関連のプラグインとして、画像解析ソフトを用いて、表現型のリストは、その後、細胞の記録された注釈を用いて画像データから抽出することができます。

マイクロ流体デバイスを用いて測定した表現型のいくつかの例を以下に示します。酵母の寿命表現型各捕捉された母細胞によって産生さ芽の数をカウントし、カプラン - マイヤー推定と推定することによって得ることができます。当初、マイクロ...

ディスカッション

PDMSデバイスは、作りたてする必要があります。そうでない場合、デバイスにチューブを挿入することによって引き起こされる気泡は除去するのが困難であろう。ステップ3.4は、細胞を濃縮することによって、細胞の積載効率を向上させることが重要です。実験のスループットを増大させるために、同じPDMSチップ接続独立して動作するポンプに4〜6のモジュールは、典型的には同時に4〜6の異なる実験（異なる株又は培地組成）を実行するために使用されます。

（顕微解剖を使用）は、従来の酵母複製老化アッセイと比較して、ここに提示マイクロ流体の方法は、より少ない労力と時間がかかります。また、マイクロ流体デバイスは、細胞のサイズ、細胞周期動態、細胞形態、および様々な分子マーカーを含む、種々の細胞または分子パラメータの詳細な定量を可能にします。このマイクロ流体方法は、保持することにより、高解像度の顕微鏡との長期的な細胞追跡を実現します娘細胞としてPDMSマイクロパッドの下で母細胞が自動的にフラッシュされます。

このデバイスはHuberts ら

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3インチ <111>シリコンウェーハ	ディソンエンジニアリング
SU-8 2000および3000シリーズ	MicroChem
Sylgard® 184シリコーンエラストマーキット	ellsworth	2065622	Sylgard®シリコーンエラストマーベースと硬化剤
ペトリ皿	VWR	391-1502
ハリスUni-core™パンチ(ID:0.75ミリメートル)	シグマAldrichが含まれています
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® カバーガラス	Thermo Fisher Scientific	102440
3M スコッチテープ	ULINE	S-10223
VWR®かみそりの刃VWR		55411-050
純粋なエタノール、Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
5 mL BD シリンジ (ルアーロック ™ヒント)	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー	309646
PTFE標準ウォールチューブ(100フィート、AWGサイズ:22、公称ID:0.028)	コンポーネント供給会社	SWTT-22
ニードルアソートメント	コンポーネント供給会社	NEKIT-1
シケー	ターHACH	2238300
ラボオーブン	フィッシャーサイエンティフィック	13246516GAQ
Nikon TE2000 顕微鏡 40X および 60X 対物	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 40X および 60X 対物	Zeiss
シリンジポンプ	Longerpump	TS-1B