方法論記事

アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して

DOI：

10.3791/55418

⸱

2017年5月3日

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1Department of Psychology, West Virginia University, 2Department of Drug Discovery & Development, Auburn University, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky Medical Center

この記事について

サマリー

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ここでは、トニックおよび酵素結合微小電極アレイ（MEA）を使用して、in vivoで相性の細胞外グルタミン酸変化を測定の空間的及び時間的に正確な方法のセットアップ、ソフトウェアナビゲーション、およびデータ分析を記載しています。

要約

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神経伝達物質の破壊は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、および不安の根底にある病理学において役割を果たし、多くの場合、中枢神経系（CNS）の疾患の重要な要素です。伝統的に、微小透析は、これらの疾患で発生する神経伝達物質の変化を調べるための最も一般的な（賞賛）技術となっています。微小透析は、組織の広い領域にわたる遅い1-20微細な変化を測定する能力を持っているので、しかし、それは潜在的に脳と低速サンプリング機能内の固有の接続を破壊し、侵襲性の欠点を持っています。比較的新しい技術は、微小電極アレイ（MEA）は、彼らが起こるように、空間的および時間的に正確なアプローチを行う、別個の脳領域内の特定の神経伝達物質の変化を測定するための多くの利点を有しています。また、MEAのを使用して、インビボでの神経伝達物質の変化の測定を可能にする、低侵襲性です。私たちの研究室では、我々ヘクタールアルツハイマー病の病理学に関連する神経伝達物質の変化、グルタミン酸、中に特に興味を持ってきまし。そのため、ここで説明する方法は、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、グルタミン酸の潜在的な海馬の中断を評価するために使用されてきました。簡潔には、使用される方法は、対象の神経伝達物質のための非常に選択的な酵素によるマルチサイト微小電極を被覆し、バックグラウンドノイズと干渉を減算する自己参照サイトを使用することを含みます。めっき及び較正後、MEAは、マイクロピペットを用いて構築することができ、定位装置を用いて、関心のある脳領域に低下しました。ここで、この方法は、RTG（TauP301L）4510匹のマウスを麻酔し、正確海馬のサブ領域（DG、CA1およびCA3）を標的とするために、定位装置を使用することを含む説明しました。

概要

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脳内の神経伝達物質の変化を測定することは、多くの場合、神経伝達物質調節不全によって特徴付けられる中枢神経系（CNS）の疾患を研究する神経科学のための不可欠なツールです。高圧液体クロマトグラフィー（HPLC / EC）と組み合わせた微小透析は、細胞外神経伝達物質レベルの変化1、2、3、4を測定するために最も広く使用される方法であったが、微小透析プローブの空間的及び時間的分解能は神経伝達物質のために理想的ではないかもしれませんこのようなしっかり外空間5,6に調節されるグルタミン酸塩、など。なぜなら遺伝学および画像化における最近の進歩により、 生体内でグルタミン酸をマッピングするために使用することができる追加の方法があります。遺伝的にコードされたグルタミン酸蛍光レポーターを用いて（iGluSnFR）AND二光子イメージング、研究者らは、in vitroおよびin vivo

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プロトコル

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1.酵素で微小電極アレイまたはマトリックス層をコーティング

  1. タンパク質マトリックス溶液を準備します
    1. ウシ血清アルブミン（BSA）10mgを秤量し、1.5mLのマイクロ遠心チューブに移します。
    2. BSAを含むマイクロチューブにDI水の985μLを追加します。 （再ピペットBSAが溶解するまで1,000μLピペット〜3回使用して）手動撹拌によって溶液を混合します。
      注：液中に空気を導入することができるそうするように、溶液を混合するために渦を使用しないでください。また、気泡を導入することを避けるためにボリューム<千μL（ 例えば、700μL）にピペットを設定します。必要に応じて溶液を微量に配置することができます。
    3. BSA溶液が溶解したら、25％グルタルアルデヒド溶液5μLを加えます。 5回 - 閉じられたチューブ3を反転させることによって溶液を混合。得られた溶液を0.125％グルタルアルデヒドの1％BSAです。
    4. タンパク質マトリックスのソリューを脇に置きます5分間ション。解決策は、色が淡黄色に表示されます。
  2. 所望の酵素溶液を調製する（ 例えば 、グルタミン酸オキシダーゼ）
    1. 凍結乾燥され、精製された酵素を濾過し、DI水を添加することにより、グルタミン酸オキシダーゼ溶液を調製し（....

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結果

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この技術は、このような外傷性脳損傷、加齢、ストレス、およびてんかんなどの動物モデル、多くの種類のシグナリンググルタミン酸の変化を測定するために使用することができますが、ここでは、MEAの技術は、トランスジェニックマウスモデルにおけるグルタミン酸作動性の変化を調べるために使用することができる方法を示し人間タウオパチー19、20の。 RTG（TauP301L）4510マウスは、第17染色体にリンクされた前頭側頭型認知症及びパーキンソン関連付けられたタウにおけるP301L突然変異を表し、一般にアルツハイマー病、神経変性タウオパチーおよび前頭側頭型認知症に関連したタウ病理を研究するために使用されます。我々はまた、グルタミン酸作動性シグナル伝達は、薬理学的介入によって変更することができることを示しています。我々は、リルゾールで安定化することによりグルタミン酸作動性シグナル伝達を調節する筋萎縮性側索硬化症（ALS）のためのFDA承認疾患修飾薬をTauP301Lマウスを.......

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ディスカッション

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MEA技術は、in vitroおよびin vivoでの神経伝達物質の放出と吸収の速い反応速度を測定することができます。したがって、この技術は強壮、神経伝達物質のレベルを含むデータ出力、誘発神経伝達物質の放出、および神経伝達物質のクリアランスのさまざまなを生成します。 MEAの使用は、比較的複雑な手順であるため、しかし、成功した使用に最適化される必要があるかもしれない多くの要因があります。例えば、キャリブレーション時に、一方が無信号波形（オシロスコープ画面）または刺激に対する応答が最小の、または存在しないことがないことに注意してもよいです。システムの誤動作の可能性が高いが、記録システム、またはコンピュータを再起動し、問題を解決することがあります。また、問題が接続エラーである可能性があります。校正前に、MEAおよび基準電極接続が正しく接続されていることを再確認することが適切です。ヘッドステージ上のDIPソケットの交換は、MEA接続の問題を解決することができます。MEAは、溶液中に完全にないか、または不十分維持基準電極が使用される場合、これらは、また、.......

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開示事項

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GGは、本研究では、グルタミン酸の測定に使用FAST-16記録システムを作るQuanteon、LLCの個人事業主です。 JEQはQuanteonのための有給コンサルタントです。

謝辞

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（; U54GM104942 MNR）、NIA（MNR; R15AG045812）、アルツハイマー病協会（MNR; NIRG-12から242187）、WVU学部研究上院グラント（MNR）、およびWVU PSCORグラントこの作品は、国立総合医科学研究所によってサポートされていました（MNR）。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
FAST-16mkIII-8 channelQuanteon16mkIII
Microelectrode arraysCenMetW4 or 8-TRK
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA-305910 g (1ヶ月後に有効期限が切れます)
グルタルアルデヒドSigma-AldrichG-6257100 mL (6ヶ月後に有効期限が切れます)
グルタミン酸オキシダーゼUS BiologicalまたはSigma AldrichG4001-01 または 10064650 UI (6 か月後に有効期限が切れます)
Hamilton SyringesHamilton#803832 シリンジ
メタノールBDH UN12304 L
m-フェニレンジアミン二塩酸塩 (mPD)ACROS Organics133056025025 g
参照電極 (RE-5B)BASMF-20793 電極
電池式 磁気攪拌板コールパーマーEW-04804-01異なるサプライヤーから購入可能
グルタミン酸 Sigma-AldrichG-1626100 g
アスコルビン酸TCI 50-81-7500 g
ドーパミン塩酸塩Alfa Aesar62-31-75 g
過塩素酸VWRUN2920500 mL
塩化後VWR7447-40-71 kg
塩化ナトリウムVWR7647-40-71 kg
塩化カルシウムMP153502100 g
水酸化ナトリウムBDH1310732500 g
ガラス圧力排出ピペットCenMet
スティッキーワックスKerrlab625別のサプライヤー
から購入できますMicrosyringeWorld Precision InstrumentsMF28G-5
モデリング クレイウォルマートさまざまなサプライヤーから購入できます
Picospritzer IIIParker
シルバー ワイヤーAM システム#786500
塩酸BDH76470102.5 L
プラチナ ワイヤーAM システム778000
はんだガンロウズまたはホームデポ異なるサプライヤーから購入可能
マルチメーターウォルマート異なるサプライヤーから購入可能
PhysioSuiteケントサイエンティフィック異なるサプライヤーから購入可能
SomnoSuiteケントサイエンティフィックサプライヤーから購入可能
脳定位固定装置Stoelting異なるサプライヤーから購入可能
デジタルラボスタンダードStoelting異なるサプライヤーから購入可能
Meiji EMZ 顕微鏡MeijiEMZ-5
ドリルドレメルマイクロ
メトリックMetrex102800
メスVWR異なるサプライヤーから購入できます
手術用ハサミVWR異なるサプライヤーから購入可能
滅菌綿棒ピューリタン25806異なるサプライヤーから購入可能
眼軟膏Puralube 獣医軟膏獣医から入手
ヨウ素スワブVWRS48050異なるサプライヤーから購入可能
アルコール綿棒地元のドラッグストア異なるサプライヤーから購入可能
滅菌手術用ドレープダイナレックス4410異なるサプライヤーから購入可能
滅菌生理食塩水テクノバS5815フィルターを使用して独自の溶解を作ることができます
過酸化水素 (3%)地元のドラッグストア異なるサプライヤーから購入可能
加熱パッドウォルマート異なるサプライヤーから購入可能サプライヤー
異なる

参考文献

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  1. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  2. Cavus, I., et al.

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