細胞集積量の増加と腫瘍標的化の改善のためウイルス由来ペプチド修飾抗体複合体の初期評価

サマリー

抗体複合体 (ACs) と結合したウイルス由来ペプチドは、細胞に蓄積される高められた腫瘍の分子のペイロードを提供する可能性があるのための勢いを増しているアプローチです。このプロトコル ペプチド共役、AC とペイロードの細胞内蓄積、および腫瘍ターゲットを評価する一般的な方法を利用して、キーの初期開発段階で研究者に役立ちます。

要約

ウイルス由来ペプチド抗体抱合 (ACs) は、癌治療に用いられるし、現在 ACs 上高められた細胞の蓄積によるイメージング分子のペイロードの腫瘍細胞配信エージェントの可能性のある強力なクラスです。体外初期 AC 中に開発、蛍光技術、測定で細胞内局在性、蓄積の効率、およびターゲット細胞の特異性を決定するために十分です。現在、AC の細胞内蓄積および局在性を評価するためにセルを準備するための標準化された方法についてのコンセンサスはありません。ACs ウイルス由来ペプチドの最初のテストは、いくつかの候補が構築されている場合に特に重要です。蛍光法による細胞内蓄積を決定する細胞表面で ACs からバック グラウンド信号を受けます、蓄積の解釈を複雑にします。測定、通常扱われた細胞を分別し、別の細胞コンパートメントの放射能を測定します。ただし、セル換散の異なる細胞から細胞へ、しばしば核と細胞質のコンパートメントは十分に絶縁されていません。これは、ペイロード配信のプロパティ上の誤解を招くのデータを生成できます。標識の放射性核種イメージングに続いてマウス腫瘍のウイルス由来ペプチド修飾・ ACs の静脈注射はの体内の段階で腫瘍とペイロードのターゲット配信のプロパティを決定するための強力な方法開発。しかし、これは比較的最近の進歩、いくつかのグループは、この方法でウイルス由来ペプチド修飾 ACs を評価しました。共焦点の顕微鏡検査および測定を使用するときウイルス由来ペプチド修飾 AC の蓄積をより正確に評価する扱われた細胞の処理について述べる.具体的には、トリプシン細胞細胞表面を削除するためのメソッドでは、ACs がバインドされています。我々 はも細胞分別を改善するためのメソッドを提供します。最後に、このプロトコルは、担癌マウスのプロパティをターゲットと初期の腫瘍を評価するためポジトロン断層法 (PET) を用いた生体内のメソッドを提供します。我々 は放射性同位元素⁶⁴Cu を使用して (t_1/2 = 12.7 h) この議定書の例ペイロードとして。

概要

抗体複合体 (ACs) は、癌治療を改善するため、腫瘍を検出するための効果的な薬の変革クラスに成熟しているバイオ医薬品です。放射性、小分子生物毒素など分子のペイロードに共役モノクローナル抗体 (mAb) から成る、ACs が絶妙なターゲット抗原親和性と特異性を持つがん細胞にこれらのペイロードを提供することができます。こうして ACs 大幅に非特異的な毒性を軽減し、腫瘍部位でペイロード活動を増やす可能性があります。ACs 細胞傷害性小分子 (抗体薬物複合体としてとも呼ばれる) を輸送を従来の治療^1,を失敗した乳癌、ホジキン リンパ腫患者の治療に承認されている治療、²。 加えて、ACs 輸送放射性同位元素 (通称: radioimmunoconjugates) が開発。イメージング放射性同位元素を運搬 AC ³前立腺がん転移を識別する承認されています。多くのより治療 ACs 申請承認⁴、楽観主義ががんケア⁵を改善するために ACs の未来のため高い。

それにもかかわらず、化学療法または放射性同位元素等を配送するときに、効果的に標的細胞内これらのペイロードを蓄積困難である ACs。この側面は、長期無病生存率やコントラストの高い腫瘍^6,7をイメージングを提供する ACs の無力で多くの場合大きく貢献しています。一般に、ACs バインドのターゲット抗原一度彼らは受容体を介したエンドサイトーシスと呼ばれるプロセスを通じて内面化します。ACs はエンドソーム内部に陥れた劣化のリソソームに人身売買し、ペイロードを解放⁸。細胞内の輸送プロセス高ペイロードの特異性とターゲット癌細胞に対する有効性を達成するために ACs の課題があります。たとえば、多く抗原 Her2 など (ターゲット治療 AC トラスツズマブ emtansine) は、最初の 30 分の⁹に結合した抗体の 85% までをリサイクルできます。さらに、劣化が発生すると、リリースされた化学療法および放射性同位元素等積極的にエクスポートできます発現の増加および/または関連付けられる膜輸送タンパク質^10,11の活動。ライソゾームの分解も阻害治療酵素など新規生物学的ペイロードの配信と非アクティブにすることができますオリゴヌクレオチド^12,13。本質的に、がん細胞は、ACs によって提供されるペイロードの必要な細胞内蓄積を abrogating に効果的です。

このプロトコルでは、エンドソームわなに掛ける事を脱出し、細胞核へのローカライズ用のウイルス由来ペプチドに ACs 結合の概念を実装する方法について説明します。セルのホスト システムを操作するような洗練された、じゃないから潜在的なバイオ医薬品としてウイルス由来のタンパク質・ ペプチドの開発長い治療研究¹⁴に染み付いています。数百万年のウイルスは宿主細胞を効率的に入力するために正常な生理学的な哺乳類細胞システムを悪用することができる蛋白質の優れたコレクションを取得する進化しています。受容体を介したエンドサイトーシスを介して内在化されているウイルス、彼らはエスケープがリソソームに人身売買のプロテアーゼのローカライズされた濃度の猛攻撃が生存のため問題が発生することができますも挑戦しました。エンドソームわなに掛ける事を脱出するためのドラッグデリバリーにおける活用も特徴とウイルス由来ペプチドは、転写 (Tat) 蛋白質¹⁵のひと免疫不全ウイルス トランスです。Tat は、低 pH その時点で蛋白質のコンフォメーション変化発生にそれ自身を挿入し、エンドソーム膜¹⁶を混乱させる有効にする Tat の感知によるエンドソームわなに掛ける事をエスケープすることです。これは、結果、Tat ペイロード抱合体細胞質にアクセスすることができます。このプロトコルに関連する 2 番目のウイルスの処理要素は、核¹⁷を治療用遺伝子や薬を提供するために使用するアプローチです。ウイルスは、正常に過去の核膜核膜孔複合体 (NPC) を通過して進んでいるためホスト細胞の機械を操作するために進化してきました。細胞高分子含まれている (または含まれているタンパク質に結合) 核のバインドに必要な核局在化信号 (NLSs) 輸送蛋白質 (例えばkaryopherins α、β) NPC を通じて必要な動きを提供します。ウイルスは、ホスト細胞輸送タンパク質核¹⁸に往復を利用する能力を提供する NLS シーケンスを含むタンパク質を開発しています。

多数の ACs が以前 Tat と NLS 由来ペプチド修飾し、癌細胞内に蓄積する能力を対象化、腫瘍^{19,20,21,22 テスト、23,24,25,26,27,28,29,30} (表 1)。細胞傷害性ペイロードを提供する調査は ACs ウイルス由来ペプチドが未変更 ACs ^22,26を殺す腫瘍、細胞毒性、細胞蓄積を大幅に増加させることができることを示した。AC のこの新しいクラスの共通の特徴は、その建設です。通常、ペプチッドには無料スルフヒ グループを提供するターミナル システインが含まれています。Mab は、まずNヒドロキシスクシンイミド (NHS) と両端のマレイミド グループを含む noncleavable 二官能性架橋剤と反応しました。NHS のエステルは、アミド結合を形成する mAb の第一級アミンと反応します。無料マレイミド グループと反応の mAb はチオエステル結合、ペプチドと mAb をこのようにリンクを形成するペプチド スルフヒ グループと、反応しました。Heterobifunctional 架橋剤がウイルス由来ペプチド ACs ^{22,23,26の構造で使用されるより一般的 homobifunctional 塗料の硬化剤は、使用される28をされていますが、 31,32}。このプロトコル具体的に使用する架橋剤 sulfosuccinimidyl 4-(N maleimidomethyl) シクロヘキサン-1-カルボン酸 (スルホ SMCC) その使いやすさのためとの多くの承認された抗体医薬の共役のトラスツズマブ emtansine で使用されるので、ウイルス由来ペプチド ACs ^{8,22,23,26,31,32}。ナトリウム dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 最初の活用効率を決定するための主な方法は、半定量化 mAb あたりペプチド数。蛍光標識二次抗体 mAb に固有を用いた共焦点顕微鏡は、当初ウイルス由来ペプチド修飾 ACs の細胞内の分布特性の評価方法です。これまでは、放射性同位元素、ウイルス由来ペプチド修飾 ACs によって提供される主なペイロードです。放射性同位元素は、細胞における放射能はガンマを数えることで簡単に算出できるので有利であります。さらに、ヒトのガンのマウス ・ モデルに変換される ACs は腫瘍ターゲット分子のイメージ投射様相を使用する単一光子放出コンピューター断層撮影、ポジトロン断層法 (PET) を評価する能力を持つ研究者を提供します。^23,32,33します一般に、建設と検証試験方法の研究者によって主に使用される効果的に入力し提供する開発の初期段階でウイルス由来ペプチド修飾 ACs の非常に良い評価を提供、。ペイロード内標的細胞と腫瘍を標的。

さらに腫瘍の癌細胞中のそしてペイロードの配信を改善するための照明キー分野 Tat と NLS-修飾 ACs があります。NLS 変更 ACs に対して細胞内蓄積効率はささやかな^23,31,34をすることができます。非効率的な細胞内蓄積は、エンドソームの継続的なわなに掛ける事が原因です。生体内で腫瘍が対象とすることができますもに減少すると両方 Tat と NLS-修飾 ACs。Tat および NLS のアクティブなシーケンスには、いくつかの正荷電残基が含まれています。モノクローナル抗体に接続されて、全体的なカチオンは大幅に増加した³⁵をすることができます。結果として、Tat-NLS-変更 ACs が健全なティッシュの取り込みを増加、および急速な血のクリアランスを増加しました。

当社グループは、複合化合物を開発した NLS (ChAcNLS; にリンクされている胆汁酸から成る図 1)。ACs の ChAcNLS 変更は、提供された放射性同位元素の細胞内蓄積を増加し、腫瘍標的 NLS 変更と伝統的な ACs ^33,34と比較して向上させることができます。胆汁酸の後ろのメカニズムは、セラミドの形成からエンドソーム脱出をトリガーする胆汁酸を利用する膜融合に頼ることはできません選択のノンエンベ ロープ ウイルスの機能に触発されます。たとえば、ブタの腸内ウイルス募集コール酸セラミド^36,37,38にスフィンゴミエリンの加水分解を触媒するスフィンゴミエリナーゼをアクティブにしています。これはエンドソームの膜を不安定化、ウイルスのエスケープできます。胆汁酸は、NLS を補完する別のウイルス由来のコンポーネントです。

このフィールド移動する前方および将来ウイルス由来ペプチド、ACs によってペイロード配達で進歩が発生するは、初期の開発中の生化学的, 機能的特性の視覚的なデモを提供するために計ります。ここでは、細胞内蓄積と腫瘍は初期の段階の開発中にターゲットの効率的かつ簡単な定量、ウイルス由来ペプチド修飾 ACs の初期評価のための私達のプロトコルについて述べる。我々 は、例をモデル系として市販 Mab 7 3 と A14 を使用します。手順 1 では、構築された ACs の 'go' 決定するためことができる方法として SDS ページの使用について説明します。手順 2 では、trypsinization AC 細胞内分布と蓄積の改善された可視化を可能にするを使用して、メソッドについて説明します。3 核局在を正確に判断する改良された細胞分別の方法を示します。ペイロード⁶⁴Cu を駆使し、この手順で (t_1/2 = 12.7 h) は細胞排出されやすい、陽電子のエミッター ^{10 の}ため。したがって、手順 4 が生体内の腫瘍ペット画像を背景 (すなわち非標的健全なティッシュ) 腫瘍の取り込みを視覚化し、AC の例が具体的かつ効果的にできるかどうかを決定する評価をターゲットについて説明しますターゲット腫瘍。これらのメソッドは、さらに進歩のための候補者を識別するために ACs ウイルス由来ペプチドの開発調査官に対して十分です。

プロトコル

生体内で動物実験では記載は、承認プロトコルによると、動物実験センター病院ユニヴェルシテール ・ デ ・ シャーブ ルックの倫理委員会の倫理的な指針の下で行われました。

1. 抗体ペプチド共役

注: ChAcNLS は、任意の商業ペプチド メーカーや大学附属のペプチド合成サービス プラットフォームで合成できます。ChAcNLS の合成は、参照³⁴で見つけることができます。手順 1 と 2 の IL 3Rα ³⁹白血病抗原のために特定である mAb 7 3 を使用します。

1. 1.7 mL 遠心チューブで 10 mg/mL にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.6 7 3 (~ 1 mg 総抗体) ソリューションを準備します。
2. ジメチルスルホキシド (DMSO) 5-10 mM の濃度でスルホ SMCC を溶解します。ボルテックス ソリューションは徹底的に完全溶解を実現するために最適です。
3. 7 3 を含む管 (モル比のスルホ-SMCC-に-7 3 必要に応じて 5-20 μ L) の間に通常溶存スルホ SMCC ソリューションを追加します。10、25、50-1 のスルホ-SMCC-に-7 3 比率をテストすることをお勧めします。1 時間室温で孵化させなさい。
4. 浄化、PBS、pH 7.0 で限外濾過装置とバッファー交換を用いたマレイミド誘導体 7 3 を集中です。再び約 5 分破棄流れおよび PBS、pH 7.0 と遠心分離機で塗りつぶしのための 8,000 の x g で遠心分離機します。
   1. この 7-8 回を実行完全にバッファーを交換します。きれいな遠心管に逆さまフィルター デバイスを置くことによって回復集中 7 3 タンパク質。1,000 x g. 復元ボリュームで 2 分間遠心分離機は約 0.3 mL をする必要があります。
5. マレイミド アクティブ 7 3 管内の前の手順で使用されるスルホ-SMCC-に-7 3 比を基準にして ChAcNLS の 2 倍モル超過分を追加し、4 ° C で一晩インキュベートたとえば、10-1 スルホ-SMCC-に-7 3 比率を使用した場合 20-1 ChAcNLS-に-7 3 の比率を使用しています。総容積を大幅に変更しないでください。
   注: ChAcNLS 接合過程における降水量は発生しませんが、これは他のペプチドで発生する可能性がある可能性です。最も可能性の高い原因ペプチドは、疎水性沈殿物の印を反応管を観察します。これらのケースで親水性の向上を提供するために変更を設計するために興味のペプチッドを再訪の価値があります。
6. PBS pH 7.4 (手順 1.4 参照) で目的濃度およびバッファー交換する限外濾過装置を使用して 7 G 3-ChAcNLS を集中します。総蛋白の回復量は ≥ をする必要があります元の原料の 75%。
7. 12% のポリアクリルアミドゲル (、ChAcNLS を十分に分離重い共役し、光の nonconjugated チェーンからチェーンを提供します) を使用して構築された 7 G 3 ChAcNLS 候補者を評価する SDS ページを実行します。7 G 3-ChAcNLS ページの読み込みのミックス 10 μ g 含む 2 μ L β-メルカプトエタノールをバッファーし、同様に読み込みます。
8. 適切な電圧 (120 V 12% ゲルの 1 時間) に設定し、電気泳動を実行します。Coomassie 染料前ゲルの底に達すると電気泳動を停止します。
   注: ゲルをオフに実行 Coomassie 色素フロントをてはいけないです。
9. ゲルの電気泳動装置を解除、脱染め色液 10 %v/v 氷酢酸と 20 %v/v のメタノールを含むですすいでください。
10. ゲルの写真を撮って、定規やメジャーで距離 (cm) 移行基準の 7 3 抱合体。保持因子 (Rf) 値を計算 (蛋白質は Coomassie の移行前に、読み込み場所) からゲルの長さで割った値移行の距離であります。標準各蛋白質からの Rf 値に対してログの分子量 (MW) をプロットして、7 3 のサイズを推定抱合体します。
11. 7 3 MW の差で割って抗体あたりペプチド数を共役させ、1768.5 g/mol (ChAcNLS MW) で 7 3 未変更の状態を計算します。
12. Coomassie 染色ゲルのデジタル画像を撮影し、デンシトメトリーの分析を実行します。この時点で、鉛の候補者の選択は、重要な骨材種を含まない ChAcNLS 分子の最大数と AC に基づくことが。

2. 共焦点顕微鏡による細胞内蓄積評価

注: 興味のペイロードを持つ製剤を開発する前にペプチド抗体の細胞内蓄積細胞選択性をテストすることが重要です。Tat は、非特異的な細胞浸透のための傾向を持っている示されている、ため高価なペイロードと事業コストのかかる開発手順の前に最初解析細胞内蓄積とセル選択価値があります。このため、手順 1 はモノクローナル抗体アイソタイプ無関係な特定のコントロールを変更する必要も。プロトコルの残りの ACs 抗体あたり 10 ChAcNLS 分子変更でいきます。手順 2 と 3 のための重要なステップを含む回路図は、図 2で説明します。

注意: この手順プロトコルの処理やパラホルムアルデヒドの操作が含まれます。処理するとき製造業者の指示に従ってください。

1. 200 nM 7 G 3-ChAcNLS などの変更コントロール モノクローナル抗体を用いた標的 TF 1 a 細胞を扱います。37 ° C で 1 h の抱合体と 5 x 10⁶抗原陽性細胞を孵化させなさい
2. 1 h 後清を削除し、氷冷 PBS で 3 x 1 mL で洗います。新鮮なメディアを追加し、37 ° C でさらに 1 時間インキュベート
3. 追加の時間後に上清を除去、1 mL の氷冷 PBS で 3 x を洗います。3 最大 37 ° C で 30 分に 0.5 mL の PBS の 0.25% トリプシンとエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含むを追加します。
   注: 初期のパイロット テスト中に勧めない AC の細胞内蓄積の違いを決定するために細胞を trypsinize にします。このプロトコルは、トリプシンの使用を促進する、これは別の AC 候補者の細胞内蓄積効率の評価を向上するしくみを紹介します。
   1. 視覚的に切り離されるすべてのセルをチェックするインキュベーションの異なる回をテストします。また、汚損の解決の生存率と細胞因数を孵化し、前述⁴⁰フローサイトメトリーによる解析を実行します。
   2. 細胞培養 RPMI 1640 media/10% ウシ胎児血清 1.5 ml のトリプシンを中和します。500 x g で 5 分で細胞を遠心上清を削除し、0.5 mL の氷冷 PBS で 3 x を洗います。
4. 1% パラホルムアルデヒドと 30 分洗浄のため氷の上の 1% ショ糖を含む 0.5 mL の PBS で修正細胞細胞 0.5 mL の氷冷 PBS で 3 倍、250 × g で遠心する 5 分 Permeabilize セル 0.5 mL 0.15% を含む PBS で氷の上 5 分のトリトン X-100。氷冷 PBS のセルを洗浄し、遠心分離を繰り返します。
5. 2 μ g/mL (または濃度を推奨メーカー) を含む 0.1 mL の PBS のセルを停止抗マウス (アイソタイプ特定) の Fc 二次ポリクローナル抗体標識 AlexaFluor 647 暗闇の中で部屋の温度で 1 時間。
   1. 0.5 mL の氷冷 PBS で 3 x 5 分と洗浄セル 250 x g で遠心分離機します。0.5 mL の PBS のセルを中断します。
      一時停止: セルは、冷蔵庫で保存できます。
      注意: それは興味の mAb の正しいアイソタイプを認識する二次抗体を選択する重要です。Propidium ヨウ化 (PI) は、核の染色と干渉しないの遠赤外線放出のため AF647 が選択されます。
6. 細胞をコンテナーに 10 μ g/mL の濃度に PI を追加します。次に、メディアをマウントとカバーのガラス基板を用いたスライド ガラスに 1 x 10 の⁵セルをマウントします。
7. 共焦点顕微鏡倒立レーザの Plan Apo 60 X の油浸漬目的ナ 1.42 と細胞を検査します。488 nm アルゴン レーザーと 600-650 nm のスペクトル スキャン プリズムを使用して PI 蛍光を検出します。AF647 蛍光 633 nm ヘリウム ネオン レーザーと 650-700 nm のスペクトル スキャン プリズムを使用します。PI と AF647 から順番に蛍光排出量を収集します。
   注: は、評価とセルの比較で同じ設定を使用します。ただし、非トリプシンの細胞と比較してトリプシン セルの設定を調整する必要があります。
8. 顕微鏡のソフトウェアを使用して画像を取得します。切片を用いたシリアル水平光 2 X ライン平均と 1,024 x 1,024 ピクセルをセル全体厚み 0.5 μ m 間隔で撮影した画像を収集します。最大蛍光強度で 4 つの連続したスライスから、積み上げ z 予測画像を提示します。
9. 顕微鏡のソフトウェアと細胞を分析します。複合体の細胞分布を記録します。具体的には、細胞質の細胞内蛍光がグループ化されているかどうかおよび表面またはびまん性と均一なセルの近くを評価します。セルごとの相対的な蛍光強度を評価します。

3. 標識 AC 建設と⁶⁴ Cu の効率的細胞内導入効率の評価のための細胞の分別

注意: 手順 3 と 4 を含む処理や放射能の操作。これらの手順を実行する前に安全教育と自分の所属機関の放射線安全機関から承認プロトコル研究者を承認する必要があります。

注: 手順 3 と 4 を用いて mAb A14、IL 5Rα⁴¹浸潤性膀胱癌抗原のために特定であります。また、すべての実験は、時間⁶⁴Cu の半減期が短いために敏感です。一般に、それは過去の生体外で実験を実行する 1 週間待たずに最高と 72 h 以内vivo の研究。

1. 1.7 mL チューブに 10 mM の濃度 DMSO の 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic 酸 (NOTA-NHS) を中断します。
2. A14 (開始材料 2 mg) で NOTA NHS のモル超過分 50 を 0.1 M 炭酸水素ナトリウム pH 8.6 ボリューム ≤ 0.5 mL (最終 NOTA NHS 巻は総容積の 2 %v/v を超えない) 室温で 1 時間で反応します。
3. 浄化とバッファー交換 NOTA-A14 PBS、pH 7.6 (手順 1.4 参照) で限外濾過装置を使用しています。
4. その後、ChAcNLS の添付ファイルの 1.2 1.6 の手順に従います。
5. ⁶⁴CuCl₂ 0.1 M 炭酸水素ナトリウム、pH 5.5 37 ° C ≤ で 1 時間に 100 megabecquerel (MBq) と反応して NOTA-A14-ChAcNLS (250 μ g バッチ) 0.1 mL。⁶⁴Cu は CIMS ⁴²TR PET サイクロトロンで生成されます。
6. ⁶⁴Cu A14 ChAcNLS PBS ph 7.4 望ましい集中する限外濾過装置を使用しての集中 (手順 1.4 参照)。
7. 溶媒として⁶⁴Cu A14 ChAcNLS インスタントの薄層クロマトグラフィー (ITLC) によるクロマトグラフィーを用いたストリップと 0.1 M クエン酸ナトリウム pH 5.5 (ITLC 溶離液) の radiolabeling の効率を決定します。ITLC ストリップに反応液の 0.5 μ 因数を適用します。ストリップのオートラジオグラフィーを行って、デジタル画像を得る。
   1. バインドされている割合を取得して無料の⁶⁴Cu 濃度測定を実行します。無料⁶⁴cu 含有量は > 5%、前の手順に戻り、新たに浄化を実行します。
   2. さらに、集計を評価する染色 Coomassie の SDS-PAGE を実行します。SDS-2 ページ目のゲルのオートラジオグラフィー続いて radiolabeled 骨材種を判断するを実行します。
8. クオリティ チェック ポイントを結合親和性: ⁶⁴Cu A14 抱合体濃度の増加を孵化させなさい (0-100 nM) と 1 mL あたり 1 x 10⁶標的細胞複製に。非特異的結合を見積もるには、ラベルのない A14 の 100 モル過剰の存在下で細胞を⁶⁴Cu A14 抱合体の重複したサンプルをミックスします。
   1. 氷上 1 h 後、細胞を洗浄し、合計の連結抗体サンプルとガンマ カウンターの合計の非特異的結合抗体サンプル カウントします。(合計バインドされた抗体の非特異的結合抗体) の特定のバインドをグラフに対する反応性無料⁶⁴Cu A14 (nM) 試金で使用されます。グラフ作成ソフトウェアを使用して非線形回帰による解離定数 (K_d) を決定します。
9. ⁶⁴Cu 細胞蓄積研究: 100 セルを扱う⁶⁴Cu 標識 A14 の nM は 1 h、6 h の抱合体、37 ° C で 24 h 前述した³³。受容体の内在化をブロックする未修正の A14 ブロック IL 5Rα サイト、4 ° C の存在下での治療などの追加パラメーターが含まれます。
10. 定義された時間でポイント、以前に記載されている手順 2.3 - 2.3.2 として PBS 含む 0.25% トリプシンの 0.5 mL を追加、37 ° C で EDTA は続いて中和・洗浄。
11. 1% を含む膜換散バッファー内セルを孵化させなさい NP-40、10 mM Tris pH 7.5、10 mM の NaCl 3 mM で 10 分間氷の上 MgCl₂バッファー遠心 5 分 90 x g で膜分離細胞。
12. 上清を除去し、新鮮なチューブに配置します。これは細胞質画分を表します。核 3 を洗って氷冷 PBS で x 細胞質画分に洗浄を追加。
13. 核と細胞質画分を含むバイアル、シールを確認します。⁶⁴Cu カウンター校正 MBq に未加工のカウント数を変換するためにガンマに配置します。
14. 全体に豊富な細胞質蛋白質細胞ライセート、核と細胞質画分、ラミンの A/C、制限された核蛋白質 Rab7 の西部のしみの分析を実行することによって核分離の品質を決定します。
    1. 治療 5 × 10⁶細胞を免疫検定法 (RIPA) バッファーとの原形質膜の換散バッファーの 500 μ l ステップ 3.12 の含む 1%、2%、4% NP 40。さらに、孤立した核タンパク質を得るために RIPA バッファーの 500 μ L で隔離された核を扱います。
    2. -20 ° C で 60 分間冷アセトンのサンプル ボリューム x 4 を使用して分離核、細胞質、全体の細胞蛋白質の沈殿物します。10 分 13,000 × g で遠心し、蛋白ペレットが外れないように注意しながら上清をデカントします。タンパク質を溶解する pbs 100 μ L を追加します。
    3. 10 %sds ページのゲルのウェルに 10 μ g のタンパク質をロードします。1.7 1.9 で説明されているように、電気泳動を実行します。Refeference ⁴³で説明したとおりの西部のしみの転送を実行します。
    4. はしご 〜 40 kDa の MW に対応する最高のマーカーを識別します。このマーカーで半分に膜をカットします。Lamin A/C 特異抗体の高い MW 蛋白質を含んでいるしみをプローブします。ラブ 7 特異抗体の低い MW 蛋白質膜をプローブします。西部のしみはよく知られている技法であり、このプロトコルに記述されていません。

4. ペット画像腫瘍標的化の評価

注: 異所性異種移植片を生成するマウスの腫瘍細胞を植え付けることの技術は、よく知られている、ほとんどの実験室の腫瘍システムに合わせた社内のプロトコルがあります。したがって、このプロトコルでは説明しません。異種移植モデルを非肥満糖尿病/重度複合免疫不全 (NOD/SCID) マウス IL 5Rα 陽性浸潤性膀胱腫瘍 HT 1376 年および HT B9 を軸受となります。IL 5Rα 陽性浸潤性膀胱腫瘍細胞は、異種の合計セルの > 66% を占めます。対照的に、IL 5Rα 陽性 HT B9 セルの ~ 11% だけが開発した異種⁴¹に含まれていた。したがってこのモデルは、AC 予見可能な患者の腫瘍の不均一性を表す 2 つの腫瘍における腫瘍ターゲットを評価するため優秀な例を提供します。

1. ≥ を含むグループ 4 (NOD/SCID) マウスは尾静脈に⁶⁴Cu A14 ChAcNLS、 ⁶⁴Cu A14 NLS、 ⁶⁴Cu A14 の 20-30 μ g (6-9 MBq) を挿入します。
2. 同じ日に⁶⁴グラム組織 (%ID/g) あたりの注射投与量 1 秒あたり放射性カウントに変換する Cu 5 MBq を含む円柱ファントム (24.8 mL) を配置します。
3. 48 時間を待ち、2% イソフルランと酸素流量の 1.5 L/min と誘導の商工会議所にそれらを置くことによってマウスを麻酔します。誘導後、PET 装置に配置される前に、眼軟膏の無菌マウスの目に適用されます。
4. 急速にマウスをイソフルランのノーズコーンとウェットサーフスクール腹臥位で pet テーブルに転送します。呼吸の位置と直腸プローブと前述の実験中に生理学的な条件を維持するモニター温度と呼吸率は、 ⁴⁴を説明します。
5. 通常サンプリング モード設定、および 250-650 keV のエネルギー ウィンドウを使用してペットのデータ集録を開始します。通常、マウスあたり 45 分静的スキャンは復興と高品質 PET 画像の生産のための十分な一致するイベントを提供するのに十分です。
6. ⁶⁴Cu AC スキャン後にスキャナーからマウスを削除してケージに戻ってそれを置きます。マウスの動物実験施設に戻る前に十分に回復すること。
7. 三次元の最大尤度の期待値最大化アルゴリズムの 20 回の反復を使用して再構成画像を取得します。
8. 腫瘍やアミドのソフトウェアを使用して視覚的に査定できる臓器の利益 (率 ROI) 分析の領域を実行します。
   1. 3 D フリーハンド ツールの設定を使用して手動で、定量的な %ID/g データを取得する・ ロワを描画し、腫瘍または隣接する太ももの筋肉を丁寧に描きます。ROI 内のピクセルごとの数は、前の手順 4.2 から %ID/g に変換されます。
9. 腫瘍のコントラスト、および定量的投資収益率 %id:/g、腫瘍-バック グラウンド比⁶⁴Cu A14、 ⁶⁴Cu-A14-ChAcNLS、 ⁶⁴Cu A14 NLS 画像を比較します。

結果

手順 1 7 3 の建設を架橋剤は非常に信頼性の高いスルホ SMCC を使用して ChAcNLS に変更。通常、12% のゲルにロードすると SDS-PAGE を用いて、スルホ-SMCC-に-7 3 比の増加に比例して MW の区別の段階的増加で、この結果 ChAcNLS を個別に評価する重く、軽鎖は、使用し、活用 (図 3)。7 G 3 は、10、20、25、および 50-1 スルホ-SMCC-に-7 3 比 Rf 測定と MW 外挿結果 3、7、10、および 7 3 あたり 20 ChAcNLS 分子に反応しました。デンシトメトリーによる、パーセントのモノマー種は > 90 %7 3 3 10 ChAcNLS に変更です。7 G 3 ChAcNLS₂₀集計の種は 45% です。これは SDS のページはシンプルながら、7 G の 3 ChAcNLS を選択するための効果的な共役発展のためについて説明します。抗体糖鎖により発生する可能性が抗体鎖を持つわずかなスミアがこの集計の種の同定には干渉しません。

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ディスカッション

抗がん剤の全身配信の主な目標は、腫瘍部位でがん細胞内取り込み蓄積を増加して健全なティッシュの不必要な副作用を減らすです。腫瘍細胞に分子のペイロードの AC ターゲット配信は、治療し、腫瘍を検出する非常に有望なアプローチです。ただし、有効性の欠如は、エンドソームわなに掛ける事によって引き起こされ、ストリーム ライソゾーム劣化を重要な課題のまま。このプロトコルは、ACs の次世代の建設のための例として ChAcNLS ペプチドを利用して、記載されている手順は細胞内配信されるペイロードの量を増やすことを目的に開発されている任意のペプチド修飾 AC に適応がん細胞を対象としました。

このプロトコルの最も重要なステップは、: 1) 識別し、高い MW を制限する集計種;2) 新鮮な細胞の細胞内蓄積を決定する分析の前に3) 細胞分別手順の品質保証の実行・ 4) ペットの腫瘍生体内ターゲットを評価するイメージングを実行します。

ウイルス由来ペプチド抗体の共役モノクローナル抗体の分子内架橋によって引き起こされる可能性が高い高...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Sulfo-SMCC	Thermo Scientific	22122	モおよびヘテロ二官能性マレイミド架橋剤は多数あります。
アミコンウルトラ0.5mL遠心	フィルターEMDミリポア	UFC505096	パックサイズは8、24、96があります。あなたのニーズに応じて選択してください。
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards	BioRad	1610375EDU 10	- 250 kDaのMulicolor組換えタンパク質。
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド	Thermo Scientific	25200056	100または500 mLの容量から選択できます。
ヤギ抗マウスIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 647コンジュゲート	Thermo Scientific	A-21235	1 - 10 μg/mL 推奨
NOTA-NHS	CheMatech	C100
Lamin A/C 抗体 (N-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-6215
Rab7 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376362
A14 mAb	BD Biosciences	555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Scientific	NP0007
2-メルカプトエタノール	Sigma Aldrich	M3148-25ML
TF-1a cells	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 培地	ATCC	ATCC 30-2001
RIPA 溶解および抽出バッファー	Thermo Scientific	89900
AMIDE 医用画像ソフトウェア	amide.sourceforge.net		完全無料でダウンロード
FluoView FV1000共焦点顕微鏡	オリンパス
Fluoviewソフトウェア	オリンパス		www.olympus-lifescience.com
ITLCストリップ	Biodex	150-771