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方法論記事

ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

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DOI:

10.3791/55449

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2017年5月14日

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1Laboratory of Cell Biology and Histology, Department of Veterinary Sciences, University of Antwerp, 2Cell Systems and Imaging Research Group (CSI), Department of Molecular Biotechnology, Ghent University, 3Department of Biochemistry , Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center

この記事について

サマリー

この論文は、細胞透過性蛍光レポーター分子5-（および - ）を使用して、生存接着細胞において、細胞内ROSレベル、ならびにミトコンドリア膜電位および形態（ミトコンドリア形態機能とも併せて参照される）の同時定量化のための、 6） - クロロメチル-2 '、7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、アセチルエステル（CM-H 2 DCFDA）およびテトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）。

要約

反応性酸素種（ROS）は、遺伝子発現、移動、分化および増殖を含む必須の細胞プロセスを調節する。しかしながら、過剰なROSレベルは、酸化ストレスの状態を誘導し、DNA、脂質およびタンパク質に対する不可逆的な酸化的損傷を伴う。したがって、ROSの定量化は、細胞の健康状態の直接プロキシミティを提供する。ミトコンドリアはROSの主要な細胞供給源および標的の1つであるため、同じ細胞におけるミトコンドリア機能とROS産生の共同分析は、病態生理学的条件における相互接続の理解を深める上で極めて重要です。したがって、細胞内ROSレベル、ミトコンドリア膜電位（ΔΨm）およびミトコンドリア形態の同時定量のために、高含量顕微鏡法に基づく戦略が開発された。これは、自動化された広視野蛍光顕微鏡法およびマルチウエルプレートで増殖させた生着細胞の画像解析および染色dを、細胞透過性蛍光レポーター分子CM-H 2 DCFDA（ROS）およびTMRM（ΔΨmおよびミトコンドリア形態）と比較した。蛍光測定法またはフローサイトメトリーとは対照的に、この戦略は、実験刺激の前後の両方で、時空間分解能の高い個々の細胞のレベルでの細胞内パラメータの定量化を可能にする。重要なことに、この方法の画像ベースの性質は、信号強度に加えて形態学的パラメータを抽出することを可能にする。組合せ特徴セットは、亜集団、細胞タイプおよび/または処置間の差異を検出するための探索的および統計的多変量データ分析に使用される。ここでは、アッセイの詳細な説明を、化学摂動後の細胞状態間の明白な識別の可能性を証明する実験例と共に提供する。

概要

細胞内ROSの濃度は、ROS生成系とROS解離系との間の動的相互作用によってきめ細かく調節される。両者の間の不均衡が酸化ストレスの状態を引き起こす。 ROSの主要な供給源には、ミトコンドリア1がある。細胞内呼吸での役割を考えると、細胞内スーパーオキシド（O 2 ・ - ）分子の大部分を担っている2 。これは、主に強い負の内部ミトコンドリア膜電位（Δψm）、 すなわちミトコンドリア過分極の条件下での電子輸送鎖の複合体1でのO 2への電子漏出に起因する。他方、ミトコンドリアの脱分極は、複数の作用様式を指し示すROS産生の増加と相関している> 6,7,8。さらに、核分裂融合機構のタンパク質のレドックス修飾によって、ROSはミトコンドリア形態を共調節する9。例えば、断片化は、ROS産生およびアポトーシスの増加と相関する10,11。繊維状ミトコンドリアは栄養飢餓および防御に関連しているミトファジー12 。細胞のROSとミトコンドリアの形態機能との複雑な関係を考えると、両者は理想的には生存細胞中で同時に定量されるべきである。これを正確に行うために、蛍光プローブCM-H 2 DCFDA（ROS）およびTMRM（ミトコンドリアΔΨmおよび形態学）で染色された付着細胞培養の自動化された広視野顕微鏡法および画像分析に基づいて、高含量画像アッセイを開発した。高含量イメージングとは、sp複数の相補的マーカーおよび自動画像解析を用いた細胞表現型に関する非同時期に豊富な（ すなわち 、多数の記述的特徴）情報。自動顕微鏡検査と組み合わせると、多くの試料を並行してスクリーニングすることができ（ すなわちハイスループット）、アッセイの統計力を高めることができます。実際、プロトコルの主な資産は、同一細胞内の複数のパラメータの同時定量化が可能であり、これは多数の細胞および条件についての定量化を可能にすることである。

プロトコルは8つの部分に分かれています（以下のプロトコールで詳細に説明されています）。1）96穴プレートに細胞を播種する。 2）ストック溶液、作業溶液およびイメージングバッファーの調製; 3）顕微鏡のセットアップ。 4）細胞にCM-H 2 DCFDAおよびTMRMを負荷する。 5）基礎的なROSレベルおよびミトコンドリアの形態機能を測定するための最初のライブイメージングラウンド; 6） tert-ブチルの添加後のラウンド2回目のイメージング誘導されたROSレベルを測定するための過酸化物（TBHP） 7）自動画像解析。 8）データ分析、品質管理、視覚化。

このアッセイは、もともとは正常ヒト真皮線維芽細胞（NHDF）のために開発されたものである。これらの細胞は大きく平らであるため、2Dワイドフィールド画像13,14におけるミトコンドリアの形態を評価するのに適しています。しかしながら、わずかな改変を加えれば、この方法は他の接着細胞タイプにも適用可能である。さらに、CM-H 2 DCFDAとTMRMの組み合わせの次に、ワークフローは、異なる分子特異性1,15を有する様々な蛍光色素対に準拠する。

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プロトコル

以下のプロトコールは、NHDF細胞について、および材料ファイルで指定されたマルチウェルプレートを使用して実施されるものとして記載されている。ワークフローの概要については、 図1を参照してください。

1.試薬の調製

  1. 10％v / vウシ胎仔血清（FBS）および100IU / mLペニシリンおよび100IU / mLストレプトマイシン（PS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補充することにより完全培地を調製する。 500mLの完全培地について、50mLのFBSおよび5mLのPSを445mLのDMEMに添加する。
  2. ハンクス平衡塩溶液（マグネシウムおよびカルシウムを含むが、フェノールレッドを含まない）を20mMのHEPESで補充することによって、HBSS-HEPES（HH）イメージングバッファーを調製する。 500mLのHHについては、10mLの1M HEPESストック溶液を490mLのHBSSに加える。 pHを確認し、必要に応じてpH 7.2に調整する。
  3. 50μgのCM-H 2 DCFDA凍結乾燥粉末を86.5℃で溶解して1mM CM-H 2 DCFDA原液を調製する。＃181; L無水DMSO。ボルテックスまたはピペットで上下に混合し、茶色のマイクロ遠心チューブで20μL分取する。 -20℃で暗所に保管し、1週間以内に使用してください。 N 2 -大気中で保存した場合、保存期間は少なくとも1ヶ月まで延長することができます。
    1. 25 mLのTMRMパウダーを50 mLの無水DMSOに溶解して1 mM TMRM原液を調製する。ボルテックスまたはピペッティングで上下に混合し、褐色のマイクロ遠心チューブで10μL分取する。 -20℃で暗所に保存する。このソリューションは少なくとも1年間は安定しています。
  4. 70％ストック溶液（10μL/ 96ウェルプレート）から容量を直接ピペッティングすることにより、すべての実験でTert-butyl peroxide（TBHP）ストック（〜7 M）の新しいアリコートを調製します。その後の使用までこのアリコートを4°Cに保つ。
  5. 2つの二次抗体（Alexa Fluor 488ロバ抗ウサギおよびCY3ロバ抗ウサギ）を1倍のHH-buで1,000倍に希釈することによって抗体ワーキング溶液（AB）を調製するffer。

2.顕微鏡と測定プロトコルの設定（±15分）

注：画像取得は、自動ステージおよびシャッターを備えた広視野顕微鏡、および20X空気計画補正対物レンズ（NA = 0.75）およびEM-CCDカメラを使用するハードウェアベースのオートフォーカスシステムを用いて行われる。最初にアッセイを設定する場合、プロトコルの指示に従って染色された対照細胞を含有する試験プレートを使用して、XYステージを較正し、獲得設定を最適化する。取得設定が既に決定されている場合、キャリブレーションは空のプレートを使用して行うことができます。

  1. 対物レンズを絶対ベースレベルに下げ、ソフトウェア指示に従ってXYステージをキャリブレーションします。
  2. 正しいフィルタキューブがインストールされていることを確認してください。 CM-H 2 DCFDAを可視化するには、472/30 nm励起バンドパスフィルター、495 nmカットオフダイクロイックicミラーと520/35 nmバンドパスエミッションフィルターを備えています。 TMRMでは、540/25 nm帯域通過励起フィルター、565 nmカットオフダイクロイックミラー、605/55 nm帯域通過フィルターを使用したTRITC用フィルターキューブを使用します。
  3. 取得ソフトウェアを使用してイメージングプロトコルを作成します。
    1. ソフトウェア内に用意されている使用可能なプレートのリストから、正しいタイプのマルチウェルプレート（メーカーおよびコード）を選択します。または、プレートとウェルの寸法を使用して独自のマルチウェルプレートフォーマットを定義します。
    2. ソフトウェアの指示に従って、 例えば 4つの外側コーナーウェルの2つのコーナーを定義することによって、ウェルプレートを整列させる。このステップはカメラの向きの変化をカバーします。
    3. 取得する必要があるウェルを選択します。ソフトウェアでこのオプションを使用できない場合は、選択したウェルに対応する手動で定義されたXY位置のセットを使用します。
    4. thの取得設定（露光時間、ランプ強度、EMゲイン）を最適化する2つのチャンネルを別々にテストプレートを使用して測定します。蛍光励起光そのものがROSを誘発するので、露出と強度を最小限に抑えます。しかし、TBHP処理前のシグナル対バックグラウンド比が基底CM-H 2 DCFDAについて少なくとも2、TMRMについて3であり、TBHP処理後に飽和がないことを確認する。取得設定は、使用される顕微鏡の設定および細胞の種類に大きく依存するが、光源として130Wの金属ハロゲン化物電球およびプロトコールの指示に従って染色されたNHDF細胞を使用する場合の参照設定は以下の通りである： H 2 DCFDAおよびTMRMの露光時間は200ms、NDフィルタ8は15（13MHz; 14ビット）および4（27MHz; 14ビット）のEMゲインと組み合わせて使用​​されます。特定のセットアップとセルタイプに最適化されたら、このステップをスキップすることができます。
      注：イメージングプロセス全体を通して取得設定を同じに保つことが不可欠です。大規模な、複数日の実験では、ランプスタンド通常の品質管理によって保証されるべきである。
    5. 連続したラムダ（波長）取得からなる取得プロトコルを定義します。測定前に露光量を最小限に抑えるには、最初に取得するCM-H 2 DCFDAチャネルを選択します。
    6. well-plateループを定義して、2.3.4で定義した取得プロトコルを使用して、ウェル選択の各ウェルの中心の周りに配置された、規則的に間隔を置いて配置された4つの重複しない画像を取得する。井戸B02からB11へ、次に右から左へ、ウェルC11からC02へ、蛇行する画像取得（左から右へ）を選択します（ 図2A ）。これにより、左から右の画像取得と比較して時間が節約されます。このオプションがソフトウェアで使用できない場合は、2.3.3で作成したXY位置のカスタムセットを調整して、このイメージングパターンを適用します。
    7. イメージング位置のXY座標を（ 例えば 、別のXMLファイルに）保存して、容易に再訪できるようにする顕微鏡の再較正の場合には、これは、このアッセイからの読み出しが同じ細胞についての事後免疫蛍光（IF）染色と相関しなければならない場合に特に重要である。

3 。 96ウェルプレート中の細胞の播種（異なる細胞株の数に依存して45〜90分）

  1. クラス2のバイオセーフティキャビネットなどの無菌環境で作業し、手袋を着用する。
  2. 蒸留水中70％v / vエタノールを使用して、すべての表面と材料を除染する。
  3. 培養器から90％コンフルエントな細胞培養液を入れた細胞培養フラスコを取り出し、バイオセーフティキャビネットに入れます。
  4. 細胞をPBS 1xで2回洗浄する。
  5. 適切な量​​の0.05％トリプシン-EDTA溶液を細胞に添加し、完全な細胞表面が覆われていることを確認し（ 例えば 、T25フラスコについては1mL）、37℃および5％CO 2で2分間インキュベートする。
  6. すべての細胞が分離されている場合（顕微鏡で確認する ）、培養培地（DMEM + 10％FBS + 1％ペニシリン - ストレプトマイシン; T25フラスコ中±4mL）を加えてトリプシン-EDTA溶液を不活性化する。
  7. 室温で300 xgで5分間遠心分離する。
  8. 上清を捨て、細胞ペレットを培地に再懸濁する。細胞計数と適合する細胞濃度を得るために、各細胞タイプの培地の量を決定する。典型的には、NHDFの90％コンフルエントなT25フラスコは約1~1.5百万の細胞を含み、これを3~4mLの培地に再懸濁する。
  9. 細胞カウントチェンバーまたはコールターカウンターを使用して細胞を数える。
  10. 薄い連続ポリスチレンまたはガラス底面を有する黒色96ウェルプレート（画像化中に隣接するウェル間の散乱およびクロストークを回避するために黒色）を有する黒色96ウェルプレートの内部60ウェルのそれぞれに8,000〜10,000細胞を種蒔ける。異なる条件/処理/細胞株を使用する場合、プレート効果を最小限に抑えるように、プレート上にそれらの播種位置を均一に分配する（図2A）。ウェルB01およびA01を除いた外側のウェルは、エッジ効果がより起こりやすいので使用されない。
  11. B01に8,000〜10,000個の細胞を播種する。この井戸は、画像取得の直前に、焦点調整のために使用される。
  12. 空の外側ウェルに培地を充填し、ウェルと環境との間の勾配（温度、湿度など ）を最小化する。
  13. 静かにプレートを3回タップしてからインキュベーターに戻し、細胞の増殖を避けます。
  14. 細胞を24時間培養するか、またはコンフルエンス程度まで培養する。 70％。
  15. 実験用の治療情報を「Setup.xlsx」というスプレッドシートに保存します。このファイルには4つの列が含まれており、データ分析中にウェルと画像情報との処理をリンクするために使用されます。 4つの列は、「ウェル」、「治療番号」、「治療」および「コントロール」（ウェルあたり1列）である。すべての治療が結合されるプロットのX軸上の処理の順序を決定するためにデータ視覚化の間に使用される固有の処理番号を有する。 control-columnは、現在の行の処理の制御として機能する処理を指定します。典型的な実験レイアウトと対応するセットアップファイルの図を図2に示します。

CM-H 2 DCFDAおよびTMRMを用いた細胞のローディング（±45分）

注：実験当日の細胞の取り扱いは、滅菌環境（バイオセーフティキャビネット）で行うことができますが、アッセイ後に細胞を廃棄または固定するため、これは必須ではありません。

  1. HH緩衝液を37℃に加熱する。
  2. HHバッファー（50μLのHHバッファーを10μLのTMRMストック溶液の1つのアリコートに加える）中で1mMストック溶液を50倍に希釈することにより、20μMTMRM作業溶液を調製する。
  3. 負荷を準備する2μMのCM-H 2 DCFDAおよび100nMのTMRMを含む溶液に添加した。この目的のために、1mM CM-H 2 DCFDA原液500倍および20μMTMRM作動液をHH緩衝液中で200倍に希釈する。
    1. 典型的には、60ウェルに対して、CMH- 2 DCFDA15μLおよびTMRM溶液37.5μLをHH7447.5μLに添加することにより、7.5mLのローディング溶液を調製する。
  4. プレートを逆さまにして単一の液体の動きで細胞から培地を捨てる。
  5. マルチチャンネルピペット（100μL/ウェル）を用いて、HH緩衝液で細胞を2回静かに洗浄する。洗浄工程の間にHH緩衝液を捨て、プレートを1回の流体の動きで上下逆さまにします。
  6. 再度、マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルに100μLのローディング溶液を添加することにより、CM-H 2 DCFDAおよびTMRMを細胞に負荷する。室温で暗所で25分間インキュベートする。 B01をよく忘れないでください。
  7. これらの25分間、酸化剤TBHPの作業溶液を調製し、顕微鏡およびアクセサリのハードウェアがオンになっていることを確認します。
    1. 作業用溶液Iを調製する：7Mストック溶液を100mMに希釈する（690μLのHH緩衝液中10μLのストック）。
    2. 作業溶液IIを調製する：WS 100xを1mMに希釈する（990μLHH緩衝液中10μLWS I）。
    3. 作業溶液IIIを調製する：WS III 25xを40μMに希釈する（60ウェルについては、7200μLHHバッファー中に300μLWS IIを加える）。
  8. 25分後、前述のように100μLのHH緩衝液で細胞を2回洗浄する。
  9. 100ウェルのウェルに100μLのHH緩衝液を添加する。

5.基礎的なROSレベルとミトコンドリアのモルフォファンクションを測定するための最初のライブイメージングラウンド（±15分）

  1. 取得ソフトウェアが動作しており、イメージングプロトコルがロードされていることを確認してください。
  2. プレートを顕微鏡に取り付け、ハードウェアの電源を入れるTMRMチャネルを使用してオートフォーカスオフセットを調整するには、B01をよく使用してください。この手順はCM-H 2 DCFDAシグナル強度の増加を誘導するので、この井戸は下流の画像解析から除外される。
  3. イメージングプロトコルを実行します。

6.誘発されたROSレベル（±20分）を測定するためのTBHPの添加後の2回目のライブイメージング

  1. 慎重に顕微鏡から96ウェルプレートを取り出します。
  2. マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに100μLのTBHP WS III（40μM）を添加する（これはウェル中に20μMのTBHP濃度をもたらす）。この化合物は、誘導されたROSレベルを測定する手段と同様に、CM-H 2 DCFDA染色（シグナルが上昇すべきである）のための内部陽性対照として使用される。
    注記：H 2 O 2はTBHPの代わりに使用することもできますが、この化合物は安定性が低く、信頼性が低くなります。
  3. TBHP wを完全に反応させるために少なくとも3分間待つi番目のCM-H 2 DCFDA。
  4. この間、100μLの抗体作業溶液（1 / 1,000）をウェルA01に添加する。
  5. プレートを顕微鏡に戻し、ウェルB01を使用して再度焦点を確認します。
  6. 同じイメージングプロトコルを使用して、最初のイメージングラウンドと同じ位置を取得します。
  7. 取得されたデータセットを単一のフォルダにエクスポートし、標準化された命名法を使用して、個々のTIFFファイルとしてエクスポートする。プレート名、TBH前またはTBH処理、ウェル、フィールドおよびチャネルをアンダースコアで区切って参照する。この情報は、画像分析（ 例えば 、適切なセグメンテーション設定の選択）のために、ならびにデータ分析中（分析データを接続するために）に使用される（「P01_Pre_B02_0001_C1」、プレート1、TBHP前処理、ウェルB02、正しい治療法を用いて）。
  8. 収集プロトコルを使用して、ウェルA01の中心のまわりの4つの位置の両方のチャネルについて、フラットフィールド画像を取得する。 thを保存次の標準化された命名法を使用して、他の画像と同じフォルダ内の個別のTIFFファイルとして、プレート1、フィールド1、およびチャネル1に「P01_FF_A01_0001_C1」を追加します。飽和の場合は、より低い濃度の抗体作業溶液を使用してください。
  9. プレートを捨てるか、さらに処理するために保存してください。
    注：顕微鏡からプレートを取り外し、マルチチャンネルピペットを使用してTBHP溶液を添加する代わりに、顕微鏡ステージに自動ピペットを取り付け、トリガーを受けて機能するように取得ソフトウェアに接続することができます。これにより、次のウェルに移動する前に、最初の取得後すぐに各ウェルにTBHPを添加することができます。このようにして、第1のイメージングラウンドが終了すると、第2のイメージングラウンドがすぐに開始され、全てのウェルがTBHPと等しいインキュベーション時間を有するであろう。

7.画像処理と解析（±30分/96ウェルプレート）

注：すべての画像処理は、ImageJフリーウェアのパッケージ版であるFIJI（http://fiji.sc）で実行されます。細胞内ROSおよびミトコンドリアシグナルの自動分析、ならびに形態学的パラメーター（RedoxMetrics.ijm、要求に応じて入手可能）のための専用のスクリプトが作成された。根底にあるアルゴリズムは、Sieprath et al。 1 。

  1. FIJIがインストールされ、操作可能であることを確認します。
  2. FIJIを起動し、マクロセットをインストールします（プラグイン - >マクロ - >インストール...）。これは、 図3Aに示すように、解析設定を最適化する一連のアクションツールと同様に、多数の新しいマクロコマンドを呼び出すでしょう。
  3. セットアップインターフェースを開き、 'S'ボタン（ 図3B ）をクリックして分析設定を設定します。
    1. 使用した画像タイプ、チャンネル数、ウェルを選択してくださいフラットフィールド画像を取得する。
    2. どのチャネルに細胞（CM-H 2 DCFDAチャネル）またはミトコンドリア（TMRMチャネル）が含まれているかを示し、画像品質に応じて各チャネルの前処理およびセグメンテーションパラメータを調整する（ 図3B ）。 「背景」チェックボックスおよび「コントラスト」チェックボックスを選択すると、それぞれ背景減算またはコントラスト限定適応ヒストグラム等化16が実行される。細胞のガウスぼやけのシグマとミトコンドリアのラプラシアン増強を定義する。自動閾値アルゴリズムを選択し、サイズ除外限度（ピクセル単位）を入力します。自動しきい値アルゴリズムの代わりに固定しきい値を選択した場合は、上限しきい値を入力します。
    3. 取得したデータセットのいくつかの選択された画像のセグメンテーション設定をテストし、それらを開いて、それぞれ細胞またはミトコンドリアのセグメンテーションのメニューで 'C'または 'M'必要に応じて設定を調整してください。一例の結果を図3Cに示す 。
  4. [＃]ボタンをクリックし、画像が保存されているフォルダを選択して、該当するフォルダのバッチ分析を実行します。フォルダごとに、画像ごとに個別のROIセット（zipファイル）と結果ファイル（.txt）を含む新しい '出力'ディレクトリが作成されます。両方のチャネルについて、結果ファイルには強度および形態記述子が含まれています。 CM-H 2 DCFDAチャネル（セル）結果ファイルは、記述子ごとに、1つの画像内の結合されたROIの平均値を含む。 TMRMチャネルの場合、結果ファイルには、個別にセグメント化されたミトコンドリアROIごとの値がディスクリプタごとに含まれています。
  5. バッチ分析後、 'V'ボタンをクリックすると、それぞれのROIオーバーレイを持つすべての画像のハイパースタックである '検証スタック'でセグメント化のパフォーマンスを視覚的に確認できます。このようにして、/アンダーグラジェティング、画像の焦点が合っていない画像、またはゴミ粒子/ファイバーは、すでにすばやく検出できます。データの品質管理（§8参照）中にさらにキュレーションを行うことができます。

8.データ分析、品質管理（QC）、可視化

生データの処理と分析は、R統計的フリーウェア（http://www.rproject.org - バージョン3.3.2）とRStudio（http://www.rstudio.com/ - バージョン1.0.44）を使用して行われます。結果を迅速に取得して可視化するために、ヒートマップとボックスプロットのデータを統合して可視化し、統計分析も実行する、直感的なShinyアプリケーション17 （要望に応じて利用可能）が考えられています。一般に、ワークフローは2つの連続するステップからなる。まず、96ウェルプレートごとにデータを処理して検査し、異常データポイントを検出する。第2に、所与の実験の全てのプレートからの選別されたデータを組み合わせ、ノンパラメトリックマルチ変量テスト18および主成分分析。

  1. RとRStudioがインストールされ、操作可能であることを確認してください。
  2. RStudioを起動します。
  3. RedoxMetricsの光沢のあるアプリケーションを開き、アプリケーションを実行します（外部ブラウザで実行することを選択します）。
  4. 「入力」ページで、RedoxMetrics.ijmの結果ファイルが置かれているディレクトリを選択します。
  5. このディレクトリ内に「Setup.xlsx」（手順3.15で作成）が存在することを確認してください。
  6. 結果ファイルと設定情報は自動的にインポート、再配置、視覚化されます。
    1. 「実験設定」ページには実験のレイアウトが表示されます。確認のためにこのページを使用してください。
    2. 次のページ、「プレートごとの結果」は、色分けされたマルチウェルプレートレイアウトでの各プレ​​ートのデータとウェル名とイメージ番号でラベル付けされたアウトライアーを伴うボックスプロットで個別にデータを示します。後者は、容易な検査とident異常データポイントの特定（その特定の治療法で測定された平均値と比較して極めて高い値または低い値 - 例については図4を参照）。
      この情報を使用して、異常な点に対応する画像を確認します。異常が検出された場合は、分析から除外する必要があります。ほとんどの異常は、画像の一部がピントの合っていない場合、または蛍光塵粒子が適切なセグメンテーションを妨げる場合に不適切なセグメンテーションによって引き起こされます。極端なケースは、検証スタックツール（ステップ7.5）を使用してすぐに検出することができますが、このステップではさらに微妙な事象が検出されます。異常値に関して明らかな理由または技術的理由が見つからない場合、画像を分析から除去すべきではない。
    3. オプション：「Drop.xlsx」という新しいスプレッドシートを作成し、「Drop」という1つの列だけを作成します。この列には、すべての画像のファイル名（拡張子「.tif」を含む）分析（ステップ7.5またはステップ8.6.2で特定）から取り除かなければならない。このファイルを '入力'ページでアップロードします。
    4. 「結果全体実験」ページには、すべてのプレートを組み合わせた結果が表示されます。ドロップファイルがアップロードされた場合、このファイルは分析から指定されたデータポイントを削除するために使用されます。
      個々のパラメータごとに、データは、それぞれのコントロールに従ってプレートごとに正規化される。次いで、すべてのプレートからのデータを組み合わせ、続いてnparcompパッケージ18からの非パラメトリック多変量試験を行う。 2つの処置のみを比較すると、ノンパラメトリックなBehrens-Fisher問題の2つのサンプル・テストが実行されます。 3つ以上の治療については、非パラメトリックコントラストベースの多重比較試験が用いられる。結果はボックスプロットを使用して視覚化されます。
    5. 「クラスタ解析」ページには、主成分分析（PCA-Rコアの統計パッケージ）の結果が表示されます。 5つのパラメータからのデータ（baサルおよび誘導ROS、およびミトコンドリア膜電位、大きさおよび真円形）を組み合わせて、敏感なレドックスプロファイルに基づいて異なる治療法を識別する。この目的のために、主成分分析（PCA）が行われる（R core 'stats'パッケージ）。結果は、biplot（ggbiplotパッケージ - http://github.com/vqv/ggbiplot）を使用して視覚化されます。
    6. 「データのダウンロード」ページを使用して、処理され再配置されたデータを含むバックエンドデータフレームをダウンロードし、より高度なデータの視覚化または統計分析に再利用できるようにします。
      注記：一般的な落とし穴や潜在的な解決策を表1に示します。

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結果

アッセイはいくつかの対照実験を用いてベンチマークされており、その結果はSieprath et al。 1 。要するに、CM-H 2 DCFDAおよびTMRMの細胞内ROSおよびΔψmの外から誘導された変化に対する蛍光応答を定量化して、ダイナミックレンジを決定した。 CM-H 2 DCFDAについて、NHDFは、10μM〜160μMの範囲のTBHPの濃度を増加させて処理した場合、蛍光シグナルの線形増加を示した。同様に、TMRMについて、NHDF細胞は、1〜10μg/μLの範囲内の増加する濃度のオリゴマイシン（ΔΨm過分極を誘発する）で処理した場合、ミトコンドリア蛍光の線形増加を実証した。逆に、ΔΨmの脱分極を誘発する抗生物質であるバリノマイシンのリアルタイム添加は、徐々に、定量的になったTMRM蛍光の明らかな減少。

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ディスカッション

本稿では、NHDFにおける細胞内ROSレベルとミトコンドリア機能の同時定量化のための高含量顕微鏡法について述べる。その性能は、SQV処理NHDFに関する事例研究によって実証された。この結果は、19,20,21,22,23,24,25の別個の実験ではあるが、1型HIVプロテアーゼ阻害剤による治療後に、ROSレベルまたはミトコンドリア機能障害の増加が観察された文献からの以前の証拠を裏付けている。重要な違いは、記載されたアッセイが形態細胞データと共に同じ生きた細胞内でこれらのパラメータを同時に測定できることである。このアプローチの主な利点は、スペースとtの両方の要素を明確に決定することですこれは、因果関係を正確に示すことができます。特定の摂動の敏感なレドックスプロファイルを生成することを可能にする主成分分析が行われる。しかし、より高度なデータマイニング技術および（監督された）クラスタリングアルゴリズムを、予測されるレドックスプロファイリングを可能にするために抽出されたデータに使用することもできる。これは、デジタル病理学における診断または予後分類ツール、ならびに治療標的のスクリーニングにおいて価値ある特徴であり得る。 例えば ...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益または他の利益相反はないと述べている。対応する著者はまた、すべての著者がすべての利益相反を開示するよう頼まれていることを保証する。

謝辞

この研究は、アントワープ大学(TTBOF/29267, TTBOF/30112)、ゲント大学特別研究基金(プロジェクトBOF/11267/09)、NB-Photonics(プロジェクトコード01-MR0110)、オランダ科学研究機構(NWO;いいえ:CSBR09 / 013V)。この原稿の一部は、Springerの許可を得て、別の出版物1から改作されています。著者らは、広視野顕微鏡の支援についてGeert Meesenに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
テトラメチルローダミン、メチルエステル、過塩素酸塩(TMRM)サーモフィッシャーサイエンティフィックT668
CM-H2DCFDA(一般酸化ストレスインジケータ)サーモフィッシャーサイエンティフィC6827
メチルスルホキシドシグマ)アルドリッチD8418
MatriPlate 96ウェルガラス底マイクロウェルプレート630 µL-ブラック 0.17 mm 低ガラス蓋付きブルックス ライフサイエンス システムMGB096-1-2-LG-L
HBSS フェノール レッド 500 mLロンザBE10-527F
DMEM 高グルコース L-グルタミンロンザBE12-604F
リン酸塩ブフェッド生理食塩水 (PBS) w/o Ca および MgロンザBE17-516F
HEPES 1 M 500 mLロンザ17-737F
トリプシン-バーセン (EDTA) 溶液ロンザBE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 フラグメント ロバ 抗ウサギ IgG (H+L)ジャクソン711-166-152フラットフィールド画像取得用抗体
アレクサ フルオア 488 アフィニピュア F(ab')2 フラグメント ロバ 抗ウサギ IgG (H+L)ジャクソン711-546-152フラットフィールド画像取得用抗体
名前会社名カタログ番号コメント
Equipment
Nikon Ti eclipse 広視野顕微鏡ニコン
パーフェクトフォーカスシステム (PFS)ニコンハードウェアベースオートフォーカスシステム
CFI Plan Apo Lambda 20X objectiveニコン
名/企業カタログ番号コメント
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS moduleNikonこのソフトウェアは、顕微鏡を操縦し、自動画像取得プロトタイプ
ImageJ(FIJI)バージョン2.0.0-rc-43 / 1.50g
RStudioバージョン1.0.44Rstudio
Rバージョン3.3.2
ックジ、、をプログラム/実行するために使用されます

参考文献

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