ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

Summary

この論文は、細胞透過性蛍光レポーター分子5-（および - ）を使用して、生存接着細胞において、細胞内ROSレベル、ならびにミトコンドリア膜電位および形態（ミトコンドリア形態機能とも併せて参照される）の同時定量化のための、 6） - クロロメチル-2 '、7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、アセチルエステル（CM-H ₂ DCFDA）およびテトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）。

Abstract

反応性酸素種（ROS）は、遺伝子発現、移動、分化および増殖を含む必須の細胞プロセスを調節する。しかしながら、過剰なROSレベルは、酸化ストレスの状態を誘導し、DNA、脂質およびタンパク質に対する不可逆的な酸化的損傷を伴う。したがって、ROSの定量化は、細胞の健康状態の直接プロキシミティを提供する。ミトコンドリアはROSの主要な細胞供給源および標的の1つであるため、同じ細胞におけるミトコンドリア機能とROS産生の共同分析は、病態生理学的条件における相互接続の理解を深める上で極めて重要です。したがって、細胞内ROSレベル、ミトコンドリア膜電位（ΔΨm）およびミトコンドリア形態の同時定量のために、高含量顕微鏡法に基づく戦略が開発された。これは、自動化された広視野蛍光顕微鏡法およびマルチウエルプレートで増殖させた生着細胞の画像解析および染色dを、細胞透過性蛍光レポーター分子CM-H ₂ DCFDA（ROS）およびTMRM（ΔΨmおよびミトコンドリア形態）と比較した。蛍光測定法またはフローサイトメトリーとは対照的に、この戦略は、実験刺激の前後の両方で、時空間分解能の高い個々の細胞のレベルでの細胞内パラメータの定量化を可能にする。重要なことに、この方法の画像ベースの性質は、信号強度に加えて形態学的パラメータを抽出することを可能にする。組合せ特徴セットは、亜集団、細胞タイプおよび/または処置間の差異を検出するための探索的および統計的多変量データ分析に使用される。ここでは、アッセイの詳細な説明を、化学摂動後の細胞状態間の明白な識別の可能性を証明する実験例と共に提供する。

Introduction

細胞内ROSの濃度は、ROS生成系とROS解離系との間の動的相互作用によってきめ細かく調節される。両者の間の不均衡が酸化ストレスの状態を引き起こす。 ROSの主要な供給源には、ミトコンドリア^1がある。細胞内呼吸での役割を考えると、細胞内スーパーオキシド（O ₂ ^{・ -} ）分子の大部分を担っている² 。これは、主に強い負の内部ミトコンドリア膜電位（Δψm）、 すなわちミトコンドリア過分極の条件下での電子輸送鎖の複合体1でのO ₂への電子漏出に起因する。他方、ミトコンドリアの脱分極は、複数の作用様式を指し示すROS産生の増加と相関している> 6,7,8。さらに、核分裂融合機構のタンパク質のレドックス修飾によって、ROSはミトコンドリア形態を共調節する9。例えば、断片化は、ROS産生およびアポトーシスの増加と相関する^10,11。繊維状ミトコンドリアは栄養飢餓および防御に関連しているミトファジー¹² 。細胞のROSとミトコンドリアの形態機能との複雑な関係を考えると、両者は理想的には生存細胞中で同時に定量されるべきである。これを正確に行うために、蛍光プローブCM-H ₂ DCFDA（ROS）およびTMRM（ミトコンドリアΔΨmおよび形態....

Protocol

以下のプロトコールは、NHDF細胞について、および材料ファイルで指定されたマルチウェルプレートを使用して実施されるものとして記載されている。ワークフローの概要については、 図1を参照してください。

1.試薬の調製

1. 10％v / vウシ胎仔血清（FBS）および100IU / mLペニシリンおよび100IU / mLストレプトマイシン（PS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補充することにより完全培地を調製する。 500mLの完全培地について、50mLのFBSおよび5mLのPSを445mLのDMEMに添加する。
2. ハンクス平衡塩溶液（マグネシウムおよびカルシウムを含むが、フェノールレッドを含まない）を20mMのHEPESで補充することによって、HBSS-HEPES（HH）イメージングバッファーを調製する。 500mLのHHについては、10mLの1M HEPESストック溶液を490mLのHBSSに加える。 pHを確認し、必要に応じてpH 7.2に調整する。
3. 50μgのCM-H ₂ DCFDA凍結乾燥粉末を86.5℃で溶解して1mM CM-H ₂ DCFDA原液を調製する。＃181; L無水DMSO。ボルテックスまたはピペットで上下に混合し、茶色のマイクロ遠心チューブで20μL分....

Results

アッセイはいくつかの対照実験を用いてベンチマークされており、その結果はSieprath et al。 ¹ 。要するに、CM-H ₂ DCFDAおよびTMRMの細胞内ROSおよびΔψmの外から誘導された変化に対する蛍光応答を定量化して、ダイナミックレンジを決定した。 CM-H ₂ DCFDAについて、NHDFは、10μM〜160μMの範囲のTBHPの濃度を増加させて処理した場合、蛍光シグナルの線形増加を示した。同様に、TMRMについて、NHDF細胞は、1〜10μg/μLの範囲内の増加する濃度のオリゴマイシン（ΔΨm過分極を誘発する）で処理した場合、ミトコンドリア蛍光の線形増加を実証した。逆に、ΔΨmの脱分極を誘発する抗生物質で_あるバリノマイシンのリアルタイム添加は、徐々に、定量的になったTMRM蛍光の明らかな減少。

Discussion

本稿では、NHDFにおける細胞内ROSレベルとミトコンドリア機能の同時定量化のための高含量顕微鏡法について述べる。その性能は、SQV処理NHDFに関する事例研究によって実証された。この結果は、19,20,21,22,23,24,25の別個の実験ではあるが、1型HIVプロテアーゼ阻害剤による治療後に、ROSレベルまたはミトコンドリア機能障害の増加が観察された文献からの以前の証拠を裏付けている。重要な違いは、記載されたアッセイが形態細胞データと共に同じ生きた細胞内でこれらのパラメータを同時に測定できることである。このアプローチの主な利点は、スペースとtの両方の要素を明確に決定することですこれは、因果関係を正確に示すことができます。特定の摂動の敏感なレドックスプロファイルを生成することを可能にする主成分分析が行われる。しかし、より高度なデータマイニング技術および（監督された）クラスタリングアルゴリズムを、予測されるレドックスプロファイリングを可能にするために抽出されたデータに使用することもできる。これは、デジタル病理学における診断または予後分類ツール、ならびに治療標的のスクリーニングにおいて価値ある特徴であり得る。 例えば .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬
テトラメチルローダミン、メチルエステル、過塩素酸塩(TMRM)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	T668
CM-H2DCFDA(一般酸化ストレスインジケータ)	サーモフィッシャーサイエンティフィ	C6827
メチルスルホキシ	ドシグマ)アルドリッチ	D8418
MatriPlate 96ウェルガラス底マイクロウェルプレート630 µL-ブラック 0.17 mm 低ガラス蓋付き	ブルックス ライフサイエンス システム	MGB096-1-2-LG-L
HBSS フェノール レッド 500 mL	ロンザ	BE10-527F
DMEM 高グルコース L-グルタミン	ロンザ	BE12-604F
リン酸塩ブフェッド生理食塩水 (PBS) w/o Ca および Mg	ロンザ	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	ロンザ	17-737F
トリプシン-バーセン (EDTA) 溶液	ロンザ	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 フラグメント ロバ 抗ウサギ IgG (H+L)	ジャクソン	711-166-152	フラットフィールド画像取得用抗体
アレクサ フルオア 488 アフィニピュア F(ab')2 フラグメント ロバ 抗ウサギ IgG (H+L)	ジャクソン	711-546-152	フラットフィールド画像取得用抗体
名前	会社名	カタログ番号	コメント
Equipment
Nikon Ti eclipse 広視野顕微鏡	ニコン
パーフェクトフォーカスシステム (PFS)	ニコン		ハードウェアベースオートフォーカスシステム
CFI Plan Apo Lambda 20X objective	ニコン
名	/企業	カタログ番号	コメント
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module	Nikon		このソフトウェアは、顕微鏡を操縦し、自動画像取得プロトタイプ
ImageJ(FIJI)バージョン2.0.0-rc-43 / 1.50g
RStudioバージョン1.0.44	Rstudio
Rバージョン3.3.2