光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Summary

ここでは、CD11c.DTRマウスの気管内ジフテリア毒素処理によって誘発される、無菌性劇症性心筋炎のネズミモデルにおける心臓のCD45 ⁺白血球浸潤を視覚化するための薄片顕微鏡法を説明する。

Abstract

Light-sheet fluorescence microscopy（LSFM）は、化学的クリアリングプロトコールと組み合わせて、大きな生物学的試料中の蛍光標識された構造を分析するためのゴールドスタンダードとなっており、細胞分解能に達しています。その一方で、基礎となるプロトコルの絶え間ない改良と特殊な商用システムの利用性の向上により、マウスの器官全体の微細構造を調べることができ、様々な生存細胞イメージングアプローチにおける細胞の挙動の特徴づけまで可能にしました。ここでは、炎症を起こしたマウスの心臓におけるCD45 ⁺白血球集団の空間的全マウント視覚化および定量化のためのプロトコルを説明する。この方法は、致命的な心臓不整脈を特徴とする致命的な致死性心筋炎の発達の研究のための頑強な誘導性モデルとして機能することが最近示されているトランスジェニックマウス株（CD11c.DTR）を使用する。このプロトコルには、心筋炎の誘導、腹腔内アル抗体媒介性細胞染色、器官調製、およびその後のコンピュータ支援画像後処理を伴うLSFMを含む。我々の特定の科学的な問題に高度に適合した方法として提示されているが、プロトコールは、他の臓器および他の種においても全く異なる蛍光構造を標的とすることができる容易に調節可能なシステムの青写真を表す。

Introduction

光学顕微鏡の進化の間、多くの特殊な形態が現れ、それらの全てが特定の標本の視覚化プロセスの限界を最小限に抑えるために開発された。このような方法の1つは、薄シート蛍光顕微鏡法（LSFM）である。最初にSiedentopfとZsigmondy ¹によって1903年に開発され、1990年代初頭の最初の基本的な生物学的応用を発見した2。LSFMは、蛍光シグナルの分解能を持つ無傷のマウス器官などの大きな標本の視覚化のための最も強力な顕微鏡ツール細胞レベルまで低下する。これらの利点のために、生存細胞イメージングの可能性と組み合わせて、Nature MethodsはLSFMを「2014年の方法」 ^3と名付けました。

名前が示唆するように、LSFMでのサンプル照明は、使用される対物レンズの軸に垂直に向けられた光シートによって行われますまたは発光光収集およびその後の画像形成を含む。光シートは、通常、シリンドリカルレンズを用いて広いコリメートされたレーザビームを集束することによって、またはただ1つの水平または垂直平面^{4,5 において}狭く集束されたレーザビームの迅速な横方向移動によって生成される。このようにして、結像光学系の焦点面のみが、典型的には1~4μmの厚さで照明される。その結果、照明面に置かれた蛍光試料については、散乱光の生成と....

Protocol

すべての動物実験はEUのガイドラインに従って実施され、エッセン（AZ 84-02.04.2014.A036 - LandesamtfürNatur、Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen、Essen、Germany）の関連する地方当局によって承認された。動物を使用し、特定の病原体不含（SPF）条件下で飼育した。

ジフテリア毒素（DTX）による心筋炎の誘導

1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でDTXストック溶液を希釈して1μg/ mLの作業溶液にすることにより、心筋炎の誘導のためのDTX溶液を調製する。
2. Hasenberg らが示すように、この溶液100μLを8-10週齢のCD11c.DTRマウス（ 約 5 ng / g体重（bw））に気管内投与する。真菌の胞子懸濁液の適用²⁰ 。
   注：毒素の腹腔内適用は、致命的な心筋炎。しかし、このアプローチはまず検証されなければならない。
   1. それを適用するために、ケタミン100mg / kgおよびキシラジン10mg / kgの腹腔内（腹腔内）注射によって動物を麻酔する。
   2. 深刻な麻酔（トウピンチ試験）に達した後、22Gの留置静脈カテーテルを口腔に通して動物に挿管する。 H....

Results

提示されたLSFMアプローチは、重篤な心筋炎の誘導時のマウス心臓の白血球分布および量を分析する。 図1Aは、心筋炎誘導のためのトランスジェニックCD11c.DTRマウスの前処理プロトコールを説明する。このステップは、白血球の心筋への動員に必要な引き金を表す。成功したDTX適用の後、動物は、一般的な衰弱、食欲不振、および2〜4日の範囲内の体重減少などの重篤な疾患症状を発症する。 4日後、白血球はivによって染色される。循環から血液を除去するために、経心筋灌流の前に蛍光色素結合抗CD45抗体を適用すること。正常に行われた場合、心臓および他の器官は白くなる。続いて、臓器を摘出し、上昇するエタノール行およびDBEでの最終インキュベーションによって、組織水をDBEと交換する。 図1Bは、タイムテーブル器官が著しく収縮する個々のインキュベーション段階のうちの少なくとも1つを含む。次いで、化学的に浄化された臓器を、標準的な顕微鏡組織ホルダー上のDBE充填画像化チャンバーに移す。 3D画像取得中に臓器を.......

Discussion

現代の生命科学では、生物学的プロセスの顕微鏡視覚化がますます重要な役割を果たしている。この文脈では、この時点までに対処できない質問に答えるために役立つ過去2世紀の間に多くの開発が達成されました。第1に、光学顕微鏡の解像度能力を根本的に増加させる明らかな傾向があった。一度仮定された分解能制限による構造化照明顕微鏡（SIM） ^{21,22 、}誘導発光 - 空乏（STED）顕微鏡²³ 、および光活性化局在化顕微鏡（PALM） ^24,25または確率論的光学再構成顕微鏡（STORM）光回折²⁷は著しく壊れていた。第二にしばしば標的とされた課題は、似ている環境での細胞の行動を観察することでしたできるだけ自然な状態。これに関連して、 インサイチュまたはインビボイメージングアプローチの開発が強制された。複雑な生物学的組織における限られた光の侵入深さを克服するために、2光子顕微鏡法

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ジフテリア毒素	Sigma Aldrich	D0564
リン酸緩衝生理食塩水	Biochrom	L182-10
ケタミン [50 mg/mL]	Inresa	PZN 4089014
キシラジン [2 %]	Ceva syringe
	Braun	REF 9161502	Braun Omincan F
静脈カテーテル内留置	Becton Dickinson	REF 381923	BD Insyte Autoguard
小動物用呼吸器	Harvard Apparatus	73-0044	MiniVent
anit-CD45 抗体 (AF647)	BioLegend	103124
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 二ナトリウム塩二水和物	Carl Roth	8043.2
カテーテル (21 G)	BD Biosciences	REF 387455	BD valu-set
パラホルムアルデヒド	Sigma Aldrich	P6148
PE チューブ (5 mL)	Carl Roth	EKY9.1	Rotilabo
エタノール	Carl Roth	9065.4
ジベンジルエーテル	Sigma-Aldrich	108014
チューブ ローテーター	Miltenyi Biotec	130-090-753	MACSmix
アガロース (低ゲル化)	Sigma Aldrich	A4018
モールド (15 x 15 x 5 mm)	Tissue Tek	4566	クライオモールド
ライトシート顕微鏡システム	LaVision Biotec		Ultramicroscope
顕微鏡本体	Olympus		MVX10
客観的	なオリンパス		0.5 NA MVPLAPO 2XC、WD 5.5 んん
sCMOSカメラ 5.5MP	Andor Technology
488 nm OPSL (50mW) レーザー	Coherent
647 nm  ダイオードレーザー (50mW)	Coherent
3D画像処理・解析ソフトウェア	Bitplane		IMARIS Ver. 8.3
トランスジェニックマウス	Steffen Jung et al.		CD11c.DTR
wtマウス株	Envigo		Balb / c Ola Hsd J
レーザーモジュール	LaVision Biotec
MVPLAPO 2XC対物レンズ