次世代の抗結核薬の初期の医薬品開発プロセスを改善する新しいモデルとアッセイが非常に望ましいです。ここでは、結核菌に対する薬効を評価するための迅速で安価なBSL-2適合アッセイについてご説明します。このアッセイは、ハイスループットスクリーニングに容易に適応できます。
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この記事について
サマリー
要約
初期の抗結核薬の医薬品開発プロセスは、in vitro活性を持つ化合物が臨床現場での有効性に非効率的に変換されることによって妨げられています。これは、感染した宿主に存在する生理学的に関連する細胞浸透障壁に対する考慮が不足しているためである可能性があります。私たちは最近、結核菌(Mtb)を核として高密度に充填された大きなマクロファージ凝集体を生成する代替感染モデルを確立しました。これは、薬剤感受性試験に適したものでした。この感染モデルは、安価で迅速であり、最も重要なのはBSL-2と互換性があることです。ここでは、薬剤感受性試験のためのマクロファージ継代Mtbを生成するMtb/マクロファージ凝集体を生成するための実験的手順について説明します。特に、この感染システムを96ウェルプレートフォーマットに直接適応させる方法を示し、Mtbに対する化合物ライブラリのスクリーニングのためのスループット能力を示します。全体として、このアッセイは、そのシンプルさ、費用対効果、およびスケーラビリティにより、現在利用可能なMtb創薬ツールボックスへの貴重な追加です。
概要
結核（TB）は、40年以上にわたって1用の抗結核化学療法レジメンの利用可能性にもかかわらず、世界的に深刻な健康への脅威のまま。これは、非準拠2を患者につながる複数の薬剤の組み合わせを使用して6ヶ月以上の長い治療期間の要件に一部起因します。近年の薬剤耐性結核の出現は、さらに臨床的に承認された医薬品の開発に成功が事実上存在しない3分野で問題を配合しました。確かに、徹底的な抗結核薬の開発にもかかわらず、唯一の単一の薬物は、FDAは、過去40年4臨床使用が承認されました。したがって、抗結核薬の新しい世代が緊急にこの問題に対処するために必要とされます。
結核治療薬の発見において重要な問題は、臨床設定における有効性へのin vitroでの活性を有する化合物からの転送成功の欠如であります= "外部参照"> 5、6、7。最初に、ターゲットベースのアプローチは、細菌細胞全体に変換することができなかった抗Mtbの薬剤 5をスクリーニングするために使用されました。 Mt....
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プロトコル
注：2 6206は、非病原性株17、18である結核菌の MCとしては、このプロトコルですべての作業は、バイオセーフティレベル2の施設（BSL-2）で行うことができます。
結核菌 MC 2を発現する緑色蛍光タンパク質1.培養条件6206（ マウンテンバイク -GFP）
注： ヒト結核菌H37RvはpMN437がこのプロトコル16全体で使用されるプラスミドを発現するGFPで形質転換された栄養要求株MC 2 6206（ΔpanCD、ΔleuCD）に由来しました。研究者のための歪みを簡単にアクセシビリティを有効にするには、野生型株を発現する非GFPでのMtb -GFP株を代用することが可能です。しかし、GFP発現は、食作用とのMtb /マクロファージの凝集体の形成の視覚的確認を可能にすることが望ましいです。経度のためのGの長期保存、Mtbの -GFPを、20％グリセロー....
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結果
96ウェルプレートフォーマットにこの感染モデルを適合させるの頑健性を確認するために、ここでは、図に示したテンプレートに従ってリファンピシン（RIF）及びモキシフロキサシン（MOXI）に当社の96ウェル適応感染モデル由来のMtbの薬剤感受性を調べました1A。我々は、このアッセイの鍵のMtb /マクロファージ集合構造の発生を確実にスループットの互換性（ 図1B）を可能にする、96ウェルプレートフォーマット（ 図2）で生成することができることを実証します。マクロファージのMtb直接十分に特徴付けレサズリンマイクロタイターアッセイ（ 図3）を使用して、薬効試験のために使用することができ、このようにして製造継代。
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ディスカッション
ここでは、詳細に薬効試験に適した代替のMtb感染モデルを説明してきました。このモデルは、アカウント初期の結核治療薬の開発プロセスの間に、より配慮を与えられるべき二つの重要な要因を考慮に入れる：薬剤浸透と感染時のMtbの代謝変化に生理学的に関連の障壁の存在。我々は以前に私たちの感染モデルの利点を示し、スループットの互換性16のために感染を拡大する可能性を提案しているが、ここでは、これは、96ウェルプレートフォーマットに直接システムを適応させることによって、実際に達成可能であることを示しています。それがピペットに対して要件が削除され、凝集体のサイズがサイズに達することができるように本質的に困難であり、個々のウェルに大きな培養フラスコから凝集体を分散としてのMtb /マクロファージを生成する能力は、96ウェルプレート中で直接凝集有利です> 500ミクロン。感染したマクロファージの凝集体の大きなサイズは、それがヒントを詰まらせることになるのいずれか、または大規模なピペッティングは、凝集体をばらばらになるようスループットア.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
Cytation 3自動イメージングプレートリーダーへのアクセスについて、Dr. Frank Wolschendorfに感謝します。この研究の一部は、NIH の助成金 R01-AI104499 to OK によって資金提供されました。作業の一部は、UAB CFARの施設と、NIH/NIAID P30 AI027767とNIH 5P30 AR048311によって資金提供されているUAB CFARフローサイトメトリーコア/ジョイントUABフローサイトメトリーコアによって行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 7H9 | BD Difco | 271310 | メーカーの推奨に従う |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | H2O; フィルター滅菌 |
| D-パントテン酸ヘミカルシウム塩 | ΣP5710 | H2O;フィルター滅菌 | |
| L-ロイシン | MP バイオメディカル | 194694 | H2O に 50 mg/mL 原液を調製します。ハイ |
| グロマイシン B | EMD ミリポア | 400051 | 2O に 200 mg/mL 原液を調製 |
| Nalgene Square PETG 培地ボトル | サーモフィッシャー | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 培地 | Hyclone | SH30027.01 | |
| ウシ胎児血清 | アトランタバイオロジカルズ | S12450H | |
| L-グルタミン | コーニング | MT25005CI | |
| HEPES | ハイクロン | SH30237.01 | |
| Cytation 3 プレートリーダー | Biotek | 任意の蛍光プレートリーダーおよび顕微鏡と交換可能 | |
| Gen5 ソフトウェア | Biotek | の記録と分析rezasurin coversion | |
| Rifampicin | フィッシャーサイエンティフィック | BP2679250 | H2Oに10 mg / mLの原液を調製 |
| 酸 | アクロスオーガニクス | 457960010 | H2Oに10 mg / mLの原液を調製 |
| レサズリンナトリウム塩 | シグマ | R7017 | 800 μH2O中のg/mLストック溶液;フィルター滅菌 |
| Tween-80 | フィッシャーサイエンティフィック | T164500 | H2Oに20%のストック溶液を調製し、フィルター滅菌 |
参考文献
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and t....
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再版と許可
