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方法論記事

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性

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DOI:

10.3791/55453

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2017年3月24日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham

この記事について

サマリー

次世代の抗結核薬の初期の医薬品開発プロセスを改善する新しいモデルとアッセイが非常に望ましいです。ここでは、結核菌に対する薬効を評価するための迅速で安価なBSL-2適合アッセイについてご説明します。このアッセイは、ハイスループットスクリーニングに容易に適応できます。

要約

初期の抗結核薬の医薬品開発プロセスは、in vitro活性を持つ化合物が臨床現場での有効性に非効率的に変換されることによって妨げられています。これは、感染した宿主に存在する生理学的に関連する細胞浸透障壁に対する考慮が不足しているためである可能性があります。私たちは最近、結核菌(Mtb)を核として高密度に充填された大きなマクロファージ凝集体を生成する代替感染モデルを確立しました。これは、薬剤感受性試験に適したものでした。この感染モデルは、安価で迅速であり、最も重要なのはBSL-2と互換性があることです。ここでは、薬剤感受性試験のためのマクロファージ継代Mtbを生成するMtb/マクロファージ凝集体を生成するための実験的手順について説明します。特に、この感染システムを96ウェルプレートフォーマットに直接適応させる方法を示し、Mtbに対する化合物ライブラリのスクリーニングのためのスループット能力を示します。全体として、このアッセイは、そのシンプルさ、費用対効果、およびスケーラビリティにより、現在利用可能なMtb創薬ツールボックスへの貴重な追加です。

概要

結核（TB）は、40年以上にわたって1用の抗結核化学療法レジメンの利用可能性にもかかわらず、世界的に深刻な健康への脅威のまま。これは、非準拠2を患者につながる複数の薬剤の組み合わせを使用して6ヶ月以上の長い治療期間の要件に一部起因します。近年の薬剤耐性結核の出現は、さらに臨床的に承認された医薬品の開発に成功が事実上存在しない3分野で問題を配合しました。確かに、徹底的な抗結核薬の開発にもかかわらず、唯一の単一の薬物は、FDAは、過去40年4臨床使用が承認されました。したがって、抗結核薬の新しい世代が緊急にこの問題に対処するために必要とされます。

結核治療薬の発見において重要な問題は、臨床設定における有効性へのin vitroでの活性を有する化合物からの転送成功の欠如であります= "外部参照"> 5、6、7。最初に、ターゲットベースのアプローチは、細菌細胞全体に変換することができなかった抗Mtbの薬剤 5をスクリーニングするために使用されました。 Mtbの細胞を用いた場合でも、それは多くの場合正確にインビボ 8,9 において薬効を予測していないブロス増殖させた培養物を用いて行われます。これらの問題は認識されているとのMtbを含むマクロファージまたは潜在性のMtbに対する薬物スクリーニングアッセイは、正常8に確立された、10、11、12。しかし、これらのより高度なアッセイは、薬は、非血管新生した肺病変における、および感染部位に壊死巣で遭遇する浸透障壁に十分な配慮を与えることはありません。確かにでも最初の行の結核治療薬のリファンピシンのため、次善の投与は、 生体組織や脳脊髄液（CSF） で不十分なに疑問視されている13、14、15だけでなく、細胞内のMtb 8、9に対して有効性を減少を浸透。このように、初期のリード開発プロセスの間に考慮に入れ、これらのパラメータを取る新モデルおよびアッセイは間違いなく結核治療薬の発見の努力を改善するであろう。

このニーズに応えるために、我々は最近、安価で迅速、かつMtbの薬効試験の16のためのBSL-2互換の代替感染モデルを確立しました。生理学的に関連する細胞透過障壁を再現し大マクロファージの結合構造体、および生成されたマクロファージ継代以内に密集したMtbの生産この感染モデルマウンテンバイクに似ている、変化した生理状態を持つメートル>マウンテンバイク。この感染モデルから派生したMtbは、他の細胞内感染モデルと一貫性のある結果を生成した薬効を評価するためにレサズリンマイクロタイターアッセイ（REMA）と合わせ、血清濃度に比べて高いCSF濃度を達成するための一般的な結核治療薬の報告能力とよく相関していました16。

ここでは、 マウンテンバイク /マクロファージの結合構造体の生成は、REMAを使用して、薬剤感受性試験に適したマクロファージ継代のMtbを生成するために、詳細に説明します。特に、我々は、この感染系を候補の抗結核薬のスループットスクリーニングとの互換性のために96ウェル形式に適合させることができる方法を示します。

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プロトコル

注：2 6206は、非病原性株17、18である結核菌の MCとしては、このプロトコルですべての作業は、バイオセーフティレベル2の施設（BSL-2）で行うことができます。

結核菌 MC 2を発現する緑色蛍光タンパク質1.培養条件6206（ マウンテンバイク -GFP）

注： ヒト結核菌H37RvはpMN437がこのプロトコル16全体で使用されるプラスミドを発現するGFPで形質転換された栄養要求株MC 2 6206（ΔpanCD、ΔleuCD）に由来しました。研究者のための歪みを簡単にアクセシビリティを有効にするには、野生型株を発現する非GFPでのMtb -GFP株を代用することが可能です。しかし、GFP発現は、食作用とのMtb /マクロファージの凝集体の形成の視覚的確認を可能にすることが望ましいです。経度のためのGの長期保存、Mtbの -GFPを、20％グリセロールを補充し（ステップ1.1参照）完全7H9培地中で-80℃で凍結しました。

  1. 10％ミドルOADC、0.02％チロキサポール、24μgの/ mLのD-パントテン酸、を50μg/ mLのL-ロイシンおよび50μg/ mLのハイグロマイシンBで7H9培地を補充することによって、完全なマウンテンバイク -GFPメディア（7H9-C）を準備
  2. マウンテンバイク -GFPの1つのバイアルを解凍し、30 mLの正方形の底PETGフラスコ中の7H9-Cの10 mLに追加します。
  3. ロータリーシェーカー（50回転）に37℃でインキュベートします。 OD 600が 1.0に達するまで（約5-8日）数日おきに光学密度測定（OD 600）を取ります。
  4. 0.2〜1.0の間のOD 600を維持するために必要に応じて希釈して継代培養。
  5. 感染のために、対数増殖期（OD 0.6から1の600）内のMtb -GFPの確立された文化を使用します。塊状の文化を避けるために、水浴中のMtb培養フラスコを超音波処理（130 W; 3×5秒パルス）ONCeまたは週二回

2.培養条件 THP-1細胞

  1. 10％熱不活性化ウシ胎児血清、2mMのL-グルタミン、および10mM HEPESを含むRPMI 1640培地を補充することによって、完全なTHP-1細胞培地（RPMI-C）を調製します。
  2. 5％CO 2の加湿雰囲気中37℃でT-75フラスコ中で細胞をインキュベートします。
  3. 血球計数器を用いて細胞数をカウントしたり、一日おきにフローサイトメトリーおよび0.1 mLの100万〜0.6の間の濃度でTHP-1細胞を維持します。

3.感染プロトコルのMtb /マクロファージ集計構造を生成するために、

  1. THP-1細胞調製物（96ウェルプレートあたり）
    1. 5分間250×gで遠心分離し、7×10 6 THP-1細胞。 7 mLのRPMI-Cでの再懸濁。
  2. MTB -GFP準備
    1. 遠心分離2.8×10 8 のMtb -GFPスイングバケット遠心分離機で3200×gで5分間のuOD 600 1.0 = 3×10 8個の細菌/ mLでの変換を歌います。
    2. ステップ3.2.1のようにRPMI-Cと遠心機で一回洗浄します。
    3. 10秒のための7 mLのRPMI-Cで再懸濁し、ボルテックス。
  3. 感染
    注：テンプレートについては、 図1を参照してください。
    1. 培地の蒸発を防ぐために、水のリムの行AとHと、列1および12に滅菌水200μLを加えることにより、96ウェルプレートを準備します。
    2. バックグラウンドコントロール（ブランク）用カラム2（G2へのB2）に200μLのRPMI-Cを追加します。
    3. 感染させるために、THP-1細胞懸濁液（ステップ3.1）へのMtb -GFP懸濁液（ステップ3.2）を追加し、ピペットでよく混ぜます。最終的なTHP-1細胞密度は、mL当たり5×10 5であり、感染の対応する多重度は40です。
    4. 25 mLのリザーバにTHP-1 / マウンテンバイク -GFP懸濁液を注ぎます。
    5. usin残りのすべての96ウェル（G11を通じてB3）にTHP-1 / マウンテンバイク -GFP懸濁液200μLを追加GAマルチチャンネルピペット。
      注：複数の96ウェルプレートで作業する場合は、定期的にさえ混合物を各ウェルに添加されていることを確認するために、リザーバ内の残りのTHP-1 / MTBサスペンションを再懸濁します。
    6. 7〜10日間、5％CO 2で37℃でインキュベートします。
    7. ゆっくりと100μLを除去することにより、2日おきにメディアを変更し、マルチチャンネルピペットを用いて100μLに予め温めたRPMI-Cを追加するだけでなく、静かにそれぞれの最上部からメディアを過ごしました。井戸を再懸濁し、ウェルの底にマウンテンバイク /マクロファージの凝集体を邪魔しないでください。
    8. 視覚のMtb /マクロファージの凝集体の大きさに着目し、毎日の蛍光顕微鏡（4-10X目的）によってウェルを調べます。日7-10では、 マウンテンバイク /マクロファージの凝集体は、薬物の効力試験（第4節）のために進行する（参考のために図2を参照）を十分に大きくなければなりません。
    9. 所望であれば、自動細胞イメージングシステムを用いて96ウェルのキャプチャー画像が嵌め込ま明視野およびGFPフィルターでマウンテンバイク /マクロファージ凝集体形成を文書化するために設定します。
      注：ユーザーが自動化されたイメージングシステムへのアクセスを持っていない場合は、代表ウェルの画像をGFPと明視野能力を有する任意の適切な顕微鏡を用いて撮影することができます。

マウンテンバイク /マクロファージ集約由来医薬品に対する効力のMtbを評価する4.成長阻害アッセイ

  1. 薬剤の準備（2薬剤のための三重の条件）
    注：テンプレートについては、 図1Aを参照してください。
    1. 独立した96ウェルプレートでは、G10までB2に7H9-Cメディアの125μLを追加します。
    2. ステップ4.2.4での希釈を考慮するために、7H9-Cの1mLに二重最高所望の最終濃度で、二つの薬剤を準備します。
    3. それぞれ三連の治療のために、ウェルB11-C11-D11とE11-F11-G11に各薬剤の250μLを追加します。
    4. マルチチャンネルピペットを使用して、連続希UTE試験薬物B10-G10にB11-G11から125μLを移動することで2倍。各ステップで5回ピペッティングすることによって混合します。
    5. プレートを横切って（右から左）の列に列から125μLを移動させ、カラム4の後に停止し続けます。
    6. カラム4を混合した後、廃棄物容器に125μLを捨てます。列2と3は、バックグラウンド（ブランク）とプラス成長コントロールなどの使用を可能にするために、任意の薬を含めることはできません。
      注：また、テスト薬剤のライブラリについては、図1（b）のテンプレートに従ってください。各96ウェルプレートは、単一の濃度で58の薬物を収容することができます。また、ステップ4.2.4で半分に希釈されるので、倍の所望の最終濃度を使用して、この薬物プレートを準備します。
  2. 薬物治療：
    1. Mtbを含む96ウェルプレートを取り出し、マクロファージ（ のMtb /マクロファージ凝集体）-infected。
    2. 慎重にマルチチャンネルピペットを用いて、関連するすべてのウェル（G11を介してB2）をデカント。2段階の方法でこれを実行します。第一プレートを傾けることなく、150μLを削除してから、プレートを傾けるとウェルの底縁にピペットチップを挿入することにより、残りのメディア（〜50μL）を取り外します。 マウンテンバイク /マクロファージの凝集体がウェルの底に付着しているように、何の材料が失われてはなりません。
    3. 静かマウンテンバイク /マクロファージの凝集体を含むプレートに関連するすべてのウェル（G11を通じてB2）に7H9-Cメディアの100μLを追加します。
    4. マルチチャンネルピペットを用いて、感染プレートの対応するウェルに96ウェルプレート（ステップ4.1）を含む薬剤から100μLを移します。
    5. 密封された袋に入れて、37℃で3日間インキュベートします。

レサズリンマイクロタイターアッセイを使用して5薬効の定量

  1. H 2 O中の0.8mg / mLの最終濃度でレサズリン原液を準備し滅菌のため0.22μmの細孔径のPVDF膜を通して濾過。
  2. 1：1の比率で2レサズリンストック溶液、H 2 OおよびTween-80（H 2 O中20％溶液）を混合して溶液を作動レサズリン準備します。最終濃度は0.4 mg / mlでのレサズリン及び5％のTween-80です。
  3. 37℃で24時間、530 nm励起および590 nmの発光で30分毎に蛍光を読み取るためのプログラムは、プレートリーダーを使用してセットアップ。 37°Cにプリ暖かいプレートリーダー。
  4. マルチチャンネルピペットを用いて薬剤処理プレート（ステップ4.11）に関連するすべてのウェル（G11を通じてB2）にレサズリン作業溶液20μLを追加します。
  5. プレートリーダーでプレートを置き、ステップ5.3で設定プログラムを起動します。
    注：アッセイプレートの大量の処理を容易にするために、37℃のインキュベーター中でアッセイを開発し、単一の蛍光は24時間毎に読み出し実行するのに十分です。これはまた、運動やインキュベーション機能を備えたプレートリーダーへのアクセス権を持たないユーザーにも適用可能です。

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結果

96ウェルプレートフォーマットにこの感染モデルを適合させるの頑健性を確認するために、ここでは、図に示したテンプレートに従ってリファンピシン（RIF）及びモキシフロキサシン（MOXI）に当社の96ウェル適応感染モデル由来のMtbの薬剤感受性を調べました1A。我々は、このアッセイの鍵のMtb /マクロファージ集合構造の発生を確実にスループットの互換性（ 図1B）を可能にする、96ウェルプレートフォーマット（ 図2）で生成することができることを実証します。マクロファージのMtb直接十分に特徴付けレサズリンマイクロタイターアッセイ（ 図3）を使用して、薬効試験のために使用することができ、このようにして製造継代。

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ディスカッション

ここでは、詳細に薬効試験に適した代替のMtb感染モデルを説明してきました。このモデルは、アカウント初期の結核治療薬の開発プロセスの間に、より配慮を与えられるべき二つの重要な要因を考慮に入れる：薬剤浸透と感染時のMtbの代謝変化に生理学的に関連の障壁の存在。我々は以前に私たちの感染モデルの利点を示し、スループットの互換性16のために感染を拡大する可能性を提案しているが、ここでは、これは、96ウェルプレートフォーマットに直接システムを適応させることによって、実際に達成可能であることを示しています。それがピペットに対して要件が削除され、凝集体のサイズがサイズに達することができるように本質的に困難であり、個々のウェルに大きな培養フラスコから凝集体を分散としてのMtb /マクロファージを生成する能力は、96ウェルプレート中で直接凝集有利です> 500ミクロン。感染したマクロファージの凝集体の大きなサイズは、それがヒントを詰まらせることになるのいずれか、または大規模なピペッティングは、凝集体をばらばらになるようスループットア...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

Cytation 3自動イメージングプレートリーダーへのアクセスについて、Dr. Frank Wolschendorfに感謝します。この研究の一部は、NIH の助成金 R01-AI104499 to OK によって資金提供されました。作業の一部は、UAB CFARの施設と、NIH/NIAID P30 AI027767とNIH 5P30 AR048311によって資金提供されているUAB CFARフローサイトメトリーコア/ジョイントUABフローサイトメトリーコアによって行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
7H9BD Difco271310メーカーの推奨に従う
Middlebrook OADCBD Biosciences212351
TyloxapolSigmaT8761H2O; フィルター滅菌
D-パントテン酸ヘミカルシウム塩ΣP5710H2O;フィルター滅菌
L-ロイシンMP バイオメディカル194694H2O に 50 mg/mL 原液を調製します。ハイ
グロマイシン BEMD ミリポア4000512O に 200 mg/mL 原液を調製
Nalgene Square PETG 培地ボトルサーモフィッシャー2019-0030
RPMI 1640 培地HycloneSH30027.01
ウシ胎児血清アトランタバイオロジカルズS12450H
L-グルタミンコーニングMT25005CI
HEPESハイクロンSH30237.01
Cytation 3 プレートリーダーBiotek任意の蛍光プレートリーダーおよび顕微鏡と交換可能
Gen5 ソフトウェアBiotekの記録と分析rezasurin coversion
Rifampicin フィッシャーサイエンティフィックBP2679250H2Oに10 mg / mLの原液を調製
酸アクロスオーガニクス457960010H2Oに10 mg / mLの原液を調製
レサズリンナトリウム塩シグマR7017800 μH2O中のg/mLストック溶液;フィルター滅菌
Tween-80フィッシャーサイエンティフィックT164500H2Oに20%のストック溶液を調製し、フィルター滅菌
Hします 塩

参考文献

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