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方法論記事

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

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DOI：

10.3791/55456

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2017年3月22日

 , 
1Department of Internal Medicine- Cardiology, UT Southwestern Medical Center

この記事について

サマリー

この原稿は、レトロウイルスが媒介するGata4、Hand2、Mef2c、およびTbx5の送達を使用して、多様な再プログラムされた心臓サブタイプの生成と定量化のための段階的なプロトコルを説明しています。

要約

最近、再生医療、疾患モデリング、および系統指定のための強力なパラダイムとして、ある細胞タイプへの直接的なリプログラミングが浮上しています。特に、Gata4、Hand2、Mef2c、およびTbx5(GHMT)による線維芽細胞の誘導心筋細胞様筋細胞(iCLM)への変換は、in vitroおよびin vivoでde novo心筋細胞を生成するための重要な手段を表しています。最近の証拠は、GHMTが以前に認識されていたよりも多様な心臓サブタイプを生成することを示唆しており、したがって、追加の研究を実施するための体系的なアプローチの必要性を強調しています。しかし、ダイレクト・リプログラミングを治療戦略として利用する前に、特定の心臓サブタイプを生成するために、系統転換のメカニズム的基盤を詳細に理解する必要があります。ここでは、GHMTを介したマウス胚性線維芽細胞(MEF)のリプログラミングによりiCLMを生成するための詳細なプロトコルを紹介します。

私たちは、効率的なリプログラミングを達成するためのMEFの分離、レトロウイルス産生、およびMEF感染の方法を概説します。再プログラムされた細胞のサブタイプの同一性を決定するために、定義された適合抗体のセットを使用してiCLMで免疫細胞化学を実施するための段階的なアプローチについて詳しく説明します。共焦点顕微鏡法、iCLMおよび個々の心房(iAM)、心室(iVM)、ペースメーカー(iPM)のサブタイプの同定および定量化の方法も紹介します。最後に、プロトタイプの直接リプログラミング実験の代表的な結果について説明し、効率的な系統変換を確実にするためのプロトコルの重要な技術的側面を強調します。まとめると、私たちの最適化されたプロトコルは、研究者が個々のCMサブタイプの特定を必要とする有意義な心臓リプログラミング実験を実施するための段階的なアプローチを提供するはずです。

概要

心臓は胚1、2に開発した最初の機能的器官です。循環器系に関連して、開発中に、酸素、栄養素、および廃棄物処理機構に供給する。三週間受精後、人間の心は初めて打つとその適切な規制は、心筋細胞（のCM）によって維持されています。これらの特殊化した細胞の不可逆的損失は、したがって、進行性の心不全の根底にある基本的な問題です。このようなゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルのようないくつかの生物は、心臓の再生の可能性を有しているが、大人の哺乳類の心臓は3、5、6、より限定されています。このように、心の重要な機能を考えると、心臓病は米国だけで60万人が死亡7を占め、世界における死亡の主な原因であることは驚くべきではありません。ザrefore、効率的に負傷した心筋を修理または交換するために、細胞ベースの治療は臨床上非常に興味深いものです。

山中ら8の精液の研究は、4つの転写因子の強制発現は、多能性幹細胞に完全に分化した線維芽細胞に変換するのに十分であることを示しました。しかし、すべての多能性幹細胞戦略の腫瘍形成能力は、治療目的のためのそれらの使用における重大な関心事となっています。これは、多能性段階を回避しながら細胞を分化転換するための代替方法を検索するための科学的なフィールドをやる気。最近、いくつかのグループは、転写の異所性発現は、GATA4、MEF2C、TBX5、および後に、Hand2（GMTとGHMT因子を用いて誘導心筋細胞様細胞（iCLMs）にマウス線維芽細胞の直接変換を表示することにより、この戦略の実現可能性を示していますそれぞれ）9,10。 Furthermore、同じ戦略は、 インビボおよびヒト由来の組織9、11、12で行うことができます。最近の研究では、追加の因子またはさらなる心臓再プログラミング効率13、14、15を改善するために調節することができるシグナル伝達経路を強調しています。まとめると、これらの研究は、再生治療のために向かう分化転換の可能性を示します。しかし、方法論的差異16にCMの再プログラミング、未知の分子機構、一貫性のない再現性の低効率、およびiCLMsの不均一な性質は、アドレス指定されないままです。

直接iCLM不均一性を評価するために、我々は、サルコメアの開発および心臓系統specificatioの同定のために離散的で堅牢な単一細胞アッセイを設計しましたn-2の機能的心筋細胞の必要な特性。それらの場所でユニークな電気的特性によって定義されたCMの少なくとも三つの主要なタイプは、心臓である：心房（AM）は、心室（VM）及びペースメーカー（PM）17、18、19、20。オーケストレーションの組み合わせで、それらは、血液の適切なポンピングを可能にします。心臓損傷の間、一つまたはすべてのサブタイプが影響を受ける可能性があり、および細胞治療のタイプは、ケースバイケースで対処する必要があります。少し作業は、サブタイプの仕様を調節する分子メカニズムを研究するために行われている間、現在、ほとんどの戦略は、心筋細胞の全体的な世代に焦点を当てています。

以下の研究は、適切によく組織サルコメアを定量化し、心筋細胞のサブタイプの多様なセットを識別する方法について詳しく説明します。ペースメーカー（PM）特異的レポーターマウスを用いて、Iを適用することができます誘導された心房のような筋細胞（IAM）、誘導された心室のような筋細胞（IVM）、および誘導されたPM-様筋細胞（IPMS）21を区別するためにmmunocytochemicalアプローチ。我々の観察に基づいて、サルコメア組織を示す細胞のみが自発的な拍動することが可能です。このユニークな再プログラミングプラットフォームは役割を評価することができます サルコメア組織、サブタイプの仕様、および単一セルの解像度でCMの再プログラミングの効率の特定のパラメータの。

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プロトコル

動物プラクティスを含む全ての実験手順は、UTサウスウェスタン医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

HCN4-GFP E12.5マウス胚線維芽細胞（MEFの）の1の単離

  1. ホモ接合HCN4-GFPの雄とCD-1雌との間の時限交配を設定します。
  2. 二酸化炭素安楽死とその後の頸椎脱臼によりE12.5で妊娠中の女性を生け贄に捧げます。
    1. 2+、以前22記載されているように鉗子を解剖して子宮角を取り除き23、およびCa 2+又はMgなしの1xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で氷上でペトリ皿に入れます。
  3. 無菌技術を用いて組織培養フード内のすべての後続の手順を実行します。
    1. はさみを使用して鉗子を解剖SAC子宮と羊膜から胚を削除します。よりよい処理のために取り付けられた胎盤を保管してください。プレグナNT CD-1雌は一般的に10〜14の仔を出産します。
    2. 鉗子を用いて解剖、単離された胚を取り出し、すぐに70％（v / v）のエタノールで二回それをすすぎます。
      注：洗浄は、細胞死を最小にするために高速である必要があります。
    3. 孤立した胚からの心臓を含む、頭部、四肢、尾、と内臓を取り除きます。
    4. 約1mm 3サイズのに滅菌カミソリの刃を使用して、1×PBSと細かくミンチ1mLの10 cmディッシュに残っている組織を置きます。
    5. PBSで50 mLコニカルチューブにみじん切りの組織を転送します。
    6. 3分間300×gでスピン。慎重に過剰のPBSを吸引します。
    7. 胚あたりの滅菌0.25％トリプシンEDTAの1 mLを加え。 15分間37℃の水浴中で細胞をインキュベートします。優しくチューブごとに4分を混ぜます。組織の過消化は大幅に歩留まりを低下させるであろう。
    8. 4秒、最高速度（3,200 rpm）で渦細胞混合物。
    9. 胚あたりの線維芽細胞の培地2 mLを加え、混合します。フィルタートンストレーナーを通して細胞を補助するために、ピペットを用いて100μmの細胞ストレーナーhrough。後続のすべての媒体の製剤については、 表1を参照してください。
    10. 4分間300×gでスピン。注意深く上清を吸引。
    11. 3胚あたりの新鮮な線維芽細胞培地を10mLを加え、6-10回粉砕します。
    12. 調製したすべての3胚1 15 cmの組織培養皿において細胞をプレート。 37°C、5％CO 2インキュベーター内で培養一晩。
    13. 一晩のインキュベーションの後、プレート当たりメディアの新鮮な30mLでメディアを交換。一晩バックインキュベーターにセルを配置します。
      注：蛍光顕微鏡下でHCN4-GFP +細胞の混入を確認してください。文化はGFPであるべき-とのみ再プログラミングの際にGFP +になります。
    14. 翌日、新鮮予め温めておいた0.25％トリプシンEDTA 3mlで収穫細胞。細胞を計数し、凍結。一般的に、ミリリットル当たり3×10 6個の細胞で細胞を凍結します。予想yieldは胚あたり3×10 6個の細胞でなければなりません。

2.レトロウイルス生産とリプログラミング

注意：以下のプロトコルは、感染性レトロウイルスの生産と処理が必要です。 BSL-2ガイドラインおよび滅菌技術の下でバイオセーフティレベル2キャビネットには、次の手順を実行します。レトロウイルスに暴露され、すべての材料を処分するために10％の漂白剤を使用してください。

  1. レトロウイルスの生産とMEFの準備
    注：以下のプロトコルは、24ウェルプレートにおけるレトロウイルス6ウェルプレートの生産とMEFの感染症のためのものです。他のフォーマットについては、 表2を参照してください。 MEFのは、1日目でプレーティングされているので、タイミングが（セクション2.3と図2を参照してください）各実験のために適切に調整される必要があります。
    1. ぷらっと-E（PE）製造者の推奨に従って細胞を維持します。簡潔には、DMEMで培養PE細胞を、10％FBS、を1μg/ mLのpuromyを補充しますCIN、を10μg/ mLのブラストサイジン、ペニシリン、およびストレプトマイシン。継代細胞1：4の文化は百分の70から90までの密集度に達するごとに2日。
    2. 日-2：トランスフェクションの前日に、トランスフェクション培地中で1×10で6個の細胞/ウェルで6ウェルプレート上のPlat-E細胞を播種します。細胞は、トランスフェクション時の百分の70から80までのコンフルエントであるべきです。
  2. 商業トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクション。
    注：市販の試薬は、トランスフェクション前に室温（RT）であるべきです。 DNAトランスフェクションのために、GHMTカクテル9を形成する個々のレトロウイルスプラスミドDNA（G、H、M、およびT）を加えます。
    1. 1日目は：15 mLコニカルポリスチレンチューブでは、6ウェルプレートフォーマットのための反応当たりのトランスフェクション試薬の6μLで還元血清培地の60μLを混ぜます。室温で5分間混合物をインキュベートします。
      注：ここで使用されるトランスフェクション試薬は、プラスチックに結合するので、A直接低血清培地をトランスフェクション効率の低下を避けるためにDD。
    2. 反応あたりGHMTカクテル2μgの合計を加え、穏やかにそれをミックスするタップします。ボルテックスしないでください。室温で15分間、反応をインキュベートします。
    3. ステップ2.2.3からの滴下方法で、PE細胞に混合物を追加します。
    4. 37℃、5％CO 2インキュベーター中で一晩トランスフェクトのPlat-E細胞をインキュベートします。トランスフェクションの時間を記録します。
  3. HCN4-GFPマウス胚線維芽細胞の播種。
    1. 1時間のMEFをメッキする前に、免疫細胞化学のための24ウェルプレートを準備します。
      1. ウェル当たり12ミリメートルのフィブロネクチンカバースリップを追加します。
      2. ウシコラーゲン溶液の300μL（ 例えば 、SureCoat）でコートウェルと1時間37℃のインキュベーターでインキュベートします。
      3. すぐにMEFメッキの前に吸引するコーティング液。
    2. HCN4-GFPのMEFの凍結バイアルを解凍し、予め温めておいfibroblとX1を洗います5分間、500×gでのASTメディア。
    3. トリパンブルー排除または類似の色素を用いて細胞生存率を決定します。以下の式を用いて培養物1mL当たりの生存細胞の数を計算します。
      ％生存細胞は= [1.00 - （総細胞の青色細胞の数/数）]×100
      1. 以下の式を用いて、生存細胞の総数を計算します。
        細胞懸濁液の生存細胞=％生存細胞のX希釈係数は、x万X全体積
    4. 先に調製したウシコラーゲン溶液フィブロネクチンカバーガラスと、24ウェルプレート上にウェルあたりシード3×10 4細胞。
  4. 形質導入とのMEFの再プログラミング
    注：メーカーのノートによると、適切ぷらっと-E細胞は、1×10 7感染単位/ mLの平均力価を生成維持しました。力価は直接各実験について測定されていないが、GFPコントロールは、常に感染効率の代理として含まれています。高いGFP発現と強度（GFP +> 95％）は、典型的には、iCLMsの成功GHMT媒介世代と相関します。
    1. 0日目：24時間トランスフェクション後は、0.45μmの細孔サイズの界面活性剤を含まない酢酸セルロースフィルターを通してPEレトロウイルスの媒体をフィルタリングし、15 mLコニカルチューブに移します。 8μgの/ mLの最終濃度にポリブレンを追加します。慎重に新鮮なトランスフェクション培地2mLで細胞を補充。
      注：メディアがあまりにも急激に変更された場合、細胞は、容易にプレートから切り離します。
    2. 培養したMEFの培地を吸引し、新鮮に収集したレトロウイルス培地を追加します。それは、6ウェルプレートのウェルあたりのメディアの1.7ミリリットルを得られるはずです。 24ウェルプレートのウェル当たり〜800μLを追加します。インキュベーターにMEFプレートを戻し、一晩インキュベートします。
    3. 1日目：ステップ2.4.1と2.4.2を繰り返します。 2 番目のウイルス回収後細胞を廃棄してください。インキュベーターに感染したMEFを返し、それらを一晩休ませて。
    4. 2日目：48時間誘導後、1×PBSで細胞馴化培地と洗浄×1を吸引。 24ウェルプレートのウェル当たり500μLの事前温めiCLMメディアを追加します。
    5. 3日間 - すべての2 iCLMメディアを交換してください。 14日、心臓再プログラミングの免疫細胞化学（ICC）分析のためのウイルス誘導後のプロセスプレート。

再プログラムしたMEFの3免疫染色

  1. 14日誘導後、慎重にメディアを吸引除去します。
  2. 氷冷1×PBS300μlで各ウェルをすすぎます。過剰の溶液を吸引します。
  3. 24ウェルプレートのウェル当たり4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を250μLで細胞を固定してください。 RTで15分間インキュベートします。
    注： - 染色の前に、2週間固定した細胞は、1、4℃でPBS中に保存することができます。
  4. 300μLの0.1％PBS-トリトンX 100（PBST）で洗浄ウェル×3によって透過処理細胞。洗浄の間に室温で5分間インキュベート。最後の洗浄の後、過剰の溶液を吸引します。
  5. 10ブロック300μL/ウェルで1×ユニバーサルブロックBufferで室温で分。
  6. （ICC）染色バッファーを準備します。ブロッキング緩衝液1×PBSおよび1×ユニバーサルの1：1を追加します。 ICC染色緩衝液中で一次抗体を希釈し、4℃で一晩抗体をインキュベートします。お勧めの希釈用材料のセクションを参照してください。
    1. IPMとIAM識別するための1つのマウスαアクチニンとスライドのペア、鶏αGFP、およびウサギNPPAを染色します。
    2. IPMとIVM識別のためのマウスαアクチニン、鶏αGFP、およびウサギMyl2とスライドの1組を染色します。
  7. 次の日には、300μLの0.1％PBSTでウェル×3を洗います。洗浄の間に室温で5分間インキュベート。最後の洗浄の後、過剰の溶液を吸引します。
  8. ICC染色緩衝液中の二次抗体希釈液を調製します。お勧めの希釈用材料のセクションを参照してください。二次抗体を光から保護し、室温で1時間、インキュベートします。
    1. 以下の二次antibodieですべてのスライドを染色S：マウスアレクサ-555、鶏のAlexa-488、およびウサギのAlexa-647。
  9. 300μL、0.1％PBSTでウェル×3を洗ってください。洗浄の間に室温で5分間インキュベート。光から保護します。
  10. ガラス顕微鏡スライドを4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）1.5μgの/ mLを含むマウンティング培地の2.4μLを加えます。慎重に、24ウェルプレートのウェルからカバースリップを削除する過剰の溶液を除去し、実装メディアでガラススライドに移します。静かに過剰量と空気を除去するためにカバースリップを押してください。
  11. 好適なマニキュアやプラスチックシーラントでシール摺動します。ストアは、光から保護して4℃でスライドをマウントしました。

共焦点顕微鏡を使用した4心サブタイプの同定

注記：画像化のために、共焦点顕微鏡は、少なくとも2つの蛍光体405でのスペクトル検出が可能な検出器、488、555、及び639 nmの波長を備えたIPMS、アイムス、及びIVMSを識別するために必要です。 IMAGプランアポクロマート20X / 0.75客観以上使用して電子細胞。製造業者の画像解析ソフトウェアを用いて、走査ズーム画像は、40X油浸品質の画像を達成することができます。

  1. イメージ・ライブラリーは：DAPI、アレクサ488、アレクサ555、およびAlexa-647チャンネルを8ビット画像を撮る（CH。）。画素が2で6 S 1024フレームサイズ、ライン工程の滞留時間、および2の平均化は、高解像度の画像のために十分です。
  2. 各スライドについて、一方のエッジから開始し、アップスキャンを開始し、αアクチニン+サルコメア+細胞用の赤色蛍光チャネル（CH。）におけるダウン（例については、図3を参照してくださいと、図5（a））。サルコメア条線は555 nmの波長で視覚的に識別するのが容易です。
    1. αアクチニン+サルコメア+細胞が同定されたならば、緑CHに切り替えます。それが正の場合と（IPM）をメモしておきます。遠赤647 CHを評価するために、コンピュータに切り替えます。 （IAMまたはIVM）。
      注：している細胞αアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - IPMSとして指定されています。 GFPの発現は、細胞（ 図4A）を通して理解されます。
    2. αアクチニン（マウス-Alexa555）、HCN4-GFP（鶏-Alexa488標識）で染色スライド、NPPA（ウサギ-Alexa647）、およびDAPI。 αアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFPである細胞- / NPPA +は IAMあります。 NPPA染色は核周囲や点状（ 図4B）が表示されます。
    3. αアクチニン（マウス-Alexa555）で染色スライド、HCN4-GFP（鶏-Alexa488標識）、Myl2（ウサギ-Alexa647）。 αアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFP陽性の細胞- / Myl2 +は IVMSです。 Myl2染色はサルコメアフィラメントに沿って横紋形を示すであろう。染色およびZ-面の品質のばらつきに、条線は常に（ 図4C）簡単に表示されない場合があります。

5。定量化

注：潜在的に再プログラミングされたMEFの実際の数を評価するために、24ウェルプレートの2ウェルを実験ウェルに平行に播種され、メッキ1日後に収穫されます。播種した細胞の総数は、2つのウェルを平均することによって決定されます。これは、メッキ、実際の総細胞（aTotal）となります。

  1. サルコメア+
    1. 視覚的に適切なαアクチニン+ /サルコメア+（右パネルは図3を参照 ）とレコード（ 図5B-I）のためのカバースリップ上の各セルを検査します。
    2. メッキ実際の総細胞（aTotal）により、各カバースリップと除算にαアクチニン+ /サルコメア+の合計数を集計した （ 図5B-III）。 aTotal = 12,500細胞、及び100細胞はα-アクチニンた場合たとえば、+ /サルコメア+は、その後、メッキのMEFの0.8％を再プログラムしました。平均reprograming実験は、1％のαアクチニンは+ /サルコメア+細胞（ 図5C）を得ます。
  2. サブタイプ+
    注：以下の手順については、代表的なiCLM定量ワークフローについては、 図5B / Cを参照してください。それはどちらかのサブタイプ（ 図5B-I）のために一意である場合簡単に言えば、各筋節+セルのために、集計。平均サルコメア+細胞×100（ 図5B-I）オーバーサブタイプ+細胞の数を割ることによって（ 図5B-III）％のサブタイプを計算します。絶対％亜型効率（ 図5B-IV）を計算するには、×100（ 図5B-II）播種した細胞の総数で、図5B-Iからサブタイプ+細胞数を割ります。
    1. αアクチニン+ /サルコメア+細胞のそれぞれについて、彼らはGFP +、NPPA +、またはMyl2あるかどうかを評価 +アップ。
    2. / Myl2 - - 、アクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFP - / NPPA +、およびαアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFPαアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFP + / NPPAの総数を集計- / Myl2 +細胞（ 図5B-I）。
    3. 各サブタイプの割合を計算するには、そのウェルで+ /サルコメア+細胞αアクチニンの総数でサブタイプ+細胞の数を分割し、100 GHMTを掛けIPMS、アイムス、およびIVMSでほぼ同じ比率を生成する（ 図5B-III）。
    4. 亜型+細胞の絶対数を計算するには、aTotalによる実験条件のサブタイプ+細胞の総数を除算し、100（ 図5B-II）を掛け。平均IPMSのIAMS 0.3％、総感染細胞集団の0.3％を表し、そしてIVMS 0.25％（ 図5B-IV）。

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結果

PM固有のレポーターマウスを利用して、我々は、 図1に示されるように、多様な内因性の筋細胞を同定するための多重免疫戦略を開発しました。 図2に示す書き換え手順に続いて、サブタイプ特異的のCMの誘導は、低レートではあるが、早ければ4日目21として検出することができます。 14日目では、実験は、サルコメア組織（ 図3）およびサブタイプ仕様（ 図4）を停止し、評価することができます。 図5は、スライドICCのための準備（ 図5パネルA）、およびiCLMサブタイプ特異的細胞の定量化（ 図5パネルB / C）のワークフローをまとめたものです。

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ディスカッション

本研究は、心臓転写のレトロウイルス媒介発現を介して、心臓のサブタイプの多様なセットにしたMEFの変換のためのダイレクトリプログラミング戦略を提供することはGATA4、MEF2C、TBX5、およびHand2（GHMT）要因。 PM固有レポーターマウスと組み合わせて多重免疫染色法を用いて、我々は、単一細胞の解像度でIAM、IVMS、およびIPMSを識別することができます。このようなアッセイは、サブタイプの多様性とサルコメアの開発に向けて、個々の転写因子の寄与を分離することのできるインビトロ系の実験を可能にします。並行して、これは新たな転写因子または特定の系統に向かってiCLMsにバイアスをかける小分子への洞察をもたらす可能性があります。それにもかかわらず、このアッセイが正常に完了するためのいくつかの重要なステップがあります。以下では、一般的なiCLM実験におけるウイルス力価の影響、線維芽細胞質、およびイメージング解析に取り組みます。

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

A.F.-P. は、助成金No.2015165336の下で、全米科学財団大学院研究フェローシップによって支援されました。NVMは、NIH(HL094699)、バロウズウェルカム基金(1009838)、およびマーチオブダイムズ(#5-FY14-203)からの助成金によって支援されました。Young-Jae Nam氏、Christina Lubczyk氏、Minoti Bhakta氏には、プロトコール開発とデータ解析への重要な貢献に感謝します。また、貴重な技術的インプットを提供してくださったJohn Shelton氏と、科学的な議論を提供してくださったMunshi研究室のメンバーにも感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEMSigmaD5796iCLM 培地、Plat-E 培地、線維芽細胞、トランスフェクション培地の成分
199サーモフィッシャーサイエンティフィック11150059iCLM 培地の成分
シ胎児血清 (FBS)SigmaF2442iCLM 培地、Plat-E 培地、線維芽細胞、トランスフェクション培地の成分
インスリン-トランスフェリン-セレン Gサーモフィッシャーサイエンティフィック41400-045iCLM培地
MEMビタミン溶液サーモフィッシャーサイエンティフィック11120-052iCLM培地
の成分 MEMアミノ酸サーモフィッシャーサイエンティフィック1601149iCLM培地の成分
非必須アミノ酸サーモフィッシャーサイエンティフィ11140-050iCLM培地の成分
抗生物質-抗真菌剤サーモフィッシャー科学15240062iCLM培地の成分
B-27サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック17504044iCLM培地の成分
熱不活化馬血清サーモフィッシャーサイエンティフィック26050-088iCLM培地の成分
ナピルビン酸サーモフィッシャーサイエンティフィック11360-70iCLM培地の成分
ペニシリン/ストレプトマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィック1514022プラットE培地および線維芽細胞培地
ピュロマイシンの成分 サーモフィッシャーサイエンティフィックA11139-03プラットE培地
シジンの成分  ジェミニ・バイオプロダクツ400-128PプラットE培地の成分
グルタマックスサーモフィッシャーサイエンティフィック35050-061線維芽細胞培地の成分
共焦点レーザースキャン LSM700ツァイス共焦点解析用
FuGENE 6 トランスフェクション試薬プロメガE2692トランスフェクション試薬 
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985-070トランスフェクション試薬 
ポリブレンミリポアTR-1003-G誘導試薬。最終濃度8&muで使用してください。M/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, EcotropicCellBiolabsRV-101レトロウイルスパカッキング細胞株
Trypsin 0.25% EDTAThermo Fisher ScientificFor MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti &-Actinin (Clone EA-53)SigmaA7811Antibody for confocal analysis.共焦点解析には、1:200
Chicken anti-GFP IgY ThermoFisher ScientificA10262。1:200で使用
ウサギのパブ 反NPPA AbgentAP8534A共焦点解析用抗体。1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgGで使用 ProteinTech10906-1-AP共焦点解析用抗体。1:200
Vectashield溶液とDAPI(4',6-ジアミディノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)で使用 Vector LabsH-1500共焦点分析用色素
Superfrost Plus 顕微鏡スライドサーモフィッシャーサイエンティフィック12-550-1525 x 75 x 1.0 mm
BioCoat フィブロネクチン 12 mm カバースリップNeuVitro CorpGG-12-1.5共焦点分析用カバースリップ
100 μmセルストレーナーサーモフィッシャーサイエンティフィック08-771-19
0.45 μm シリンジ フィルター SFCA 25MMサーモフィッシャー サイエンティフィック09-740-106ウイルスろ過用
6 mL シリンジCovidien8881516937ウイルスろ過用
ヤギ アンチチキン IgY (H&L) A488AbcamAB150169共焦点解析用二次抗体。1:400で使用
ロバ対ウサギA647 IgG(H + L) Thermo Fisher ScientificA31573共焦点解析用二次抗体。共焦点解析には、1:400
ヤギ抗マウスIgG(H+L) A555Thermo Fisher ScientificA21422。1:400
Triton X-100Sigma93443-100mL細胞透過化用 
CaCl2 および MgCl2 (D-PBS)シグマD8537
パワーブロック 10x ユニバーサルブロッキング試薬サーモフィッシャーサイエンティフィックNC9495720H2O
16% パラホルムアルデヒド水溶液 (PFA)。15710dH2O
6 cm  プレートオリンパス25-260
6 ウェルプレートジェネシー サイエンティフィック25-105
24 ウェル プレートジェネシー サイエンティフィック25-107
10 cm 組織培養皿コーニング4239
15 cm 組織培養皿サーモフィッシャーサイエンティフィック5442
15 mL コニカルチューブコーニング4308
50 mL コニカルチューブコーニング4249
0.4% トリパンブルー溶液シグマT8154生存率
エチルアルコール 200プルーフサーモフィッシャーサイエンティフィック7005
漂白剤サーモフィッシャーサイエンティフィック6009
ウの成分 ック ブラスト抗体で使用します二次抗体で使用しますで使用 で 1x に希釈します

参考文献

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