方法論記事

オリゴマー形成可能な高純度のアミロイドベータ42とアミロイドベータ40ペプチドを、利回りテーラードHPLC精製プロトコル

DOI：

10.3791/55482

⸱

2017年3月27日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California, Santa Cruz

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで我々は、オリゴマー形成が可能な高純度のアミロイドベータ42（Aβ42）とアミロイドベータ40（Aβ40）のペプチドを、もたらす仕立てHPLC精製プロトコルを報告しています。アミロイドベータは、アルツハイマー病に関与する高度に凝集しやすい、疎水性ペプチドです。ペプチドのアミロイド形成性の性質は、その精製の挑戦になります。

要約

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アルツハイマー病に関連するアミロイドベータ(Aβ)のようなアミロイド新生ペプチドは、高純度の材料を得ようとするときに大きな課題を提示することがあります。ここでは、高純度のアミロイドβ 42(Aβ42)およびアミロイドβ 40(Aβ40)ペプチドを作製するためのカスタマイズされたHPLC精製プロトコールを紹介します。私たちは、市販の疎水性ポリ(スチレン/ジビニルベンゼン)固定相、ポリマー実験室逆相-スチレンジビニルベンゼン(PLRP-S)を高pH条件下で組み合わせることで、1回のクロマトグラフィーで高純度(>95%)のAβ42を得ることができることを発見しました。精製は再現性が高く、精製したい材料の量に応じて、半分取条件と分析条件の両方に修正できます。このプロトコールは、Aβ40ペプチドにも同じ成功で適用でき、メソッドを変更する必要はありません。

概要

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アルツハイマー病は、全世界で3,500万人を超える人々に影響を与える神経変性疾患です。疾患の発症と進展に強く関与する1は 、非常に凝集しやすい、疎水性ペプチドのアミロイドベータ（Aβ）です。 2Aβしかし、アミロイドベータ42（Aβ42）は、タンパク質の最も有毒な形態の42アミノ酸の変異体であると考えられている、長さが36〜43個のアミノ酸の範囲です。 3これは容易に拡散し、特に神経毒性実体であると考えられているオリゴマー種を形成するAβ42の能力に大部分で起因します。 図4は、Aβペプチドの我々の理解を促進するためには、日常的に高純度の材料を得ることが不可欠です。微量の不純物の存在は、劇的に、ペプチドの凝集性向特性を変化させることが示されています。 5

Traditionally、例えば、Aβのような疎水性ペプチドの高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分離は、C 4またはC 8シリカベース固定相及び酸性移動相の組み合わせの使用を介して行われてきました。 6しかし、そのような条件は、ペプチドの精製に挑戦を提示することができます。 Aβペプチド（pIが約5.5）の低い等電点7は 、酸性条件下でいることを意味する（ 図2A）ペプチド凝集が増加し、結果としてしばしば単離することが困難である広い、非分解HPLCピークが生成されます。さらに、このようなブロードなピークは、多くの場合、ペプチドの凝集特性に影響を与え、そして一般的に劇的に産生されるペプチドの量に影響を与える可能性精製のその後のラウンドを必要とし得る不純物を含有します。

ポリ（スチレン/ジビニルベンゼン）固定相、PLRP-Sは、purifの代替手段を表し、瑛疎水性ペプチド。固定相は、異なるタンパク質とメッセンジャーリボ核酸（mRNA）の多数の精製に使用されています。 8,9 PLRP-S固定相は逆相分離のための付加的なアルキルリガンドを必要とせず、そしてより重要なペプチドの脱凝集をもたらす高いpHにおいて化学的に安定です。 7ここでは、我々は、高純度のアミロイドベータ42（Aβ42）とアミロイドベータ40（Aβ40）のペプチドをもたらす仕立てHPLC精製プロトコルを報告しています。

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プロトコル

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Aβ40またはAβ42ペプチドの1分取HPLC精製

  1. HPLC精製のための以下の緩衝液を準備します。
    1. 超純水1000mlにNH 4 OH（28％溶液）の1.3ミリリットルを添加することにより、緩衝液A（20mMのNH 4 OH）を調製します。
    2. HPLCグレードのアセトニトリルを800mLの超純水200mlの溶液に、NH 4 OH（28％溶液）の1.3ミリリットルを添加することにより緩衝液B（20mMのNH 4 OHと80％のアセトニトリル）を準備します。
    3. 超純水100mlにNH 4 OH（28％溶液）の100μLを添加することにより、試料の溶解緩衝液（0.1％NH 4 OH）を調製します。
  2. 図1に示すように、セットアップHPLC機器。
    1. 緩衝液Aとポリマーチューブを使用して、HPLCポンプのインレットにBをバッファ含まれている溶媒ボトルを取り付けます。ワンピースフィッティングを用いたHPLCポンプにポリマーチューブを取り付けます。のポリマーチュービングていることを確認してください各バッファは、機器の適切な入口弁に取り付けられています。脱気装置とHPLCポンプを取り付けます。
    2. カップル300Å8μmの25ミリメートルх300ミリメートル取カラムの入口とHPLCポンプは、ポリマーチューブを使用して（ 図1（b）は 、左端の列、物質一覧を参照してください）。
      1. 1ピース手締めフィッティングで取カラムにポリマーチューブを取り付けます。ポリマーカラムは正しい方法で配向していることを確認してください。
        注：分取カラムの固定相は、ポリ（スチレン - ジビニルベンゼン）粒子から構成されています。ポリマーカラムの正しい向きは、単一​​方向矢印とアウターケーシングにマークされています。
    3. ポリマーチューブを使用して、二波長検出器にカラムの出口を接続し、214 nmおよび280 nmの波長検出器を設定します。
      1. のセットアップ機器メソッドオプションで検出波長パラメータを変更することにより、波長を変化させます内蔵のHPLCソフトウェア。
    4. 1ピース手締めフィッティングと波長検出器の入口にポリマーチューブを取り付けます。波長検出器の出力バルブにポリマーチューブを取り付けます。 1ピース手締めフィッティングを用いたHPLC検出器の出口弁にポリマーチューブを取り付けます。これは、試料採取チューブです。
      注：Aβペプチドに強い発色団の欠如は、214nmがピーク収集のための主要な紫外線（UV）波長として使用することを指示します。

figure-protocol-1
図1：アミロイドβペプチドの精製に使用したHPLC機器の実験設定。 （A）脱気装置と、214および280nmに設定された可変波長検出器を取り付けた四HPLCポンプ。アミロイドβペプチドの精製のために使用される（B）HPLCカラムから左から右へ、25×300ミリメートル2分取カラム、7.5×300ミリメートル2セミ分取カラムおよび4.6×250ミリメートル2分析カラム; （C）HPLC分析のために使用される20μLステンレススチール注入ループとマニュアルインジェクタ。 （D）分取し、セミ分取精製のために使用される10mLのステンレススチール注入ループとマニュアルインジェクタ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. （HPLCソフトウェアに組み込まれたセットアップ装置メソッドオプションで）溶剤時刻表のパラメータを変更することにより、精製方法を入力して、表1に示すように、精製方法を実行するためのHPLCソフトウェアをプログラムします。 HPLCソフトの「上」ボタンをクリックすることにより、HPLCポンプをオンにします。
    注：ポンプは、バッファAの開始比を供給を開始し、分取を通じてBをバッファリングしますarativeカラムおよびHPLC機器。
    1. 30分が完全に平衡化するためのシステムのままにしておきます。
時間/分 バッファーAの％ 緩衝液B Bの％ 流量D / mLの分-1
0 80 20 6
45 75.5 24.5 6
45.01 80 20 6
52.01 80 20 6
52.02 73 27 6
85 73 27 6
92 5 95 C 6

<強い>表1：25×300ミリメートルのポリマーカラムを用いてAβ42とAβ40ペプチドの精製のための時刻表。緩衝液A - 20 mMのNH 4 OHとH 2 O; 20mMのNH 4 OHでBが80％のMeCN / 20％H 2 O; cが前のサンプルの次の注射にカラムを洗浄するために15分間走りました。 dは HPLCの計装に6 ml /分の流速を実行するために、圧力限度は200バールに低減する必要があります。

  1. Aβペプチド試料の精製
    注：粗ペプチドは、自動固相ペプチド合成によって得られました。 10
    1. サンプル溶解バッファー4mLの粗Aβペプチドの3ミリグラムを溶解します。室温で30〜60秒間および溶解を助けるために、40キロヘルツの周波数でサンプルを超音波処理。
    2. 16ゲージを取り付けた5mLのプラスチック注射器を用いて、HPLCカラム上にサンプル全体を注入ステンレス製の針。サブステップ1.3に概説されているような精製方法を実行します。
      注：システムは、10mLのステンレススチール注入ループ（ 図1D）を装着したマニュアルインジェクタの使用を介して行われるべき試料注入を可能にします。希望のAβペプチドは、シャープな解像ピーク（ 図2C）として72と74分の間に溶出します。
    3. 50 mLコニカル遠心管に試料を採取します。収集した溶離液を直接注入質量分析を通じてAβピークの身元を確認してください。 11ストア-20℃で最大12時間のための溶離液。
      注：12時間よりも長い期間のためのソリューションのストレージが原因で、ペプチドの酸化のための潜在的にはお勧めできません。
    4. 液体窒素凍結乾燥中のAβペプチドの収集アリコート/アリコートを凍結フラッシュによって精製されたペプチドを分離します。凍結乾燥して-60℃の温度での試料とPRESを凍結乾燥を行います24時間の期間のための20ミリトールのを確認してください。
    5. Aβペプチドの純度を決定するために、下記のように分析用HPLCプロトコルを実行します。 6ヶ月までの期間、-20℃で、それらの凍結乾燥形態で保管ペプチド。

精製されたAβタンパク質の2分析HPLC分析

  1. サブセクション1.1に概説されるようにHPLCバッファを準備します。上記のプロトコルの。
  2. セットアップ手順1.2.1あたり4.6×250ミリメートル分析カラム（ 図1B、右端の列）とに取り付けられた20μLのステンレススチール注入ループ（ 図1C）とマニュアルインジェクタと、図1に示したと同様に分析用HPLC楽器。
  3. ステップ1.3と同様の手順に従って、 表2に示すような分析方法を実行するためのHPLCソフトウェアをプログラムします。
時間/分 バッファーAの％ 緩衝液B Bの％ レート/ mLの分流量-1
0 95 5 1
30 50 50 1

表2：AβペプチドのHPLC純度分析のための時刻表。緩衝液A - 20 mMのNH 4 OHとH 2 O; 20mMのNH 4 OHでBが80％のMeCN / 20％H 2 O。

  1. Aβペプチドの純度分析
    1. サンプル緩衝液中のペプチドの溶解により精製ペプチドを1mg / mLの溶液を調製します。
      注：バッファのレシピは、サブセクション1.1に記載されています。タンパク質濃度は、280nm（280nmの ）でのタンパク質の吸収を測定することによって決定されます。 12メートル濃度を決定するために使用されるOLAR吸光係数（ε）は、ε= 1,490 DM 3モル-1 cm -1 です 。 13
    2. HPLCカラムには1mg / mLの（222μM）溶液20μLを注入し、ステップ2.3で設定した分析法を実行します。
      注：分析のために使用されていない残りの溶液を液体窒素中で急速冷凍し、Aβペプチドを回収するために凍結乾燥することができます。凍結乾燥の詳細は、サブセクション1.4.4に記載されています。 Aβペプチドは、16及び18分（ 図2D）との間の分析カラムから溶出します。 Aβペプチドの純度を決定するためのHPLC機器に付随する組み込みの統合解析ソフトウェアを使用してください。純度は、スペクトルの個々のピークの各々を積分し、ペプチドピーク率面積を計算することによって決定されます。一般的に、> 95％の精製が確認されるべきです。

figure-protocol-2「図2」SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 55482 / 55482fig2.jpg" />
図2：Aβ42の代表的HPLCトレース。 （A）従来のC 4シリカ精製条件：緩衝液A：H 2 O 0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）で、緩衝液B：0.1％TFAとMeCNの（アセトニトリル）、勾配：20〜27％緩衝液B 40分、続いてアイソクラティック27％の緩衝液Bにより、 （B）調製精製25×300 mm 2のポリマーカラム、条件を用いて：緩衝液A：H 2 O 20でmMのNH 4 OH、バッファーB：20mMのNH 4 OH、勾配80％のMeCN / 20％H 2 Oを：アイソクラチック27％緩衝液Bに続いて70分間にわたって20〜27％緩衝液B; 25×300 mm 2のポリマーカラムを用いて分取精製を最適化（C）は 、条件は、サブセクションプロトコル記述テキストの1.3に位置し、表1に記載されています。 （D）分析用HPLCは、4.6×250ミリメートル2ポリマーカラムは、condを使用して、itions：緩衝液A：H 2 O 20 mMのNH 4 OH、緩衝液Bで30分間にわたって20mMのNH 4 OH、グラジエント5〜50％緩衝液Bで80％のMeCN / 20％H 2 O。部品A、BおよびCについてはAβ42に対応するピークは、アスタリスクでマークされています。パートD.質量分析に示すように、Cは、> 95％の純度を明らかに部分的にマークされたAβ42のピークの回収は、Aβ42のピークの同一性を決定するために使用しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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結果

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72および74分（ 図2C）との間の保持時間におけるAβペプチドに鋭い解決ピークの形成PLRP-S固定相と高pHの移動相の結果の組み合わせを使用してAβ42ペプチドの精製。ピークの身元の確認は、収集した溶離液を直接注入質量分析を介して行われます。溶離剤は、最大12時間、溶液中で-20℃で保存することができます。ストレージのより長い期間は、タンパク質の酸化をもたらし得ます。精製されたペプチドを単離するために、溶離液は、液体窒素と凍結乾燥で急速凍結しています。精製されたペプチドの分析HPLCは> 95％（ 図2D）の純度を明らかにする。同じ手順は、この方法を変更することなくAβ40ペプチド（ 図3A）を精製するために使用することができます。分析用HPLCは、Aβ40の純度は95％を超える（ 図3B）であることを示しています。

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ディスカッション

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AβペプチドのHPLC精製は、精製に用いられる固定相とペプチドを溶出するために選択された移動相の両方の選択に大きく依存します。集約のためのペプチドおよび高傾向の低い等電点は、疎水性タンパク質の分離のための伝統的なクロマトグラフィー条件（C4または酸性モバイル溶離液と相まってC8固定相）をレンダリング挑戦、Aβペプチドは長時間の幅広いとして溶出すると、非解決ピーク（ 図2A）。

この問題は、PLRP-S固定相を回避するために、高いpHにおいて化学的に安定では、Aβペプチド（ 図2Bおよび2C）の精製のために有効であることが見出されました。高pH移動相の使用は、凝集の程度を最小化し、最適化されたとき、シャープ、十分に分解されたピークを生じました。最適化されたプロトコルでは、バッファBの割合が急速であったswitc52分の時点で、結果として27％と20％からHED、明確に定義されたAβのピーク（ 図2C）を生じました。この最適化されたプロトコルは、バッ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は彼らの技術支援のためにアジレントに感謝したいと思います。ケイト・マーカムとラファエル・パロミノは、Aβペプチドの合成及び精製におけるそれらの初期支援のために入金され、博士Hsiau偉リーは、原稿の図1を調製する際に彼の助けのために感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アジレント1260インフィニティII四元ポンプアジレントG7111Bhttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
アジレント1260インフィニティIIデュアル可変波長検出器アジレントG7114Ahttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II マニュアルインジェクター 10 mL ステンレス製サンプルループAgilent0101-1232http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II マニュアルインジェクター 20 & マイクロ;Lステンレス鋼サンプルループAgilentG1328Chttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
リングスタンド取り付けブラケットAgilent1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 &マイクロ;m 4.6 x 250 mm (分析用)AgilentPL1512-5501http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42またはAβ40種類のペプチドCEM liberty自動ペプチドシンセサイザーを使用して社内で合成。
水酸化アンモニウム (NH4OH, 28% solution)Fisher ScientificA669-500
アセトニトリルFisher ScientificA998-4
HPLC グレード水Fisher ScientificW5-4
Falcon 50 mL 円錐形遠心分離管Fisher Scientific14-954-49A
Supelco PEEK フィッティング 一体型フィンガータイト、5 個入りパッケージシグマ・アルドリッチZ227250
ノルムジェクト 5 CC滅菌シリンジフィッシャーサイエンティフィック1481729
16ゲージSSニードルレオダイン3725-086
を

参考文献

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