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方法論記事

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

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DOI：

10.3791/55490

⸱

2017年3月22日

 ,  ,  , 
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

この記事について

サマリー

明確な遺伝的背景における個々のWT網膜前駆細胞のライブトラッキングは、神経発生時の細胞非自律的なシグナル伝達の寄与を評価することができます。ここでは、胚移植を介して、およびin vivoタイムラプス共焦点イメージングにおける遺伝子ノックダウン、キメラ世代の組み合わせは、この目的のために利用しました。

要約

遺伝的および技術的な強みは、遺伝子操作の結果は急速な発達期間を通じて生体内で追跡することができたゼブラフィッシュ脊椎動物鍵モデル生物を行いました。複数のプロセスは、細胞増殖、遺伝子発現、細胞遊走及び形態形成を含む、研究することができます。重要なことは、移植を介してキメラの生成を容易にホスト環境の影響下で個々の細胞のモザイク標識および追跡を可能にする、実行することができます。例えば、宿主胚の機能的な遺伝子操作組み合わせることによって（ 例えば、モルホリノマイクロインジェクションによって）ライブイメージング、外因性の影響は、個々の移植されたドナー細胞上の（遺伝的に改変された環境が提供された）細胞非自律信号を評価することができます。ここでは、このアプローチは、細胞の運命determinのタイミングのためのプロキシとして蛍光導入遺伝子発現の発症を比較するために使用される方法を示し異なる遺伝子ホスト環境でエーション。

この記事では、我々は、ドナー細胞をマークするために、ホスト胚における遺伝子ノックダウンを引き起こすためにゼブラフィッシュの胚をマイクロインジェクションのためにin vivoタイムラプス共焦点に準備し、実行するためのキメラ胚を生成するために使用される移植技術、およびプロトコルの説明をプロトコルを提供します複数の胚のイメージング。このような遺伝子発現の開始などのイベントのタイミングを比較した場合、特に、多位置イメージングを行うことが重要です。これは、複数の制御と同時に処理実験胚からのデータ収集が必要です。このようなアプローチは、簡単に選択した任意の器官または組織に外因性の影響の研究のためのイメージングを生きるためにアクセス可能な拡張することができ、移植が確立胚の運命マップに従って、容易に標的とすることができることを条件とします。

概要

in vivoでの脊椎動物における重要な発達過程を視覚化する能力は、ゼブラフィッシュ（1、2に概説されている）正常および疾患状態を研究するための重要なモデル作りに貢献してきました。特に、神経網膜は、中枢神経系のアクセス部分です。網膜は、その高度に組織化された、まだ比較的単純な構造、および脊椎動物種3渡ってその高度に保存された神経細胞の種類に簡単に神経新生の研究を行うために自分自身を貸します。 3次元postfertilizationによってゼブラフィッシュの網膜中心に完成され、増殖、細胞周期の出口、非対称細胞分裂、運命の仕様、分化、および神経回路の形成などの細胞の挙動のダイナミクスretinogenesisのプロセス全体を通して追跡することができます、（ DPF）4、5、REF "> 6、7。

また、上記の各段階における異なる遺伝子の機能要件は、同時にのみ死後検査時に評価することが可能な遺伝子ノックアウト技術の適用に起因する表現型を他の脊椎動物モデルに勝る利点を提供する、ゼブラフィッシュ網膜に評価することができます固定組織の。特に、我々は、網膜におけるレポーター導入遺伝子として蛍光タンパク質の発現を可視化し、監視することができるトランスジェニック株の使用は、我々は、特定の神経細胞型の発生の根底にある遺伝子発現の時間分解能を得ることができます。ゼブラフィッシュの急速な発展に、これらのイベントは、それによって神経細胞のアイデンティティの獲得と細胞挙動に関連する遺伝子発現の時間的な重要性をより深く洞察を提供し、全体の発達期間中に可視化することができます。

最後に、これらのアプローチは、遺伝子機能の二つの重要な側面への洞察が得られ、移植を介してキメラを生成するとゼブラフィッシュで効率的に組み合わせることができます。まず、彼らは非標識野生型環境で開発しながら、特定の遺伝子をノックダウンされたドナー胚から移植された細胞を、調べる、私たちは細胞自律的な方法で、遺伝子機能に関する関連情報を得ることができます。これは、それらが通常で表現された前駆細胞内の網膜の運命決定因子因子の機能に関する重要な洞察につながる。これはもはやこれらの遺伝子4、6から機能性タンパク質を生成することができる前駆細胞の発生運命の結果を検査することによって例示され、 8,9。このアプローチを利用して、我々は多くの運命決定因子の因子（ 例えば、Vsx1、Atoh7、Ptf1a、Barhl2）は、細胞を作用することが示されています-autonomously特定の網膜神経運命を駆動します。遺伝子発現の欠如は、主に遺伝子ノックダウンを有する細胞は、代替の細胞の運命4、6、7、10を採用することにより、生存し続けるように運命のスイッチをもたらします。第二に、このようなキメラ実験は、異なる遺伝的環境内で開発するときに型前駆細胞がどのように振る舞うか野生評価するために使用することができます。例えば、通常操作さホスト環境（ 例えば、遺伝子ノックアウト/ノックダウン）対WTに目的の遺伝子（レポーター導入遺伝子）を発現するWT細胞の発達を比較することによって、遺伝子発現および細胞運命のその影響を評価することができます。ホスト環境における特定のニューロン型の欠如は、例えば、細胞非自律的な方法で、野生型前駆体の挙動に影響を与えることが示されており、過小評価Oへの分化に向かってバイアスそれらにニューロンタイプ4、7、11、12が欠落して rを。網膜神経細胞は、特定の神経細胞の運命決定因子遺伝子の順次時限式（13に総説）（運命の遺伝子発現）によって保存された組織原のために生まれていることを考えると、我々は、野生型の前駆細胞における運命の遺伝子発現のどのタイミングを示すためにこれらのメソッドを使用しましたそのような前駆細胞が誘導される異常な細胞組成物と網膜のホスト環境で開発する際に影響を受けています。ここで、我々はどのように比較的標準と広く使われている技術の組み合わせは、網膜前駆細胞8、9の開発に運命の遺伝子発現のタイミングの検査を可能にします。ための証拠としてこれらのアプローチを概説します

このプロトコルは、あたりの容易さとタイムラプスイメージングを組み合わせた実験的なアプローチについて説明します発達retinogenesisの全期間を通じて個々のモザイク状の標識細胞を追跡するためにゼブラフィッシュ胚の開発エクスビボでの移植を形成します。いずれかの宿主胚に機能的な遺伝子操作を行うことにより、ドナー胚、両方またはどちらも、一方は遺伝子機能の細胞自律性を評価することができます。このアプローチは、ここで説明し、個々の成分が適しているため、他のシステムにおける同様の研究課題に広く適応することができます。

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プロトコル

すべての手順は、動物の管理と使用の実践のためのオーストラリア国立保健医療研究評議会コードの規定に従って行われたと制度倫理委員会によって承認されました。

ゼブラフィッシュの調製

  1. 大人の魚のペアリング
    1. 夕方には、使用前に適切なサイズの繁殖タンク内のペア（または2ペア）として成魚を設定します。
    2. 男性から分離された女性を、維持するために見るために魚を有効にしても、互いに接触しないように分周器を使用しています。
    3. 午前中は、光に切り替えた後、仕切りを取り外して、魚が邪魔されずに交尾することができます。
    4. 成功した交配は元のタンクに戻って成魚を入れた後。
      注：ホストとドナー株は、任意の野生型（WT）株、 例えば 、同じであってもよいです。この研究のためのトランスジェニック系統のTg（atoh7：gapRFP）由来のドナー胚、Tgは（atoh7：gapGFP）またはTG（vsx1：GFP）の運命決定因子因子の発現が早い運転または後期神経運命を可視化することができる、それぞれ14、15、16。以下に説明するように遺伝的環境の異なる効果を比較するために、宿主胚は、特定の変異体またはモルファントすることができます。
  2. 胚コレクション
    1. 飼育箱から卵を収集するために茶こしを使用してください。卵のために出生の時間を決定し、単一細胞期胚がその後の工程のために収集されていることを確認するために15分ごとに確認してください。
    2. E3培地（5のNaCl、0.2mMのKClを、0.4 mMのCaCl 2を、0.9蒸留水でのMgCl 2および2％メチレンブルー）で胚を洗浄し、50の最大密度で〜40mLのE3 17を含むペトリ皿に置き直径90mmのペトリ皿当たり卵。
    3. の菌株名、日付と時刻にペトリ皿にラベルを付けます誕生。解剖顕微鏡下で胚を見ながら任意の破片を除去するために、パスツールホールピペットを使用してください。
    4. 移植のための〜3時間postfertilization（HPF）まで28.5℃で胚を保ち、または微量注入を続行します。
      注：移植については、同様の年齢のドナーとホスト胚を目指します。キンメルらによると32°C -したがって、25の間で異なる飼育温度を利用します。他に一致するように遅くなったり胚の一方のクラッチを高速化する18。
    5. （ - 28時間後に24）タイムラプスイメージングまでコレクションの時から〜32℃で注射していないトランスジェニックドナー胚の20を保管してください。
      注：これらは実験コホートよりも速く発展する以前の蛍光マーカーを発現します。彼らは、このように画像化のためのパラメータ（レーザーパワー、利得）を設定するために使用することができます。この特定の例では、実験群の結像を評価するために、（前の導入遺伝子の発現を開始しこのイベントの正確なタイミング）。

マイクロインジェクションのため2.準備

  1. マイクロインジェクションの針の準備
    1. 同じ長さの2本の針を得るために、中央に各ホウケイ酸ガラス毛細管（1.0ミリメートルOD / 0.78ミリメートルのID / 100ミリメートル、長ガラスキャピラリー）から針を引っ張って針プラーを使用してください。長いシャフトとテーパー針を目指します。
      注：ここで使用される針プラー用の設定例は、中に供給され、 材料一覧。
    2. ペトリ皿に引っ張ら針を格納し、成形可能なパテや接着テープのストリップにそれらを押して固定します。
    3. 注射前に解剖顕微鏡下で焦点の針の先端を持参し、先端に針をこじ開けるために鉗子を使用しています。小さな開口部（ 図1C）と鋭い先細の先端を目指します。
    2. <ホスト胚のためのLI>モルホリノ準備
    1. 注文モルホリノオリゴヌクレオチドは、具体的には、目的の遺伝子と同様に、標準的な制御モルホリノまたは手続き及び取扱いの影響を制御するために、適切な5塩基対ミスマッチのために設計されています。
      注：ここでは、ヒトβ-グロビンイントロン変異を標的とする中間生まれ水平とアマクリン細胞の発達を阻害する配列5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'でモルホリノPtf1aを遮断翻訳、および標準コントロールゼブラフィッシュのモルホリノ（5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 '）7、19を使用しました。
    2. 室温で - （8.5 ngの/ nLの〜8）と店舗の1mMモルフォリノ原液を準備します。
    3. 注射の日に、（それが使用中に室温で保持することができた後）、65℃から冷却さ氷上簡単かつ場所回転、10分間65℃でモルホリノのアリコート（10μL）を加熱します。目潜在的ノックダウンの有効性を減少させることができるモルホリノ液、内凝集任意の逆になりますです。
      1. Ptf1aのモルホリノと同等の標準制御モルホリノについては、蒸留水でモルホリノ原液を希釈することにより6 NG / nLののワーキング溶液を調製。室温で保管してください。
        注：以前に7決定されるように胚あたりモルホリノの使用2 nLのPtf1aモルホリノは、胚あたり12 ngの比較的高い作業濃度を必要とします。ほとんどのモルフォリノのために、2 - 胚あたり5 ngのが効果的であるので、2に株式を希釈 - 5 ngの/ nLの各胚に1 nLのを注入します。
  2. ラベリングドナー胚について蛍光ヒストン融合レポーター構築物を準備
    注：トランスジェニックドナーを使用してかどうかを区別/ホスト胚内のドナー細胞を可視化するために、H2A-GFP（のマイクロインジェクションを含むドナー胚を標識する様々なアプローチが存在します赤色蛍光レポーター）または単一細胞期のドナー胚の卵黄にH2B-RFP（緑色蛍光記者とトランスジェニックのドナーを使用している場合）のmRNA。
    1. レポーターDNAを含有する少なくとも1μgのプラスミドを線形。
      注：ここではPCS2 +プラスミド（生成され、親切にミシガン大学から教授デビッド・ターナーとバイオメディカルセンターミュンヘンから教授ラルフ・ラップによって提供される）H2A-GFPまたは博士クリストファー・ウィルキンソンによって生成されたH2B-RFP（、ロイヤル・ホロウェイを含みます、ロンドン大学）は、NotI制限酵素消化で線状化しました。
    2. 製造業者の説明書に従って市販のキットを用いてDNAを精製します。
    3. 製造者の指示に従って、適切なポリメラーゼで市販のキットを使用してmRNAを転写します。 PCS2 +プラスミドの場合は、SP6ポリメラーゼキットを使用します。
    4. 製造元の指示に従ってイソプロパノール沈殿に続いて市販のキットまたはフェノール - クロロホルム抽出を用いてmRNAを精製秒。超純水でのmRNAを希釈（20から30μL）、-80℃での分光光度計や店舗での濃度を測定。
    5. 注射の日に、100 ngの/μLの最終濃度で滅菌水にmRNAのワーキング溶液を調製し、氷上に保ちます。バック-80℃に未使用のmRNAの株式を返します。

単一細胞期胚へのモルフォリノおよび/またはmRNAの3マイクロインジェクション

注：マイクロインジェクションは、すべてのドナー細胞をマークするために、異なるホスト環境（制御および遺伝子ノックダウン）を調製し、mRNAまたはモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド20、21の注射を含むために使用されます。

  1. 注射針を読み込みとキャリブレーション
    1. microloaderピペットチップを使用して、モルホリノおよび/またはヒストン蛍光融合mRNAのソリューションの3μLと注射針を積み込みます。
    2. solutを振ります残りの気泡がなくなるまで注射針の先端に向かってイオン。ソリューションは、主に毛細管現象により先端に描画されるように挿入し、内部ガラスに注射針を使用してください。
    3. マイクロマニピュレーター（3Dマニュアルマイクロマニピュレーター）に取り付けられたホルダに注射針を取り付け、チューブハウジング内に密封を確保します。
    4. 圧力調節マイクロインジェクタへの電力・ガス供給をオンにします。
    5. （目盛接眼レンズを使用している場合）皿の中の鉱物油の滴に針の先端を浸したり、ドロップボリュームを校正するためにマイクロメータスライド上に直接針の先端を合わせます。フットペダルを押して注入量を測定し、注入量は1 nLの（125μmの直径）と同じになるまで、ガス圧及び/又は持続時間を調整します。
      注：マイクロメータスライドの利点は、測定がしかし、接眼目盛インを使用することにより、顕微鏡で使用倍率から独立しているということですTEAD、噴射液滴とスケールが同時に焦点であることができます。
  2. 胚のマイクロインジェクション
    1. ペトリ皿で顕微鏡スライドを配置し、スライド縁に沿って単一細胞期胚を堆積させるために、転送ピペットを使用しています。カットオフ細い先端の半分でmicroloaderピペットチップを使用して、単一の列に合わせます。注射時の動きを防止するために、微細なトランスファーピペットでできるだけ多くの液体（ 図1A）を取り外します。
    2. 各胚に向けて針を下げ、そして1滑らかなストローク（ 図1B）で絨毛膜と卵黄を貫通しています。
    3. 針の先端は、フットペダルを押すことによって卵黄、顕微注入するの中央に配置されたら。単一細胞期のドナー胚（トランスジェニック）の卵黄にH2A-GFPまたはH2B-RFPのmRNAの1 nLのを注入します。二回フットペダルを押すことによって、単一細胞期野生型宿主胚の卵黄に標準MOやPtf1a MOの2 nLのを注入します。成功した注射はSmalのことで可視化することができます卵黄中リットル空間変形。
    4. （ - 60胚50）の位置に次の胚を持参し、胚の​​列全体が注入されるまで注入し続けるために胚を含む皿を移動し、注射針を外します。
    5. すべての胚を注入した後、30で皿を持ち上げ - 45°の角度と新しいきれいなペトリ皿に注入した胚を転送するためにE3培地（スクイーズボトル）の穏やかな流れを使用します。
    6. インキュベーターで胚皿を置きます（どちらかの28.5°Cまたは他の温度でドナーとホスト胚は同等の年齢であることを保証するため）。
    7. 250ホスト胚 - 〜100ドナー胚または〜200を得るために、3.2.6に必要な - を繰り返して、3.2.1を繰り返します。
    8. 1時 - 2 HPF、解剖顕微鏡下で胚を確認し、パスツールホールピペットで2または4セルの段階に進んでいないすべての未受精卵を削除します。

移植のため4.準備

ontent ">注：移植は異なる遺伝子ホスト環境の影響9等価WTドナー前駆細胞内で評価することを可能にするキメラ胚を生成するために使用される、22、23。

  1. ドナー胚の選択
    1. 3 HPFでは、2のドナー胚をチェック - ラベリング信号用の5倍の倍率を蛍光顕微鏡下で。よく発達した選択（均等サイズのセルとの対称細胞塊）GFPプラスフィルターを使用して、強い蛍光シグナル（460から500 nmの励起、510nmのロングパス発光）またはテキサスレッドフィルター（540と胚 - 580 nm励起、610 nmのロングパス発光）（ 図1D）。トランスジェニック記者はまだ発現されません。
  2. アガロース注入プレートとペトリ皿の準備
    1. 直径90mmのペトリ皿にE3培地で希釈し、溶融2％アガロースを注ぎ、皿が安全になるまで、それはクールダウンしましょう触る。ホットアガロースは、そうでなければ、金型を変形させることができます。
    2. アガロース（ 図2D、E）にくさび状の突起（6×25 /金型）とプラスチック金型をフロート。アガロース上に金型の一方の側に配置し、他の側を下にゆっくりと低いことにより、気泡を避けてください。金型は、移植針のための十分な隙間空間を可能にするために皿にまたはくさび状突起の最深点の側に中央に配置されていることを確認します。
    3. アガロースが完全に室温で固化することを可能にします。
    4. 4℃で30分間、アガロース皿を置き、静かに1コーナー（ 例えば、ピンセットで）から持ち上げて金型を削除します。乾燥からそれらを防ぐためにE3培地とパラフィンフィルムシールの小容量で4℃で一日、実験前と店舗へのアガロース注入プレートを準備します。
    5. 移植前に、E3媒体とアガロース注入プレートを記入し、少なくとも30分間、28.5℃のインキュベーターに配置します。
    6. dechorionated胚は、いずれかの使用のガラス食器やコートE3で2％アガロースの薄層を有するペトリ皿（直径90mm）の内側のプラスチックに固執するので。 dechorionatedホスト胚のための一皿、dechorionatedドナー胚およびすべての40移植胚のための1つの皿のための1つの皿を準備します。注入プレート（4.2.4）で説明したように保管してください。
  3. トランスファーピペットの準備
    1. 先端が下がるまで回転しながらダイヤモンドナイフで引っ掻くことにより、快適な操縦（オプション）を可能にする長さに長い形細かく引かガラスチップパスツールピペット（2 mL容量、230ミリメートルの長さ、長さ100mm、先端）の先端をカットオフ（ 図1F）。
    2. カットがまっすぐであることを確認してください。ファイアーポリッシュdechorionated胚（ 図1F）を損傷しないように滑らかな末端を生成するためにブンゼンバーナーで切断面を回転させることによってガラストランスファーピペット。
      注：ワットあまりにも長い間炎にピペットチップを維持開口部における病気の結果は、密閉または胚のために小さくなり過ぎるされています。
  4. 胞胚期のドナーとホスト胚をDechorionating
    1. 胚に触れることなく、各絨毛膜を開いて引き裂く、または酵素的に胚9の多数の同時急速dechorionationを可能にするために、プロテアーゼを使用することにより、2つの微細なピンセットでDechorionate胚手動。
      1. 、50ミリグラム/ mLのプロテアーゼ混合物の100倍原液を調製し、100μLのアリコートを作成し、-20℃で保管してください。
      2. 10 mLのE3培地（0.5ミリグラム/ mLのプロテアーゼの最終濃度）に株式プロテアーゼの100μLを加えます。
      3. 二つの別々の小さな三角ガラスビーカー（10 mL）によく発達したホストとドナー胚を置き、できるだけ多くの液体を除去します。
      4. 各ビーカーに0.5ミリグラム/ mLのプロテアーゼ溶液5mLを加え、穏やかに解剖顕微鏡下でそれらを見ながら胚を旋回。絨毛膜の変形の兆候を監視します。
      5. 旋回をしてください。すぐに最初の胚は、絨毛膜（ 図1D、アスタリスク）の外であるとして、液体のほとんどを注ぎ、ゆっくりと側面に沿ってE3に注ぐことによって、フラスコを補充することによりプロテアーゼ溶液を除去するために、E3培地で3迅速なリンスを行います。彼らが破裂するように、dechorionated胚を移植の終わり（第5節）まで、後続工程のいずれかで空気に触れないようにしてください。リンスの間にフラスコ中で適切な解決策を残します。
      6. 火災研磨されたガラス転送ピペットを用いて、ガラスペトリ皿またはアガロース（E3培地で2％）コーティングされたプラスチック皿に三角ビーカーから胚を移します。静かに残りの弱体化絨毛膜を除去するために、転送中にピペット。
  5. 移植針の準備
    1. 1.0ミリメートルOD（各ホウケイ酸薄肉ガラス管から2本の針を引っ張って針プラーを使用しますマイクロインジェクションピペットと同じ設定で/ 0.78ミリメートルID / 100ミリメートルの長さ）。
      注：ここで使用される針プラー用の設定例は、物質一覧に供給されています。この損害賠償細胞が針に吸い込まとして移植針は、ガラスインサートを持っていません。
    2. ペトリ皿に、事前に店舗を針を引いて、成形可能なパテや接着テープのストリップに押して固定します。
    3. 移植前に解剖顕微鏡下で焦点の針の先端を持参し、先端に針をこじ開けるために鉗子を使用しています。フルート形状（ 図2G）を目指し、または先端形状23を生成するために説明されている代替の方法を使用するために、針の形状を調整するために微細な鉗子を使用してください。

胞胚移植を介した5キメラの生成

  1. 移植のセットアップ
    注記：ここでは、自己組織移植装置を使用した（ 図2A ）。
    1. （マイクロマニピュレータに取り付けられて、ステップ3.1.3）の上にマイクロインジェクションのために使用したのと同じ針ホルダ内移植針をマウントし（ 図2A）。
    2. マイクロインジェクションのために使用される圧力調節マイクロインジェクターにマイクロピペットホルダーの端を結ぶ注入チューブを外します。移植のリグを表す1 mLシリンジ（ 図2A、B）、にリンクされている注入チューブを取り付けます。
      1. すべての接続がしっかりパラフィンフィルムや成形可能なパテを使用して密封されていることを確認してください。移植針自体にいくつかのE3媒体が常に存在することを確実にすることにより、空気と接触するから胚を防ぎます。移植針のうち、細胞/液体を吸うために手動で注射器を操作してください。
  2. 胚アライメント
    1. アガロース金型の最初の列にガラスピペットを用いてドナー胚を移します。列にホスト胚を移し2アガロースモールド（ 図2F）の6へ。割球側が上を向くようにピペットで胚を置きます。
  3. 移植
    1. 静かにドナー胚の割球細胞に移植針を休ませ、ゆっくりと約20吸う-移植針（ 図2H）に50個の細胞を。卵黄を吸い上げないようにしてください。
    2. マイクロマニピュレーターを用いて、ドナー胚から移植針を持ち上げます。左にアガロースモールド皿を移動し、最初の宿主胚の動物極に細胞塊の側を通って移植針の先端を挿入します。デポジットは5 -この領域は前脳/アイ・フィールド24（ 図2I）を生じさせることを示す運命のマッピングに従って表面付近の10の細胞。手順全体を通じてE3培地に浸漬針の先端を保管してください。
  4. 移植胚のケア
    1. ドナー胚aを削除します28.5°Cで2時間 - 番目の1のためにアガロース金型内のホスト胚を残します。これは、撮像を妨害するような色素形成を防ぐために、0.003％のN-フェニルチオ尿素（PTU）を含むE3媒体をガラスまたはプラスチック（2％アガロースでコーティングされた）ペトリ皿を埋めます。火災研磨したガラスピペットを用いて、これらの皿に、ホスト胚を移し、28.5°CO / Nでインキュベートします。
      注意：PTUを取り扱う際は手袋を着用してください。

6.ライブイメージングのセットアップ

注：小型かつ急速な発展と組み合わせたゼブラフィッシュの光透過性は、それが別の細胞や臓器のin vivoイメージングのための重要な脊椎動物のモデルになることを許可しています。イメージングは​​、設定やパラメータが異なるであろう顕微鏡の様々なに対して行うことができます。以下は、網膜の開発5、8のイメージングに適した共焦点イメージングセットアップについて説明します。

  1. キメラ胚選択
    1. 24時 - 26 HPF、開発目の原基に移植ドナー細胞（H2A-GFPまたは標識H2B-RFP）を示す健康なよく発達した胚を選択するために、蛍光解剖スコープの下に移植した胚を選別します。
    2. 胚を麻酔する（MS222）新しい皿にピペットで装着するための40の胚まで置いておきますと、0.4 mg / mlでトリカインmethanesulfateを追加します。
      注意：MS222を取り扱う際は手袋を着用してください。
  2. 取付胚
    注：イメージングは8倒立または正立顕微鏡（ここで説明）上で実行されるかどうかに応じて、適切な取り付け皿を使用してください。
    1. E3培地中の0.4mg / mLのMS222に1％の低融点アガロースの1 mLを含む1.5数mLのプラスチックチューブを準備し、40℃の水浴中で溶融しておきます。
    2. プラスチック製のトランスファーピペットに5胚を吸うと胚は重力によって先端に蓄積してみましょう。トランスファーピペットをタッチ低溶融アガロース1％及び0.4 mgの胚は、E3の転送量を制限しながら、チューブ内にシンクすることを可能にする/ mLのMS222を含む準備プラスチックチューブの一方の表面上に。
    3. 正立顕微鏡と倒立顕微鏡でのイメージング用ガラス底シャーレ（任意のサイズ）の撮像のための直径90mmのペトリ皿でマウント胚。視覚的イメージ（片側）のWT宿主におけるドナーまたは同じ実験でモルファントホスト（反対側）に2等分に皿のいずれかを分割するために永久的なマーカーを使用してください。
    4. 1 mLのアガロース - 0.5とペトリ皿のいずれかにアガロースプラスチックチューブから5胚を移します。 （ - 300μL〜200）のままで唯一の小滴は、そのように転送ピペットを用いて、過剰なアガロースを削除します。直立顕微鏡で撮影した場合、シャーレの円周の1cm以内に胚を配置しないように。イメージングのために使用される水浸浸漬レンズによりペトリ皿の壁にその領域内にセンタリングすることができないかもしれない（ 図3A </強いです>）。
    5. アガロースが固化するまで横方向に胚を整列させるために（折れ先端を有する）マイクロローディングピペットを使用してください。頭部の両側にある2つ目は（ 図3B）（XY寸法に整列）完全に重複している場合は料理の両方のタイプのために、胚を正しく横方向に傾斜しています。倒立顕微鏡での使用のためには、カバーガラスに近い目は、可能なフォーカスレベルの制約内でz次元を通してイメージングを可能にするために、可能な限りカバーガラスの近くにプッシュする必要があります。
    6. 個々のアガロース滴で一度に5胚をマウント続けます。アガロースは互いにイメージング（ 図3A）の間の任意の脱落と横方向の移動を防止するために、皿の側に下がる参加するより1％低融点アガロースを使用してください。
    7. 一度完全に固化し、E3培地で皿をカバー（PTU 0.003％を含有し、0.4 mg / mlとMS222）28.5℃に予め温めました。
    8. ステップ6.2.2に記載したのと同じアプローチを使用して- 6.2.8は、〜別々の皿に32°C（ステップ1.2.5）で上昇20トランスジェニック胚をマウントします。
  3. 撮像パラメータ
    注：蛍光導入遺伝子の発現を分析するためのイメージングは​​、高い空間細胞内の解像度を必要としません。これは、Wプラン - アポクロマート20X / 1.5ズームで1.0 DIC M27 70 mmの目的で行うことができます。
    1. （;ステップ6.2.8 すなわち 32℃で昇）開発加速で〜20トランスジェニック胚のための導入遺伝子の強度に基づいてレーザパワーと露光時間を設定します。
      注：導入遺伝子発現の発症の研究のために、実験的な胚はタイムラプスは、このように設定され、現時点では蛍光を示さない、これらの加速の胚は、イメージングのパラメータを決定するために重要です。
    2. 実験ディッシュについては、各胚を視覚化し、位置を保存し、胚のレベルに焦点を当てます。
      1. （ すなわち 、横方向sの正しい取り付け角度を持つ胚を選択してくださいできるだけ水平に目のIDE）と強いハートビート（健康の指標）。主に（遺伝子発現の波が始まる）の開発網膜（ 図3C）の前腹側象限に（H2A-GFPまたはH2B-RFP標識により識別される）いくつかの移植ドナー細胞と胚を選択してください。
        注： - 25分180拍/ゼブラフィッシュの胚では、平均心拍数は120です。 120拍/分 - 麻酔した胚では、健康的なハートビートは60の範囲内であってもよいです。遅い心拍が低下生存能力の指標である可能性があり、その胚を研究から除外されるべきです。
    3. 最大15胚の網膜を介して2μmの間隔で光学切片のzスタックを設定します。
      注：任意の実験で画像化することができる胚の合計数は、個々のパラメータ（露光時間及びzスタック・サイズ）に依存するであろう。選択された胚のすべてのための画像1の時点にかかる時間はSHである必要があります時点間の間隔よりもorter。いくつかの深さ分解能を犠牲にすることによって、より多くの胚の時間間隔内に画像化することができます。 zスタックの限界が搭載された胚の目の横方向と内側の極端として選択され、30ミクロンは、z方向にこのセットアップシフトなどで発生中の胚の目のように、直立顕微鏡のセットアップの横側に追加されます胚は一晩増殖します。 170ミクロンの厚さ（50 - - 85枚/アイ）これはスタック100になります。
    4. 導入遺伝子に対するレーザ/チャネルの適切なを使用して、32°C（0.5 HPF間隔に相当）で画像ごとに24分を取ります。
      注：胚は顕微鏡全体を網羅する加熱されたチャンバ内の全体の時間経過を通してステージ上に残ります。 24時間タイムラプス期間 - 実験は28℃で行うことができますが、気温の上昇は、開発をスピードアップし、実験では、関連する時点が16内に結像されることを保証するために使用されています。
    5. 画像順次走査を使用し、導入遺伝子（GFP：RFPまたはVsx1 Atoh7） - ドナーラベル（オプションH2A-GFPまたはH2B-RFP）を表すチャンネル。分析のために、説明したように適切な胚を選択します（撮影の開始時に1 zスタックを取る）した後、導入遺伝子の発現をキャプチャするだけのチャンネルにタイムラプスを実行するための唯一のドナー標識を利用します。
      注：別の方法として、適切な胚を選択するだけでドナーラベルを使用（ すなわち確認移植前方腹側象限内の細胞を持つもの）と画像のみ導入遺伝子チャンネル、おおよそ撮像時間を半減し、ほぼ結像さごとに分析することができる胚の数を2倍に実験（ 図4）。

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結果

この作品は、野生型の網膜前駆細胞がモルファント宿主胚内で開発する場合、遺伝子の発現タイミングの変化を評価するための実験プロトコルを提示します。実験宿主胚は、網膜7、26の中間生まれ水平およびアマクリン介在ニューロンを欠いPtf1aのモルファント、です。これらは、標準の制御モルホリノを注射した宿主胚を制御するために比較されました。

（網膜を含む）、中枢神経系発生を横切るニューロンの異なるタイプの神経新生ので高度に保存された組織原のため27、28、29、30、31...

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ディスカッション

効率的に特定の有糸分裂後の細胞型、あるいはパターン化された組織に分化する胚性または誘導された多能性幹細胞を指示することを目指したときにエクステントがどの隣接セルが重要な細胞の運命決定因子の発現のタイミングに影響を与えるように理解することが不可欠です。また、生きている動物の開発細胞におけるこれらの分子事象を調べることに加えて、関連する動的な生体内でこれらのイベントに関連付けられた特定の細胞の文脈上の（時間的および空間的）情報を提供しています。このような研究を容易にすべての脊椎動物モデルで達成することができません。

提示されたプロトコルでは、影響を受けやすいゼブラフィッシュの胚は、脊椎動物の網膜のさらに高度に組織化され、比較的単純な3次元パターン化された組織において、in vivoでこれらの問題に対処するための脊椎動物のモデルとして利用されています。これは、特定の網膜細胞を枯渇させるという仮説をテストすることによって例示されます型は、遺伝子発現のタイミングおよび網膜前駆細胞の発生運命に影響を与えます。我々はさらに、導入遺伝子の発現は...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品は、PRJ（DE120101311）へとLP（PO 1440 / 1-1）にドイツ学術協会（DFG）研究助成金によってARC DECRAによってサポートされていました。オーストラリアの再生医療研究所は、ビクトリア州政府とオーストラリア連邦政府からの資金によってサポートされています。私たちは、圭らに公開され、ここで説明した実験を行った博士ジェレミー呉チー圭を、認めます。 、2016年には、我々は教授東島からトランスジェニック魚の規定に感謝していとPROFSに感謝します。 H2B-RFPとH2A-GFP構築物を生成するためのPCS2 +プラスミドと博士ウィルキンソンの提供のためにターナーとラップ。私たちは、動物の世話をするためのFishCore施設のスタッフ（モナッシュ大学）に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロースバイオラインBIO-41025アガロースコーティングされた皿は、数日前に準備することができ、乾燥を防ぐためにパラフィルムで密封し、4 °で保管することができます。C
アガロース低溶融シグマA9414-100Gは、大容量で調製でき、マイクロ波で液化し、40 °で溶融状態に保つことができます。Cウォーターバス。1 mLのアリコートを調製できます(マウントされた胚のグループごとに1つ)。
ホウケイ酸ガラス毛細管、フィラメントなしSDR Scientfic30-0035同様の直径の代替品を使用できます 
フィラメント付きホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブSDR Scientfic30-0038直径の代替品を使用できます 
ガラスペトリ皿(直径60mm)科学供給1070506任意のサイズの任意のガラス代替品
インジェクションチューブ(2m)エッペンドルフ524616004これは、移植中にニードルホルダーをシリンジに接続します
マイクロインジェクションモールド(くさび形の突起を持つプラスチックモールド)適応科学ツールPT-1の代替品は、
マイクロニードルを使用することができますホルダーNarishigeM-152インジェクション針の外径に適合する任意の代替品は、
マイクロインジェクターNarishigeまたはEppendorf Femtojet空気圧インジェクター、ガス圧力
マイクロマニピュレーターCoherent ScientificM330IR同様の代替品を使用することができます
ローダーチップEppendorf5242956003
鉱油シグマM5904-500ML
の針の引き手のSutterの器械モデルP-2000この引き手に使用する設定は次のとおりである:H 430、Fil 4、Vel 50、Del 225、Pul 75。適切な先端寸法
パラフィルムインターパスPM996任意のパラフィンフィルム
パスツールピペット プラスチックサムコサイエンティフィック202
パスツールピペットガラスヒルシュマン Laborgeraete9260101
プロナーゼシグマP5942-25MG プロテアーゼタイプXIV
N-フェニルチオ尿素シグマP7629-25GPTUは有毒であり、粉末への頻繁な曝露を避けるためのストック溶液として調製することができます、購入/使用前にMSDSにご相談ください。
Qiaquickゲル抽出Qiagen28704DNAを精製するための任意の代替手段を使用することができます
Rneasy MiniキットQiagen74104RNAを精製するための任意の代替手段を使用することができます
SP6 mMessageキットQiagenAM1340SP6を使用してDNAを転写するための任意の代替手段
、、同様の同様の形状のを使用した空気圧インジェクター、マイクロ

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細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング
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