方法論記事

のフェーズI代謝コンピテンシーを特徴づけるために質量分析とルミネベースのアプローチ

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DOI：

10.3791/55502

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2017年3月28日

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1Research and Development, British American Tobacco

この記事について

サマリー

in vitro系の代謝能力は、薬物や毒物の生体内変化及び処分のための重要な要件です。このプロトコルでは、我々は、私は細胞培養で代謝相を評価するための基準の代謝プローブのアプリケーションを記述します。

要約

生体異物代謝酵素は、溶解度を増加し、排泄を促進する官能基を追加することにより、医薬品や毒物の生体内変化における重要な機能を果たしています。いくつかの場面で、それらの構造変更は、新毒性産物の形成につながります。動物実験を低減するために、化学的リスクは、代謝コンピテント細胞を用いて評価することができます。代謝酵素の発現は、しかしながら、 インビトロでの初代培養系において多くの時間にわたって安定ではなく、多くの場合、細胞株において部分的または不在です。したがって、in vitroでの薬品、添加物、および環境汚染物質代謝の研究は、理想的に代謝活性を特徴づけされた細胞系で実施されるべきです。ここではUPLC質量分析法による定量化化学プローブおよびそれらの代謝産物を使用して、2D細胞株および初代3D培養における代謝酵素（ヒトフェーズI）のクラスの活性を測定する手法を説明しルミノメトリー。この方法は、細胞株および種々の組織に由来する一次細胞における代謝活性を試験するために実施することができます。

概要

生体異物代謝は身体に対して外来の化学物質は、それらの排泄1を容易にするために親水性基とのコンジュゲートの付加によって修飾されるプロセスです。典型的には、生体異物の代謝は、Iは、1つまたは複数のヒドロキシル基1、2を添加した酸化の大部分からなる相との二段階プロセスです。例えばグルクロニドまたは硫酸部分1,2のような親水性結合体のための受容体として、フェーズIIにおいて、ヒドロキシル基が使用されます。受容体基が分子にすでに存在する場合、結合ステップは、独立して、フェーズI代謝の発生する可能性があります。各反応は、ヒドロキシル化（ 図1）及び化学基板3の脱アルキル化を触媒する酵素の特定の群、 例えば 、のCYP（シトクロムP450類）により行われます。 ConjugatioNスルホトランスフェラーゼによって触媒される、UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ（ 図1）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼおよびN-アセチルトランスフェラーゼ4。各組織及び臓器は、肝臓はこれらのタンパク質のほとんどを発現すると、特定の代謝酵素の発現プロファイルを有することになります。

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図1：クマリンためのフェーズIおよびフェーズII代謝の例。 CYP2A6 / CYP2A13クマリンの7 - 水酸化を触媒します。 7-ヒドロキシクマリンは、UGT1A6及びUGT1A9が最も高い活性を示すと、第II相酵素UGTsによってグルクロニド部分に結合されています。

生体異物の代謝を理解することは、二つの理由のための医薬品の安全性の評価では、化学的リスク評価のために重要である：反応速度は、薬物や化学物質がアクティブまたは非アクティブのB型で体内に残存する期間を決定しますEFORE排泄。親化合物は、代謝酵素によって、より反応性不安定で有毒種に変更することができます。また、「生物活性」として知られているような反応は、主相II抱合5によって位相I CYP酵素によっても稀な機会に駆動されます。

これに基づいて、正確に薬剤または化学的に関連するリスクを予測するためのインビトロモデルの能力は、細胞系の代謝能力に大きく依存します。罹患組織から、または正常細胞の形質転換に由来する細胞株は、多くの場合、一部でない場合起源6のそれらの組織の代謝酵素プロファイル代表のすべてを失います。正常な代謝酵素プロファイルのメンテナンスは、（少なくとも短期培養において）、一次細胞培養物におけるより良い表示され、組織は、その3次元構造体1を保持することを可能にするマトリックスで培養した場合に、さらに改善されます。したがって、CHARインビトロ細胞系の代謝能力のacterizationは、細胞モデルは、化学的安全性評価を実施することが適切であるに関する決定を導く上で重要な予備的なステップです。

本稿では、肝細胞ライン7と3D原発性肺細胞培養8とのそれらのアプリケーションの例を用いてインビトロでフェーズI CYP酵素の活性および発現をプロファイリングするためのプロトコルを提示します。 CYP特異的基質、それらの代謝産物及び阻害剤対照を質量spectrometry-およびルミネセンスに基づく定量方法と共に記載されています。いくつかのCYP誘導性であり、他のものは構成的であるので、実施例はまた、これらの2つのシナリオについて説明します。

プロトコル

注：代謝活性アッセイのための一般的なワークフローを図2に概説されています。このワークフローの各ステップは、その後、次の段落で詳述されています。試薬および装置の詳細な表は材料の表に示されています。

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図2：代謝プローブアッセイのワークフロー。細胞を播種し、十分な密度まで増殖させます。 CYP誘導ステップは、アッセイ、酵素活性に応じて必要となる場合があります。プローブ基質及び阻害剤は、細胞培養物に添加されます。インキュベーション期間の後、培地を分析のために収集され、細胞をタンパク質定量のために溶解されます。媒体は、質量分析又はルミノメトリーによるプローブ基板の代謝産物の分析のために処理されます。広告/ 55502 / 55502fig2large.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

1.細胞培養

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図3：肝細胞株の文化の光透過顕微鏡写真。このプロトコル5に記載の細胞株は、典型的には、培養物中の胆管と肝細胞との間の50％のスプリット（100X）で分化します。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 肝細胞株培養
    注：市販の肝細胞株は、代謝的にコンピテントな細胞の例として使用しました。細胞株は、ウイルス感染によって引き起こされる肝がん由来した7。コンフルエントに、この細胞株は、（ 図3）cholangiocyte-及び肝細胞様細胞に分化し、さらに詳細がGuillouzo 7に見出すことができます。培地に2％DMS​​Oを含むことは、のCYPの種々のこの細胞株および発現の分化を支持しています。
    1. 液体窒素から細胞を用いた極低温バイアルを取り外し、輸送のためにドライアイスの上に置きます。 1~2分間37℃に予熱した水浴中にクリオバイアルに移し、層流フード内に配置する前に70％エタノールでバイアルの外側を滅菌します。
    2. 無菌条件下で作業しながら、注意深く過剰な圧力を解放し、37℃で予熱したウィリアムズE培地の9 mLで充填された10mLのチューブに極低温バイアルの内容物をピペッティングするための極低温バイアルを開きます。
    3. 室温で400×gで10分間溶液を遠心し、上清を捨て、そして5mLに細胞を再懸濁独自の融解媒体は、37℃で予備加温しグルタミン、またはグルタミンサプリメント（2mMの最終濃度）（ウィリアムズE +グルタミンサプリメント+融解サプリメント）を補充しました。
    4. セルカウンタ500μLのアリコートまたは任意の他の適切な細胞計数技術を用いて生細胞を数えます。
    5. 0.6×10 6生細胞/ウェルの密度で解凍培地0.5mlの最終体積で24ウェルコラーゲンコートプレートに細胞を播種します。
    6. 5％/ 95％CO 2 /空気および相対湿度100％で37℃のインキュベーター中でプレート（単数または複数）を置きます。
    7. 24時間細胞を播種した後、予め温めておいたメンテナンス/代謝作動媒体の0.5mLの（ウィリアムズE +グルタミンサプリメント+代謝サプリメント（この培地は既にDMSOを含有する））を含む培地を交換してください。 2日ごとに培地を変更します。
    8. 数日後に培養中の細胞はサブコンフルエント小柱構造（ 図3）を形成します。最適な代謝活性は、典型的には、7日目と10との間に観察され、4日目に最低です。

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図4：気液界面8で成長アルシアンブルー染色の気道細胞の断面図。
繊毛、粘液産生および基底細胞がはっきりと見えます。スケールバー= 250μmで。

  1. 差別気道上皮培養
    注：プロトコルは、インサート8（ 図4）に空気-液体界面で成長させ、市販の完全に分化した一次気道上皮で示されています。組織培養は、粘膜毛様体の表現型と細胞極性8を保持します。細胞は、鼻や気管支起源であり得ます。ここでは、人間の鼻の細胞を使用しています。細胞を24と培養プレートフォーマットで提供されています気液界面に挿入します。輸送を容易にし、媒体流出を避けるためにインサートを培養培地と混合したアガロースマトリックス中に埋め込まれた基底部に同梱されています。
    1. 細胞の送達の際に、清浄な層流フード内に配置する前に70％エタノール溶液で24のインサートを含有するプレートを滅菌します。
    2. 予め温めておいた700μLに独自の培地を添加することによって、滅菌24ウェルプレートを準備します。
    3. 滅菌ピンセットを使用して穏やかにアガロースマトリックスからインサートを取り除くことにより、媒体を予め装填され、新しいプレートに細胞インサートを転送します。
    4. 5％/ 95％CO 2 /空気および相対湿度100％で37℃のインキュベーター中でプレート（単数または複数）を置きます。
    5. 2日ごとに、新しい滅菌24ウェルプレートを700μL暖かい独自の気道細胞培養培地にあらかじめロードされたに挿入を転送します。
    6. そのような経上皮抵抗（TEER）のような方法を使用して、気道組織の完全性を評価、または繊毛は、ライブビデオ画像システム9を取り付けた顕微鏡を使用して周波数（CBF）を打ちます。 TEERおよびCBFの測定はキューン10に記載されています。

細胞培養で2 CYP活動定量

注：一般的なルールとして、例えばDMSO、メタノールなどの溶媒が、この論文で提示異なる代謝プローブおよび阻害のためのストック溶液を調製するために使用することができます。しかしながら、高濃度の代謝酵素を阻害することができるので、最小値（1％以下）に培地中の最終DMSO濃度を維持することが推奨されます。可能な場合、プローブの可用性を低下させることができ、また、フェノールレッドは、アルブミンなどのCYP及びフェーズII酵素活性および血清成分を妨害することができるので、代謝プローブとのインキュベーション中に遊離フェノールレッドおよび無血清培地を使用することが推奨されます。厳密にこれらを遵守することは必ずしも可能ではありませんガイドライン。例えば、気道細胞培養培地は、独自であり、フェノールレッドを含ま。細胞が肝細胞様の表現型を採用することが必要とされる独自の肝細胞株代謝媒体7は、既に1％上方DMSOを含有します。

注：最後に、ここでは、用語特異的プローブ/阻害剤が使用されるが、この用語は慎重に考慮しなければなりませんさ。代謝プローブは、酵素基質排他的であるために、実際に、それは非常に稀です。ここで説明したプローブは、しかしながら、それらの酵素標的に対して高い親和性を有し、従って活性の信頼できるマーカーとしてみなされます。

  1. 代謝プローブ、誘導物質、および阻害剤
    1. 質量分析に基づく方法を用いてプローブ
      注：このセクションで説明するプローブおよび阻害剤はCYP2As 11の活性を試験するのに適している、CYP1A2 12、REF "> 13、CYP2B6 7、14、CYP2F1 15、16、及びCYP2E1 17 UPLC-質量分析による。プローブ、阻害剤およびCYP対応する、対応する参照して、表1に記載されている。 表1はまた、CYPの代謝産物を示しています質量分析法により定量される活性は、組織培養における使用のための組織培養およびソリューションを含むすべての作業は、無菌の組織培養フード内で行われるべきである。ストック溶液は、すべてのプローブ基板にDMSO中で調製することができます。
      1. 唯一の代謝プローブのために、他の実験前に、細胞挿入またはウェルの2つのシリーズを調製阻害実験のための一連の使用。培地ブランクコントロールとして細胞の第三の系列を準備します。これらは別々のプレート上、または3つの複製の最小と同じプレートであってもよいです。プレートの例が横たわっていましたうち、図5に示されています。
      2. 実験の日に、新鮮な培地の450μLで細胞培養培地を交換してください。
      3. 無菌フード細胞培養培地を用いて以下の溶液の10倍濃度で調製。 10倍のCYPプローブ、10倍のCYP阻害剤、および10倍のCYP阻害剤に加えて10倍のプローブを混ぜます。
        注：阻害剤およびプローブのマスターストック溶液を100％DMSO（ 例えば 、1,000倍ストック）で調製することができ、さらに、細胞培養1％を超える最終DMSO濃度を回避するために10X溶液を得た培地で希釈し。細胞とのインキュベーションを目的としている最終的な1×濃度を表1に示します。
      4. 0.2μmのシリンジフィルターと異なる10Xプローブ溶液を濾過します。
      5. 阻害実験のために調製した細胞の一連の10倍のCYP阻害剤を含む培地50μLを添加し、30分間プレインキュベートします。
      6. R新鮮な培地を450μLと阻害直列に細胞の培地をeplace両方10X CYP阻害剤を含む培地と10倍のプローブ基板の50μLを加えます。
      7. 他のセル10Xプローブ基板と媒体の50μLに加え、 図5に示すように、ブランク細胞対照（ 例えば 、DMSO）中で希釈した車両の当量を加えます。
      8. 5分（時間0、バックグラウンド対照）および細胞インキュベーターで16時間 - 0のための細胞をインキュベートします。
        注：このインキュベーション時間は、気道細胞および肝細胞株で正常に使用されました。しかし、新鮮な初代肝細胞は、細胞調製物の品質およびドナーの遺伝子構造、したがって、短い時間を保留し、高い代謝能力を持っている（ 例えば 、2〜4時間）が適している可能性があります。常に異なる細胞株または細胞タイプをテストするときに、時間経過実験を行うことをお勧めします。
      9. インキュベーション期間の終わりに、高専ECTプローブの代謝産物の定量のための別個の標識された試験管中の培地。将来の処理のための媒体をフリーズします。
      10. 溶解タンパク質定量のための細胞。
        注：任意の標準的なタンパク質定量キットおよびプロトコルは、この工程に適しています。 BCAは、一つの適切な選択肢です。細胞は、別のアッセイで使用しなければならない場合、このステップはオプションです。
    2. ミディアム治療
      注：インキュベーション段階から回収した培地は、親プローブの化学だけでなく、その代謝産物が含まれています。特定のCYP活性を測定するためにのみ関心のCYPによって触媒反応の生成物を定量化する必要があります。第I相代謝物は、多くの場合、フェーズII代謝（抱合）と並行して処理され、したがって、そのようなとして検出することはできません。したがってCYP活性の最も正確な定量化を得るために、脱抱合工程はいずれかを削除する必要があります第II相代謝修正。フェーズI代謝産物の結合がしばしばグルクロニドまたは硫酸化を含むので、脱抱合は、グルクロニダーゼによるサンプルの処理によって達成18をスルファターゼれます。グルクロニダーゼおよびスルファターゼ活性は、pH 4.5〜5.0およびpH 6.0〜6.5で最高であるスルファターゼ活性で達成される最高グルクロニダーゼ活性を有するpH依存性です。したがって、このステップは、pH調整を必要とします。ほとんどのpH計プローブは、1.5 mLのマイクロ遠心チューブに収まらないので、ここで説明する方法では、我々は、実際的な理由のためのpHのストリップを用いてpHを測定します。市販のpHストリップは0.3〜0.2のpH単位と低い解像度で見ることができます。
      1. 1.5 mLのマイクロチューブに培養培地の250μLを転送および100nMの最終濃度を達成するために4-メチル内部標準ストック溶液を加えます。
      2. 1MのHClを添加することによって4.5~5.0に培地のpHを調節します。一度にHClを1μLを追加し、pHを確認pHがストリップ上に媒体の2μLをピペッティングすることによって。 5.0のpH値に到達すると、典型的には1 MのHClのせいぜい5〜10μLを必要としないであろう。
      3. ヘリックスpomatiaからβグルクロニダーゼ/アリールスルファターゼの150単位（85,000単位/ mLのストックの1.8μL）を加え、37℃で1時間インキュベートします。冷メタノール250μLを添加することにより反応を停止し（-20°C）。さらに-20°Cまたはプロセスでサンプルを保管してください。
      4. 45℃の真空遠心機を用いて溶媒を蒸発させます。水溶液：30％アセトニトリル500μLのサンプルを再構成します。サンプルは、質量分析のために準備ができているとアンバー・グラスバイアルにおいて-20℃で保存することができます。
    3. 質量分析に基づく定量
      注：すべてのUPLCおよび質量分析計の設定は、専用の補足表1に詳述されています。定量分析のために、較正曲線を確立することが必要です。カリbration曲線を定量する化合物の公知の希釈範囲を実行することによって得られます。この場合、検量線は線形領域19の20％以内でなければならない、少なくとも6そのうち10種の異なる濃度（ 表2）の上に作製しました。検出の最低レベルは、平均バックグラウンドシグナルを3倍よりも大きい、または等しい信号を与える最低濃度として決定されます。定量の最低レベルが大きい、又は三重サンプルと、少なくとも3つの独立した実験にわたって決定され、どちらも10倍の平均バックグラウンドシグナルに等しいシグナルを与える最低濃度の試料として決定されます。
      1. 内部標準を含む、 表2によれば、組織培養培地中で合成代謝物の連続希釈を調製。標準希釈あたり250μLの最終容量は十分です。
      2. STに記載されているように標準の連続希釈液を蒸発させますメディア前蒸発の体積に水当量：30％のアセトニトリルの体積EP 2.1.2.4再懸濁（ 例えば 、250μLの30％アセトニトリル：水出発標準液媒体の250μLであった場合）。
      3. UPLC-MSオートサンプラ内注射用アンバーUPLCガラスバイアルに各連続希釈標準の250μLを追加します。
      4. UPLCバイアルを琥珀とUPLCオートサンプラーでそれらを配置するために試験サンプル（250μL）を追加します。
      5. すべてのバイアルをランダム。
        注：我々が使用される質量分析計構成は補足表1に詳述UPLCに結合されたハイブリッドトリプル四重極/リニアイオントラップ質量分析計です。他のプラットフォームには、さまざまなソフトウェアと構成を持っているだろうが、定量化を実行するための同様の手順に従います。
      6. 定量化するために特異的なプローブに応じて補足表1に詳述された設定を使用してUPLC-MSを実行します。
      7. つかいます「定量-定量法ビルド」を取得合成標準および内部標準の較正曲線を生成するために、質量分析計定量化ツールのツール（ 材料の表 ）。
      8. 「定量方法」を定量化し、実行するために、サンプルのバッチおよびサンプルを選択するために、「定量ウィザード」を使用してください。質量分析計定量化ソフトウェアは、各試験サンプル中の標的化合物の定量値をスプレッドシートを表示します。
    4. 発光ベースの方法を使用してプローブ
      注：CYP活動の範囲を測定するための発光性プローブは、市販されています。しかし、すべては、セルベースアッセイに適していません。ここでは、プロトコルは、CYP1A1 / CYP1B1の活性を測定するために提示されます。 CYP1A1 / 1B1は、誘導性のCYPの活性をアッセイし、ALTERとして使用することができる方法ルミネセンスプローブの例を与える方法を説明するために選択されました質量分析に基づく方法にネイティブ。 表3は、我々は、気道細胞および肝細胞株のために使用される濃度およびインキュベーション時間をまとめたもの。しかし、それらは他の細胞タイプに適合させることが必要になる場合があります。他の発光性プローブは、市販されているとのCYPの種々の基質として使用することができます。
      1. 非誘導対照誘導試験、および誘導+阻害剤の試験を含むように十分な細胞を調製します。プレートレイアウトの例を図5Bに示されています。
      2. CYP1A1を誘導する/ 1B1は、72時間（24〜48時間のより短い期間もまた適切であり得る）の期間中に10nMのTCDDの最終濃度で細胞をインキュベートします。
        注意：TCDDは発がん性物質および催奇形性物質です。十分な保護具を着用し、サプライヤーMSDSシートを確認し、使用前にリスク評価を行います。
      3. この期間の後、培地を除去し、PBSで3回ウェルをリンスし、新鮮な培地を加えます。
      4. PRIOR発光性レポータープローブと共に細胞をインキュベートし、培地中で、10μMCYP1A1 / 1B1阻害剤、α-ナフトフラボンの最終濃度で30分間誘導された細胞の指定されたサブセットをプレインキュベートします。
      5. 非誘導、誘導し、誘導された+阻害剤を細胞に50μMの最終濃度で、ルミネセンスプローブLUC-CEE（ルシフェリン6'-クロロエチルエーテル）を加えます。
      6. 細胞培養インキュベーター中で4時間インキュベートします。インキュベーション時間の終わりに、発光性プローブの定量化のための媒体を集めます。
      7. 白色不透明96ウェルプレートに移し、培養培地の25μL、製造業者によって供給されたルシフェリン検出試薬の25μLを加えます。室温で20分間インキュベートします。すぐにルミノメーターを用いてプレートを読みます。
      8. PBSで細胞をリンスし、総タンパク質定量のために溶解。
        注：生細胞は将来の実験のために保持されている場合は、このステップはオプションです。私トンは、TCDDなどの誘導物質は毒性があり、細胞を損傷することが注意することが重要です。

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表1： その対応する酵素と代謝プローブ、製品、および阻害剤の一覧。分子量及び気道および肝細胞を用い推奨濃度も示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図5：CYPアッセイを行うために24ウェルプレートレイアウトを示唆しました。 （A）構成的に発現のCYPの推奨レイアウトは、ブランク媒体のための一連のウェルを含みます、代謝プローブ、および代謝プローブプラス阻害剤。このレイアウトは、テストされている時点の数を掛けすることができます。 （B）は 、誘導性のCYPための例示的なレイアウトは、媒体ブランクのためのウェルの一連、代謝プローブ（TCDDと例えば 、）のみ制御、誘導された細胞をプローブと共にインキュベートし、プローブおよび阻害剤と共にインキュベートを含みます。

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表2： 検量線とそれぞれのLODとLOQsに使用する合成標準の希釈 。使用する希釈範囲は、質量分析プラットフォームと感度に基づいて変えることができます。ここでは、UPLCにリンクされているハイブリッドトリプル四重極/リニアイオントラップ質量分析計を使用していました。 これの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。

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表3：CYP1A1 / 1B1アッセイのためにルミネセンスプローブ、誘導物質と阻害剤。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

結果

3人の異なるドナー（気道M360、M370、M417）及び肝細胞株（Hep細胞ライン）からの気道細胞培養における2つのCYPの対（CYP1A1 / 1B1及びCYP2A6 / 2A13）について測定された代謝活性の例は、 図6に示されています20。

ルミノメトリーによって測定されたCYP活性
図6Aは、気道細胞におけるリュック-CEE（ルシフェリン6'-クロロエチルエーテル）（3人のドナー）とを有するとTCDD誘導せず、肝細胞のCYP1A1 / 1B1 O -脱アルキル化活性によって産生さ相対発光を示します。 CYP1A1 / 1B1高度に誘導性酵素であり、典型的には、ほとんどの組織で構成的なレベルでは発現されません。 図6Aに見られるように、細胞が誘導されていない場合、何のルミネセンス信号が検出されません。両方の細胞型は、TCDD、強力なCYP1A1 / 1B1誘導、マークと共にプレインキュベートされたときEDルミネセンス信号は、制御（ 図6A）と比較して検出されます。これは、リュック-CEEプローブがその後に定量化されたルシフェリン部分の放出をもたらす代謝されていることを示しています。全体TCDD処理された肝細胞株からの活性があっても、総タンパク質の正規化した後、気道細胞の場合よりも低いです。細胞株は、初代細胞未満代謝的に活性である傾向があるので、これは珍しいことではありません。 αナフトフラボンの添加はさらにリュック-CEE代謝のCYP依存性を確認し、全ての細胞型におけるCYP1A1 / 1B1活性に対する明確な阻害効果を有します。

UPLC-MSを使用してCYP450代謝物の定量
図6Bは、INHIの存在下および非存在下におけるクマリンとのインキュベーション後に3人のドナー（気道M343、M345、M347）および肝細胞（Hep細胞ライン）からの気道細胞におけるCYP2A6 / 2A13活性の定量化を示しますBITOR 8-メトキシ。データは、総タンパク質に対して正規化されます。 0分クマリンインキュベーション制御では、全く7-ヒドロキシクマリン（ 図6B）が検出されません。 CYP2A6 / 2A13は、特定の組織で構成的に発現され、7-ヒドロキシクマリンの形成を伴う、したがって後の16時間のインキュベーションをも誘導することなく、試験された異なる種類の細胞で検出されます。 8-メトキシ場合、CYP2A阻害剤が（ 図6B）を添加し、7-ヒドロキシクマリンの形成を大幅に低減されます。

CYP阻害剤の存在下で、阻害はめったに完了すると、その他のCYPは、基板を認識するが、はるかに少ない効率的に処理することができるかもしれないので、まだいくつかの残存活性を検出することが普通であることに留意すべきです。また、それは気道細胞におけるCYP2A6のために表示されるように一次細胞を使用する場合、記録代謝活性は、ドナーの間で異なることができることを観察することができます（ 図6B）。これは、CYP活性は、各ドナーの遺伝子型と多型の傾向があると期待されています。

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図6：活性アッセイは、肝細胞株においてスリー気道細胞ドナー（M360、M370、M417）にCYP1A1 / 1B1活性（A）及びCYP2A6 / 2A13活性（B）の検索結果。 （A）のLuc-CEEの脱アルキル化活性を有するとTCDDによるCYP1A1 / 1B1の誘導なしに示されています。 αナフトフラボンは、CYP1A1 / 1B1阻害剤として使用されました。活性は、インキュベーションの分単位の時間（分）との総タンパク質濃度（mg）で正規化し、相対発光単位（RLU）として表されます。彼らは恒常的に発現していると（B）CYP2A6 / 2A13は、誘導を必要としません。ピコモル/分/ mgタンパク質でクマリン7-水酸化活性は、阻害剤8 methoxypsorととせずに異なる時点で示されていますALEN。すべての結果は、平均値の標準偏差で3回の独立した測定の平均値として提示されています。この数字は、バクスター20から変更されました。

補足表1：UPLC及び質量分析計設定。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

現在、多くの標準化された毒物学的試験システムは、正常なヒト代謝1の代表的ではない操作細菌、細胞株、または胚細胞を使用します。これは、化学物質や薬の潜在的な毒性活性の不正確な予測につながることができます。このようなチップ上の3D細胞培養および器官などのin vitroモデル 、 革新的な、より良い人間の組織21、22、23の正常な形態および代謝活性を再現する試みで開発されています。代謝能力は、毒性学的評価と薬物生体内変化の研究のために最も適しているモデル解読するために使用することができる1つの基準です。

本稿で概説されているプロトコルは、生細胞を用いたCYP酵素の活性を測定するために設計されています。それは柔軟であり、2Dまたは3D culturにおける異なる細胞系のために使用することができますESと発光性プローブ - または質量分析ベースのアプローチのいずれかを使用するためのオプションを提供しています。両方の方法は、材料のナノグラム量を検出してのみマルチウェル形式で増殖させた細胞の小さな数を必要とするのに十分な感度です。彼らはまた、複雑なマトリックスで栽培回転楕円体または細胞に適用できます。プローブ基板の選択は、明らかに、プロトコルの重要な要素です。アッセイの特異性は、CYP酵素の選択的であるプローブに依存していると保証の別の層は、選択的CYP阻害剤を使用することによって得ることができます。この論文に記載された基質および阻害剤は、ほんの一例ですが、他は文献に見出すことができます。

酵素が低レベルで発現されることに起因する可能性が負CYP活性の結果として新たな細胞型で作業する場合、複数のインキュベーション時間を考慮することが重要です。陽性対照として使用することができる細胞型の添加は、Aを確保することが望ましいです否定結果が技術的な問題にリンクされていないと、トラブルシューティングを支援します。一次肝細胞が代謝的に有能であり、コントロールとして使用することができ、例えば、懸濁液中の初代肝細胞を使用することは非常に容易であるが、それらの生存率は、時間的に限られています。肝細胞株は、このプロトコルに記載のように使用することが比較的容易である可能な代替であるが、一部は代謝活性6、21の点で他のものより優れています。

アッセイは、総タンパク質が定量されていない限り、非破壊的であるため、長期的な研究20時間にわたってCYP活性を追従することが可能です。いくつかの細胞は、培養液中で時間をかけて、可変CYP活性を持つことになりますので、これは重要なポイントです。負の結果は、in vitroでの分化または脱分化との密集度の欠如、進行に伴うかもしれません。その場合には、アプローチは、半quantitatiありますデータは、各細胞培養物中のタンパク質の総量によって正規化されていないのでまし。 TCDDの場合のように組織に対する毒性効果を有することができるプローブ、インヒビターまたはインデューサーへの曝露のようなCYP活性を測定した後、組織を再利用することは常に可能または推奨されません。

例えばミクロソームのような細胞画分はまた、所定の細胞型のCYP活性を特徴付けるために使用することができます。ミクロソーム調製物は、しかし、細胞材料、十分な補因子の添加を多く必要とし、酵素が活性のままであることを保証するためのバッファ。生きた細胞を使用すると、トリッキーなミクロソーム調製工程を排除し、最高の仕事どのバッファおよび補因子ワークアウト。

一般的な推奨事項として、さらにそれが酵素活性と一致することを確認するために、細胞培養物中のCYPの発現プロファイルを特徴づけるためのベストプラクティスです。検証のこの追加のレベルは、代謝プローブがentiないことをお勧め与えられ、単一CYPに固有依存しており、それが測定された代謝活性は、対応する酵素発現によって一致していることを増加確信を与えます。 CYPが膜タンパク質であるので、したがって、それらは、定量的RT-PCRは、これらの酵素20をプロファイリングするための好ましいアプローチであった、ウェスタンブロットのために準備するのが比較的困難です。

このプロトコルが唯一重要なものはあるが、代謝酵素の一のファミリーを表すアッセイCYP酵素活性の方法を記載していることに留意することが重要です。質量分析アプローチの柔軟性がプローブ基板の他の代謝変換の取得方法の開発を可能にします。しかし、それらは、一度に1つを開発する必要があり、現在、少数の知られている特定のプローブおよび他の代謝酵素の家族のための選択的阻害剤です。このギャップは、in vitro細胞systeの代謝能力を総合的に評価を可能にするために取り組むべきですミズ。

開示事項

ABとEMは、この原稿の執筆時点ではブリティッシュ・アメリカン・タバコの従業員でした。この原稿で説明する作業は、ブリティッシュ・アメリカン・タバコによって資金を供給し、このビデオ、記事の掲載料は、ブリティッシュ・アメリカン・タバコによって支払われました。

謝辞

著者は、気道細胞と肝細胞の顕微鏡写真を提供してくださったEpithelix SarlとBiopredic Internationalに感謝し、実験手順を説明する図を提供してくださったNeil Smithに感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬&細胞
2 μmのシリンジフィルターWhatmanUN203NPEORG
24の井戸版Corning3524
4-methylumbelliferoneΣ AldrichM1381
5-phenyl pentyneΣ AldrichCD5001437
6-hydroxybupropionΣ AldrichH3167
6-hydroxychlorzoxazoneΣ AldrichUC148
7-エトキシクマリンSigma Aldrich195642
7-ヒドロキシクマリンSigma AldrichH24003
8-メトキシプソラレンSigma AldrichM3501
酢酸Sigma Aldrich695092
アセトニトリルフィッシャーA/0626/17
α-ナフトフラボンSigmaAldrichN5757
BCAキットThermo Scientific23227
b-グルクロニダーゼ/アリールスルファターゼSigma AldrichG0876
ブプロピオンSigma AldrichB102
カルバマゼピンSigma AldrichC4024
chlorzoxasoneSigma AldrichC4397
コラーゲンCell Systems5005-B
クマリンSigma AldrichC4261
ジスルフィラムSigma Aldrich86720
fluvoxamineSigma AldrichF2802
Glutamax (Glutamine supplement)Fisher35050061
HepaRG 代謝サプリメントMerckMMAD621
HepaRG thaw培地サプリメントメルクMMADD671
HepaRGメルクMMHPR116
ルシフェリン-CEEプロメガV8751
メタノールフィッシャーM/4056/17
MucilAir 気道細胞EpithelixEP01
MucilAir 気道細胞 メンテナンス培地EpithelixEP04MM
フェノメネックス キネテックス 2.6 μm, PFP 100APhenomenex00B-4477-AN
TCDDSigma Aldrich48599
thioTEPASigma AldrichT6069
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 2.1 x 50 mmウォーターズ86003538
ウィリアムズE mediaFisher17704-024
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
UPLCWatersAcquity
QTRAP MSSciex ABI Sciex 4000
QTRAP MSソフトウェアSciex アナリスト 1.4.2
ルミノメーターMolecular DevicesSpectraMax M3
分光光度計Molecular DevicesSpectraMax M3
セルカウンターベックマン・コールターVi-Cell XR
ロータリーエバポレーターエッペンドルフ-5301

参考文献

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