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方法論記事

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

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DOI：

10.3791/55504

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2017年5月26日

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Center

この記事について

サマリー

プロテインキナーゼは高度に進化したシグナリング酵素であり、細胞間および細胞内シグナル伝達にとって重要な足場である。本発明者らは、細胞シグナル伝達調節の解明を助ける信頼できる方法である放射性標識アデノシン三リン酸（[γ- 32 P] ATP）の使用によるキナーゼ活性を測定するためのプロトコールを提示する。

要約

プロテインキナーゼは、複雑な刺激配列に応答して大規模な細胞の変化を制御することができ、その調節のアロステリックな詳細を明らかにするために多くの努力が向けられている。キナーゼは、欠陥がしばしば複数の形態の癌および関連疾患の特徴であり、上流の調節因子の操作および改善された治療法の探索において重要な反応要求の検証に適したアッセイプラットフォームを形成するシグナルネットワークを含む。ここでは、生化学的および薬理学的作用物質の試験、突然変異および欠失などの遺伝子操作、ならびに細胞培養条件およびプローブに対する処理を含むが、これに限定されない特定の実験的問題に適合するように容易に適合させることができる基本キナーゼアッセイを記載する細胞シグナル伝達機構。このアッセイは、定量的な比較および結果の明確な視覚化を可能にする放射性標識[γ- 32 P] ATPを利用し、そしてmod広範囲の反応条件にわたって、免疫沈降または組換えキナーゼ、特異的または典型的な基質と共に使用することができます。

概要

プロテインキナーゼは、細胞シグナルの適切な応答への伝達に不可欠な洗練された酵素である1 。ホメオスタシスの維持と病態2の予防または促進における役割を考えると、キナーゼ活性を評価するための生化学的方法は、真核生物のシグナル伝達の詳細を描写するための強力なツールであり続けている3 。リン酸化特異的抗体を用いる戦略は、細胞シグナル伝達状態4に対する異なる治療条件の影響を測定する点で非常に有益であるが、キナーゼアッセイは、異なるキナーゼのキナーゼの酵素活性に関して異なる治療条件の影響を直接測定することを可能にする。関心放射性物質5を使用しない類似のアッセイにはいくつかの選択肢がありますが、我々は結果の堅牢な定量化のためにこの方法に引き続き依存しています。そこ免疫沈降（IP）キナーゼアッセイ（ 図1 ）および組換えタンパク質キナーゼアッセイ（ 図2 ）の2つの典型的な用途である。

IPキナーゼアッセイは、特定のプロテインキナーゼを活性化することができる因子ならびにゲノム阻害性の治療条件を同定するために非常に有用である。簡潔には、目的のエピトープタグ化キナーゼを培養真核細胞にトランスフェクションし、種々の処理を施し、免疫沈降させ、放射性標識ホスフェートをモデル基質（ 例えば、ミエリン塩基性タンパク質（MBP））に取り込む能力についてアッセイする。 IPキナーゼアッセイはまた、内因性タンパク質の免疫沈降または任意の数のゲノム編集技術のいずれかによって、過剰発現に頼らずに行うことができる。治療は培養で行われるので、この方法は複数の上流因子を介して伝達される刺激を検出することができるまたはインビトロでの読取りによる並行経路である 。この方法の1つの大きな利点は、直接的な上流または下流の因子またはその中のリン酸化部位の事前知識を必要としないことである。さらに、興味のあるキナーゼの特異的基質が同定されると、同じキナーゼアッセイプロトコールを組換え成分とともに使用して、天然基質に対する比活性を測定し、質量分析と組み合わせた場合の特異的リン酸化部位を同定することができる。このようにして同定された部位は、基質変異体を利用するキナーゼアッセイによってさらに検証することができる。最後に、この方法は、自己リン酸化を検出および測定するためにも使用することができる。

本明細書で提供されるプロトコルは、最適化されたタンパク質精製スキームまたは培養細胞における目的の親和性タグキナーゼを発現するためのトランスフェクション方法のいずれかを前提とする。トランスフェクション、溶解、免疫沈降、およびタンパク質精製のより詳細な解説については、Cold Spring Harbor Protocols 6を参照することをお勧めします。アッセイの開発および改変に関する詳細については、「タンパク質リン酸化：選択された方法in Enzymology」を参照してください。

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プロトコル

キナーゼ精製リソースおよび一般的な免疫沈降パイプライン

注：このアッセイで使用するためのキナーゼは、培養細胞の免疫沈降物から、またはアフィニティータグ精製などの組換え手段によって供給され得る6 。以下は、関心対象のキナーゼに依存して修飾しなければならないかもしれないフラッグタグ免疫沈降のための一般的プロトコールである。可能な限りすべてを氷上に置いておくべきです。

  1. 2μLの1mg / mL抗体を200μLの細胞ライセート（通常は1mg / mL総タンパク質濃度）に添加し、4℃で1時間インキュベートする。
  2. プロテインAセファロースビーズを、溶解バッファー（以下参照）で2〜3回、短時間4℃で5,000xgで30秒間〜1分間回転させ（「タッチスピン」）、ピペットで上清を除去し、緩衝液にビーズを再懸濁する。
    1. 溶解緩衝液を調製する：50mM HEPES pH7.7,150mM NaCl、1.5mM MgCl 2、1mM EGTA、10％グリセロール、0.2mMオルトバナジウム酸ナトリウム、100mMフッ化ナトリウム、50mMβ-グリセロリン酸、0.1％Triton X100または0.1％NP-40を含む。
  3. ライセートに溶解緩衝液中のプロテインAセファロースビーズの50％スラリー30μLを加える;ロッキングしながら4℃で1時間インキュベートする。
  4. 4℃で回転させてビーズをペレット化し、上清を除去する。
  5. 1mLのビーズ洗浄バッファー（1M NaCl、20mMトリスpH7.4）で3回洗浄する。
  6. 1xキナーゼ反応緩衝液（10mM HEPES pH8.0,10mM MgCl 2 ）で1回洗浄する。ビーズを除去せずにできるだけ多くのバッファーを除去する。

キナーゼ反応の初期化

注：IPキナーゼアッセイの場合、約15μLの懸濁していないビーズが典型的な開始サンプルです。組換えタンパク質キナーゼアッセイの場合、典型的な出発量は、25〜50μLの最終反応容積に対して0.1〜1.0μg/ l〜1/10の範囲である。組換えタンパク質サンプルの容量を調整するアッセイを初期化する前にそれらが保存されているバッファーと等しくなるようにします。大量のキナーゼを使用する場合は、アッセイ期間中のタンパク質安定性の維持を助けるために、BSAなどのキャリアタンパク質を含める。

  1. 以下に示す5xキナーゼ反応バッファーを調製する：
    50mM HEPES pH 8.0
    50mM MgCl 2
    50mMベンズアミジン（プロテアーゼ阻害剤）
    50mMのDTT（還元剤）
    250μMATP（非標識または「コールド」）
  2. キナーゼサンプルを1.5 mLチューブに氷上で保存してください。以下の反応混合物を別々に冷却した1.5mLチューブで調製する：
    21μLのH 2 O
    6μL5xキナーゼ反応緩衝液
    1μLの放射標識（「ホット」）ATP
    基質2μL（約5mg / mL）
    注：組換えキナーゼアッセイでは、精製タンパク質に対応するように容量を調整することができます。最終反応容積が30μLとなるように計算する。このレシピを使用してマスターを準備するミックス。標識されたATPを受領したら、反応混合物に加える前にH 2 O中のストックを0.01mCi /μLの比活性に希釈する。
  3. アッセイを初期化するために、反応混合物全体をキナーゼサンプルに添加し、アッセイされるキナーゼの活性に依存して、30℃で5分〜1時間インキュベートする。
    注記：以前にアッセイされていないキナーゼを用いて作業する場合は、キナーゼ活性の経時変化を時間間隔で5分間隔で実行します。

反応停止およびSDS-PAGE

  1. 氷上に置き、7.5μLの5倍Laemmliサンプルバッファー6を加えることにより反応を停止する。
  2. ヒートブロック中、100℃で30秒〜2分間加熱する。
  3. 10-15％SDS-PAGEゲル上でスピンをタッチし、ウェルあたり20μLを負荷する。キナーゼと基質を分離するのに十分な長さのゲルを流します（通常5Wの定電力で1時間）。ゲル装置をシールドして32 Pである。
    1. ここでは自家製ゲル装置を使用していますが、標準的な市販のミニゲルが完全に適しています。次のように寸法を使用します。
      ゲル：幅8cm、長さ5.5cm（分解能）、厚さ1.5mm。
      コムズ：15ウェル、1.5mm厚、2.9mm幅、16mm深さ

4.ゲル染色および乾燥

注意：すべてのステップで、放射性遮蔽を使用し、個人用保護具を着用して、 32 Pまでの人体への暴露を減らしてください。具体的な手順の詳細については、参考文献をいくつか記載しています。

  1. ガラス/アルミナプレートからゲルを取り出し、50rpmに設定されたオービタルシェーカー上で50mLのクーマシー染色液（10％氷酢酸、50％メタノール、0.25％R-250色素）に1時間入れる。このステップでは、ゲル自体よりもわずかに大きい容器を使用してください。 8
  2. ゲルをステインから固定溶液（10％氷酢酸d、20％メタノール）を用いて脱色する。軌道シェーカー上で一晩、固定溶液600-700mL中でゲルを50rpmで揺する。クーマシー染料8,9を吸収するために、容器に泡や結び目のある実験用ワイプをゲルに入れます。
  3. 固定溶液からゲルを取り出し、ゲルが乳白色に変わるまで静かに攪拌しながらメタノール200mLで1〜2分間浸します。これは、乾燥工程中の割れを防止するのに役立つ。
  4. 14cm×14cmの定性濾紙をメタノールで濡らし、スラブゲル真空乾燥機の上に置く。フィルターペーパーの前面を上にしてゲルを下にして置きます。
  5. しわや気泡を避けるために、プラスチックラップで慎重にゲルを覆う。乾燥機を80℃で1.5時間運転する。真空が達成された後、ふたを開け、必要に応じて柔らかいゴム製のブレイラで気泡をロールアウトします。

5.オートラジオグラムおよびシンチレーションカウント

  1. driを削除ゲルの側面のろ紙にオートラッドマーカー、リン光ルーラーまたはドットを付けます。ドットを使用する場合は、それらが非対称パターンになっていることを確認してください。これは、露光および現像後にゲルをフィルムと整列させる。
  2. Geigerカウンタを使用して信号の強度を確認します。強度の高い画面で-70℃〜-80℃で弱い信号を照射すると、フィルムのバンド密度が増加します。
  3. 暗室では、フィルムと増感スクリーンを備えたフィルムカセットに乾燥ゲルを、上から下の順番に、ゲル、フィルム、増感紙の順で入れます。
  4. 増感紙をカセットの蓋に取り付け、ゲルを適所にテープで貼り、このステップを簡単にします。増感スクリーンは、 32 Pからのベータ粒子によって照射されると光を発する。これらの光の放出は、ベータ粒子よりも効率的にフィルムに浸透する。
    1. 増感紙から放出される波長がフィルムが最も敏感である波長に池を維持する。
    2. ガイガーカウンターを使用して、曝露をどのくらいの期間放置するかを決定する：cpmカウントが〜100以下の場合は、-70℃で一晩お試しください。カウントが〜10,000の場合は、1時間の露出で開始し、そこから最適化します。
  5. 露光終了後、フィルムを取り出し、医療/ X線フィルムプロセッサーで現像する。暴露が-70〜-80℃で行われた場合は、カセットを室温まで温めて、結露が生じる前にフィルム上の結露を最小にしたり、フィルムを取り除いたりしてください。
  6. フィルムを乾燥したゲル/濾紙の上に置き、乾燥ゲル上のマーカー/ドットの画像をマーカー/ドットと整列させる。タンパク質標準に対応するバンドをフィルムに記入する。タンパク質標準にラベルを付け、将来の参照のために反応がどのレーンであるかを記録する。
  7. フィルム上の関心のあるバンドに対応するバンドをゲルから切り取って置きます7mLのシンチレーションバイアルに入れた。 4mLのシンチレーション液を加え、液体シンチレーションカウンターでカウントする。カウンタが32 Pの正しいエネルギースペクトルウィンドウを監視するように設定されていることを確認します。
    注：基質に対応するバンドも、ノンキナーゼ対照レーンから切り出してください。これは、すべてのサンプルシンチレーションカウントから差し引かれるバックグラウンド放射線を計算するために使用されます。

6.結果の分析

注：オートラジオグラムは結果の定性的な視覚化を提供します。正確な定量のために、シンチレーションカウンターを用いて32 P取り込みを測定することができる。データは、通常、 図1Bに示すように、相対的な活動の観点から表現されます。全てのサンプルについて均一な条件が維持されている限り、比活性の相対的な測定は、処置を比較するのに十分である。

  1. 絶対的な特定の活動値を計算するときは、厳密に時間経過（ 例えば、 2×[キナーゼ] = 2×比活性）にわたる直線的な活性範囲を確保するために、キナーゼ、基質、および冷ATP濃度を含む、すべての反応条件の最適化。高い比活性を有するキナーゼについては、キナーゼ活性が基質の量によって制限される場合には、基質濃度を増加させてアッセイを行う。
  2. 関心のあるキナーゼの特異的活性を、1mg /キナーゼ当たりのナノモルリン酸塩単位の単位で計算する。
    1. カウントされたバンドのcpmから空白を差し引く。
    2. 熱いATPの減衰を計算する：[（1/2）^（t / t 1/2 ）] x 0.95ここで、 tは基準日からの日数であり、 t 1/2は32 Pの半減期は14.3日であり、0.95はシンチレーションカウンターの効率を反映する。例：28日目の高温ATPを使用する場合、減衰値は0.245でなければなりません。
    3. Calcアッセイの容量（μL）×[冷ATP]（μM）=全ATP（pmols）。アッセイ中の全ATPのピコモル（pmol）を測定します（通常、これは反応中の冷ATPの量に等しい）。例：30μL×50μM= 1500pmol
    4. cpm / pmol ATPを計算する：冷ATPの[高温ATP x（2.2×10 7 ）×減衰係数] / pmolのμL。
      注：2.2 x 10 7の値は、0.01 mCi /μLのATPをcpmに変換します。
    5. アッセイにおけるキナーゼの量をmgで計算する。組換えキナーゼおよび免疫沈降キナーゼの両方について、BCAアッセイのような標準的方法が出発濃度を決定するのに適している。例：50μLキナーゼ反応におけるwtERK20.0002μg/μLは0.01μg、または1×10 -5 mgです。
    6. アッセイで総cpmを計算する。 30μLの反応物を集め、ゲル上の各反応物から20μLを流す。計数されたcpm（ブランク減算後）に、総アッセイ容量/負荷された容量の係数を掛けます。上記を続けるたとえば、すべてのカウントに1.5、または30/20を掛けます。
    7. アッセイされたキナーゼの比活性を計算する：
      アッセイにおける全cpm）/（cpm / pmol ATP）/（アッセイ時間（分））/（キナーゼのmgでの量）
      注：上記の値を1000で割ると、比活性はナノモル/分/ mg
  3. 分子量がわかっている限り、どれくらいのモルのリン酸が基質に取り込まれているかを計算する。これは、反応が完了すると、特定のタンパク質上のホスホサイトの数を決定するために使用されます。
    アッセイにおける全cpm）/（cpm / pmol ATP）] /（pmol中の基質の量）

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結果

WNK1 IPキナーゼアッセイ

Myc標識WNK1をHEK293細胞にトランスフェクトし、抗Myc抗体11で免疫沈降した。免疫沈降物は、モデル基質MBPに向かって、そしてそれ自体に向かってキナーゼ活性を示した（ 図1A ）。 WNK1突然変異体を、同様の方法でMBPに対するキナーゼ活性について試験したが、今回はGSTタグ付き構築物を用いた（ 図1B ）。野生型と比較した突然変異体キナーゼの挙動の分析は、最適なWNK1活性にとって重要な残基を明らかにした。

HEK293細胞を、薬理学的および生化学的処理のパネルに曝露した。 WNK1 N末端ペプチドに対して生じた抗体を用いて、免疫沈降した内在性WNK1キナーゼ活性を、基質と...

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ディスカッション

キナーゼは、数多くの状況において広範な機能を発達させたタンパク質の多様なファミリーであり、キナーゼアッセイは、いくつかのシグナル伝達タンパク質の研究に非常に有用であり、細胞通信の現在の理解に大きく貢献しています。特に、同じ基本アッセイを、構造および活性の大きな違いにもかかわらず、2つの異種キナーゼの特徴付けに使用した。 WNK1キナーゼは、臨界リジンが独特の位置にシフトした非定型触媒ポケットを含み、キナーゼおよび足場機能の両方を介してカチオン - クロリド共輸送体の調節において役割を果たすことが知られている。 WNK1のキナーゼ活性は、その最も特徴付けられた基質であるプロテインキナーゼ酸化ストレス応答1（OSR1）およびSPS / STE20関連プロリンアラニンリッチキナーゼ（SPAK）でさえ、低い代謝回転数を有することが知られている。対照的に、密接に関連するキナーゼERK1と共にERK2は、活性化された場合に堅牢なキナーゼ活性を示す13,14中の100個の基質上でリン酸化することが知られている。

ア...

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開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

著者は貴重な作業と討論のためにCobb研究所のすべての現メンバーと元メンバー、そして管理援助のためのDionne Wareに感謝します。これらの研究は、国立保健研究所R37 DK34128およびウェルチ財団グラントI1243によってMHCに支持された

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
プロテインAセファロース CL-4BGE Healthcare Life Sciences17-0963-03
放射性標識 [γ-32P] ATPPerkin ElmerNEG035C010MC
Laemmli BufferBio-Rad#1610737
放射性遮蔽研究製品 InternationalBR-006
R-250 dye (Coomassie)サーモフィッシャー20278
Whatman グレード 3 定性的濾紙Whatman1003-917
スラブゲル真空乾燥機Bio-RadModel 583 ゲル乾燥機 #1651745 
AutoradマーカーAgilent Technologies420201
蓄光定規Sigma AldrichR8133
燐光ドットSigma AldrichL5149
ガイガーカウンターLudlumModel 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8 x 10"Carestream Health107 2263
BioMaxMSフィルム 8インチ x 10インチケアストリームヘルス829 4985
バイオマックス MSインテンシファイイングスクリーン 8インチ x 10インチケアストリームヘルス851 8706
医療/X線フィルムプロセッサコニカミノルタSRX-101A
シンチレーションバイアル研究製品 国際125500
シンチレーション液MP バイオメディカル 188245305
ベックマンLS6500シンチレーションカウンターベックマンLS6500

参考文献

  1. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
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