Method Article

パターニングタンパク質および細胞の多彩な方法

DOI:

10.3791/55513

⸱

February 26th, 2017

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1Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Pharmacology, Physiology, and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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このレポートは、低圧真空を使用して、生物学的研究のための細胞と基質でマイクロ流体チャネルを充填するためのシンプルで実行しやすい技術について説明しています。

Abstract

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基板および細胞のパターニング技術は、細胞と細胞、および細胞と基板の相互作用を研究するために細胞生物学で広く使用されています。従来のパターニング技術は、単純な形状、小さな領域、および選択された生体材料でのみうまく機能します。この記事では、負圧を使用して、細胞懸濁液と基質溶液を複雑で長い閉(行き止まり)ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロチャネルに分配する方法について説明します。この方法により、研究者はフィブロネクチン、コラーゲン、抗体(Sal-1)、ポリ-D-リジン(PDL)、ラミニンなどの複数の基質をパターン化できます。基質のパターニングにより、さまざまな細胞を間接的にパターニングすることができます。C2C12筋芽細胞、PC12神経細胞株、胚ラット皮質ニューロン、両生類の網膜ニューロンを試験しました。さらに、この手法は、細胞懸濁液に低真空を短時間適用することにより、マイクロ流体チャネル内の線維芽細胞を直接パターン化できることを示しています。低真空は、細胞生存率アッセイで示されているように、細胞生存率を有意に低下させません。この分析法をさまざまな細胞型および基質型に適用するための修飾について説明します。この技術により、研究者はエキゾチックな材料や機器を必要とせずに、細胞やタンパク質を特定パターンでパターン化することができ、真空状態のどの研究室でも行うことができます。

Introduction

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組織工学とバイオセンシングでは、ミクロンスケールのタンパク質や細胞の空間的な組織を制御する能力は、最後の四十年1、2、3の上にますます重要になってきています。タンパク質および細胞の正確な空間的な組織は、研究者は、細胞増殖を誘導すること、およびバイオセンサー4、5、6、7、8の製造のために生体分子を固定化するために、細胞の同様のまたは異なる種類を含む細胞と基板の間の相互作用を調べることを可能にしました9。

パターニングタンパク質の現在の方法は、光パターン及びマイクロコンタクト印刷が挙げられます。フォトパターンはultrに曝露されると架橋されている感光材料を利用しますバイオレット（UV）光。 （UV光の透過を防止するために、暗い領域と透明な領域からなる）、フォトマスクに向けられたUV光は、生体材料またはセ....

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Protocol

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注：使用前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。このプロトコルで使用される化学物質の一部は有毒で発ガン性があります。毒性または酸/基材を使用した場合、すべての適切な安全対策（ヒュームフード、グローブボックス）および個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、完全長ズボン、閉じたつま先の靴）を使用してください。

フォトリソグラフィを用いて、ソフトリソグラフィのためのマスター金型の1製作

  1. コンピュータ支援設計（CAD）図面ツールを使用してマイクロチャネルのレイアウトを描きます。
  2. レーザーマスク描画装置を用いて、マスクブランク板にレイアウトを印刷します。
  3. いかなる溶媒をウェハ上に残っていないことを確実にするために窒素エアガンイソプロパノール及びドライ続いアセトンで4インチシリコンウエハをすすぎます。
  4. 5分間、200℃のホットプレート上で焼成することにより、ウエハを脱水。
  5. マイクロチャネルの所望の高さのために設計されたネガ型フォトレジストを選択します。 Fまたは、例えば、50μmの高さのマイクロチャネルを得るために、ネガティブフォトレジストSU-8 50を使用します。
  6. ウェハを室温に戻します、その後、スピンコーターのチャック上にウエハを合わせます。
  7. ウェーハの中心に、ネガ型フォトレジストの4mLの（ウェーハの1ミリリットル/インチ直....

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Results

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この方法は、タンパク質およびマスターモールドが行われた後、ほぼすべての生物学研究室では10μmと利用可能な機器と小さい寸法のデッドエンドマイクロ流体チャネルを用いた細胞の間接的なパターニングのパターニングを可能にします。この技術は、伝統的なソフトフォトリソグラフィ、または粘着テープの製造（ 図1）28、29で作成されたPDMSマイクロ流体チャネルとを使用して作成されたPDMSマイクロ流体チャネルと共に利用することができます。我々は以前30、光受容体4における軸索ガイダンスの評価のための神経細胞の間接的なパターニングで、この手順を使用することを実証している今、様々な起源のいくつかの追加の細胞型においてその使用を実証しました。ポリ-D-リジン（PDL）上にパターン化胚性ラット皮質ニューロンとラミニンの表面は、一.......

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Discussion

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従来のフォトリソグラフィは、ソフトリソグラフィ用の金型を作成するための十分に確立された技術、設備、材料、従来のフォトリソグラフィを使用するために必要なスキルですが、ほとんどの研究室に容易に入手できません。これらのリソースへのアクセスのない研究室のために、我々は、マイクロ流体デバイスのための比較的単純な機能を備えた金型を作成する方法として、粘着テープの製造を提示しています。この方法は、任意の研究室が作成し、容易に入手可能なツールと研究目的のためのマイクロ流体デバイスを利用することができます。粘着テープ法は、低コストのデスクトップビニルカッター31とを向上させることができます。デスクトップビニルカッターは、再現性、解像度、並びにレイアウトの複雑さを増加させることができます。これらのオプションは、従来のフォトリソグラフィ、デスクトップカッター、または粘着テープ製造の各異なる機能と制限や研究者を持って、慎重に十分であろう方法を検討する必要があります自分のニーズのために。

硬化したPDMSは、ジメチルシロキサンの長いポリマー鎖は、空気分子

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Disclosures

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

Acknowledgements

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この研究のための資金調達（FHKに）脊髄研究（NJCSCR）にニュージャージー州委員会によって提供された、（BLFに）CSCR14IRG005を付与し、NIHは（CHCに）R15NS087501を付与し、（ETA）はFMカービー財団。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CorelDRAW X4 CAD描画ツールCorel Corporation, CanadaX4 Version 14.0.0.701CADツール マイクロ流体デバイスのレイアウトを描くために使用
レーザープリンター HPHewlett Packard, CA1739629粘着テープ技術のためのマイクロ流体デバイスのレイアウトを印刷するために使用
Bel-Art DessicatorFisher Scientific, MA08-594-16BPDMS混合物
の脱気に使用粘着スコッチテープ3M 製品、MNテープ 600粘着テープの製造に使用 マスター
PDMS シルガード 184ダウ コーニング、ミシガン州1064291鋳造ポリマー
ペトリ皿フィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州08-772-23PDMSで鋳造する金型を保つために使用
ブレード付き ステンレス鋼メス (#11)フェザーセーフティカミソリ株式会社2976#11PDMSをカットするために使用されます
ピンセットテッド・ペラ、CA5627-07ピーリング中にキャストされたPDMSの取り扱いに使用
ガラススライドフィッシャーサイエンティフィック、MA12-546-2基板をパターン化する表面として使用
ガラススライドフィッシャーサイエンティフィック、MA12-544-4基板をパターン化する表面として使用
ラバーローラーディックブリックアートマテリアルズ、イリノイ40104-1004気泡を挟まずにガラスに粘着テープを貼る使用
レーザーマスクライターハイデルベルク・インスツルメンツ社(ドイツDWL66fsフォトリソグラフィー製造工程で使用されるクォーツマスクの作製に使用
EVGマスクアライナー(フォトリソグラフィーUV露光ツール)EVGグループ(ドイツEVG 620T(B)フォトレジストを紫外線にさらすために使用
スピンコーター HeadwayHeadway Research Inc.(テキサス州)PWM32-PS-CB15PLシリコンウェーハにフォトレジストをスピンコーティングするために使用されます
フォトレジスト SU-8 50MicroChem, MAY131269金型製造に使用されるネガフォトレジスト
SU-8 DevloperMicroChem, MAY020100フォトレジスト開発者
トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル-1-トリクロロシランUCT Specialties, PAT2492-KGPDMSの付着を避けるために金型をコーティング
イソプロパノールSigma-Aldrich, MO190764洗浄溶剤
エタノールSigma-Aldrich, MO24102滅菌溶剤
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩 (PDL)Sigma-Aldrich, MOP0899-10MGPDL 溶液は、四ホウ酸ナトリウムバッファー
ラミニンSigma-Aldrich, MOL2020で 0.1 mg/mL で調製されますLamininは10µに分注されました。Lアリコートと20µに希釈。g/µ
BSAフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州BP1605100細胞培養
C2C12筋芽細胞llineATCC、VA、CRL-1722C2C12パターニング
PC12細胞株ATCC、VACRL-1721PC12パターニングのデモンストレーションに使用
コラーゲン1型、ラットテールBD Biosciences40236細胞培養
DMEMGIBCO, MA11965-084細胞培養
馬血清, 熱不活化Fisher Scientific, MA26050-070細胞培養
ファロイジン-テトラメチルローダミン B イソチオシアネート (TRITC)Sigma-Aldrich, MOP1951細胞を標識するには
Calcein-AM 生死細胞 アッセイキットInvitrogen, MAL-3224細胞生存率アッセイ
生検 穴パンチテッド・ペラ,CA15110-10PDMS のパンチ穴
日本 州) )します

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
  2. Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering. Biotechnol J<....

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