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方法論記事

高齢者の短期漸進的筋力トレーニングによる筋力・筋力・筋弛緩力の改善

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DOI:

10.3791/55518

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2017年7月5日

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1Åstrand Laboratory of Work Physiology, The Swedish School of Sport and Health Sciences, GIH, 2Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet

この記事について

サマリー

高齢者に対する短期抵抗トレーニングの効果は、いくつかの方法の同時使用によって調査された。対照群と比較して、筋好気性能力、耐糖能、筋力、筋肉の質（ すなわち、細胞シグナル伝達および筋繊維型組成に関与するタンパク質）を含む多くの改善が見られた。

要約

このプロトコルは、短期抵抗トレーニング（RET）を実施する高齢者の筋好気性能力、耐糖能、強さ、および力を検査するための広範な方法の同時使用を記載する。 RET参加者は、1週間に3回、8週間にわたって1時間、進行性抵抗性訓練を監督した（71±1歳、範囲65〜80）。訓練を受けていない対照群と比較して、RETは、強度、力、耐糖能、および筋有酸素能力のいくつかのパラメータを示すために使用された尺度の改善を示した。筋力トレーニングは、頑丈なフィットネス器具のみを備えたジムで行われた。膝伸筋強度の等速動力計は、RET群で増加した同心、偏心、および静的強度の測定を可能にした（8〜12％対前試験）。最初の0〜30msにおける力（力発達速度、RFD）もRET群（52％）の増加を示した。フリークによる耐糖能試験2時間後の血糖値（14％）および曲線下面積（21％）の点でRET群の改善のみを示した。血中脂質プロファイルも改善した（8％）。組織化学を用いて調製された筋肉生検試料から、IIa型線維の量が増加し、RET群におけるIIxの減少傾向は、繊維組成の点でより酸化的な変化への変化を反映した。ウェスタンブロット（筋肉タンパク質合成のシグナル伝達に関連するタンパク質含量を決定する）は、RET群のAktおよびmTORの両方で69％の上昇を示した;これはまた、RET群のみにおいて、OXPHOS複合体IIおよびクエン酸シンターゼ（〜30％）および複合体IV（​​90％）のミトコンドリアタンパク質の増加を示した。我々は、このタイプの漸進的抵抗トレーニングが、様々な改善（ 例えば、強さ、力、有酸素能力、耐糖能および血漿脂質プロフィール）を提供することを実証する。

概要

高齢化は、筋肉量（筋肉減少症）、筋力、および力の喪失と関連している。強度の低下、おそらくさらに重要なのは、動力の不動、怪我の危険性の増大、生活の質の低下です。耐性訓練は、筋肉減少症および筋肉機能の低下に対抗するよく知られた戦略である。筋力の大まかな見積もりは、達成された反復の負荷または数から得ることができる。しかし、本研究では、等速、同心、偏心収縮時のトルク情報と力発達の動態を把握するために、等速ダイナモメータを用いて筋肉機能に関するより詳細で正確な情報を得た。

高齢者では、全身レベル（VO 2max ）および骨格筋での好気性能力が低下する。加齢に伴う心拍数の低下は、VO 2max 1の減少の大きな部分を説明するが、主に減少した身体活動2に関連した酸化能力が寄与する。ミトコンドリア機能の障害は、筋肉減少症およびインスリン抵抗性の発症にも関与する可能性がある3 。筋肉好気性能力は、マトリックス（ すなわち、クエン酸シンターゼ）およびミトコンドリア内膜の両方に位置するミトコンドリア酵素およびタンパク質複合体の内容物の生化学的分析を通じて筋生検で評価された。さらに、筋組織形態（ すなわち、繊維の種類組成、繊維断面積および毛細血管密度）に対する耐性訓練の効果を測定するために、組織化学技術を用いた。筋好気性能力を評価する別の方法は、運動誘発枯渇後のクレアチンリン酸塩再合成の速度を磁気共鳴分光法を用いて測定することである4 。この方法は、 インビボ筋好気性容量の推定値を提供するミトコンドリア機能障害と循環障害を区別することはできません。さらに、設備のコストが高いため、この技術をほとんどの研究所で使用することが制限されています。有酸素能力（VO 2maxとミトコンドリア密度）は、若年者と高齢者の両方の持久運動によって改善することができる5,6 。しかし、これらのパラメータに対する耐性訓練の効果は、特に高齢者では調査されておらず、結果は7,8,9,10と相反する。

2型糖尿病は、高齢者集団における広範な疾患である。身体活動と肥満は、2型糖尿病の増加した発生率を説明する主要な生活習慣関連因子である。低強度の有酸素運動は、耐糖能が低下した被験者にしばしば推奨されます。しかし、それはuncです高齢者の筋力トレーニングが耐糖能/インスリン感受性にどのように影響するかを学ぶ11,12。インスリン感度を測定する最も正確な方法は、グルコースクランプ技術を使用することです。ここでは、上昇したインスリンの状態の間、グルコース注入によって血糖が一定に維持されます。この技術の欠点は、時間がかかり侵襲的（動脈カテーテル法）であり、特別な実験施設が必要であることである。この研究では、医療機関で一般的である経口糖負荷試験を用いた。この方法は、いくつかの被験者が限られた期間にわたって調査される場合に適している。

実験手順の試験およびタイムラインは、以下のように要約することができる。 8週間前後の試験には3つの別々の日を使用し、同じ配置とおおよその時間スケジュール（毎日24時間以上、強い>図1）。最初の試験日に、身長、体重、無脂肪体重（FFM）、上肢周長（仰臥位の膝蓋骨の15cm上）などの人体計測データを測定する。準最大サイクリング能力;ステップ4と5で説明したように、膝の筋力を測定します。2回目の試験日に大腿部から筋生検を行います。詳細については、手順6.1を参照してください。最後の試験日に経口耐糖能（OGTT）を試験する。詳細については、手順7.1を参照してください。すべての参加者に、24時間にわたり精力的な身体活動を避け、各試験日前に一晩中一晩中絶食させるように要請する。しかし、OGTT試験日の48時間前に激しい身体活動を避けるように頼んでください。毎日の身体活動や食事習慣に従うように頼んでください。介入前と介入後、グループで自己報告された食物摂取量と食物の種類は変わらなかったことに注意してください。

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図1：実験プロトコル。回路図。 3回の前試験と後試験の間のタイミングは、各被験者について同様であり、少なくとも24時間であった。詳細は本文中に記載されている。この図はFrank らから修正されました。 Scand。 J.Med。 Sci。スポーツ 。 2016：26,764-73。 28 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

本研究では、高齢者の短期耐性訓練が筋肉酸化能および耐糖能に及ぼす影響を調査した。第2の目的は、筋力、筋肉の質的改善（ すなわち、細胞シグナル伝達および筋繊維型組成に関与するタンパク質）に対する効果を調べることであった。

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プロトコル

スウェーデンのストックホルム地域倫理委員会は、調査の設計を承認した。

1.素材

  1. BMI値が20〜30 kg・m -2の 65〜80歳の比較的健康な女性と男性をリクルートします。それらを2つのグループにランダム化します。両方のグループの個人が比較的低い身体活動レベル（ すなわち、中等度の身体活動および定期的な運動訓練なし）を有することを確認する。
  2. β遮断薬の使用者や冠状動脈疾患の患者、重度の神経学的または関節の問題を除外する。
  3. 試験と訓練のセッションで起こり得る不快感やリスクを教えて、被験者に書面による同意を求める。
  4. トレーニング（CON）群を持たない抵抗トレーニング（RET）およびコントロールと年齢、性別、BMIのバランスをとる。あるグループにトレーナーの下で週に3回、1週間8週間RETを実施するよう依頼する。他のグループはコントロールとして役立ちますls（CON）。

2.テストとトレーニング

注：8つのエクササイズは、標準的なストレングストレーニングの練習です：座ったレッグプレス、座った腹部クランチ、仰臥位チェストプレス、座った背部エクステンション、座った肩のプレス、座ったローイング、座った脚の伸展（膝伸展） ;代表的な結果セクションの図8を参照してください。

  1. 最初の訓練セッションでは、各訓練の1回の最大反復回数（1RM）で最大強度を評価する。
    注：1 RMモデルは一般的に使用され、被験者が抵抗を1回だけ持ち上げたり押したりできる荷重として定義されますが、2回ではありません。
    1. 開始前に、参加者に、試した運動の短いウォーミングアップ（非常に軽い負荷での少数の初期試行を伴う）を行うように頼んでください。その後、予想される1 RM値のすぐ下まで負荷を増加させます（ほとんどの場合、広告）。サブジェクトが1回だけ実行できる最大負荷（= 1 RM）を登録します。
    2. 8つの標準的な訓練の練習で1 RMを測定します （代表的な結果セクションの図8を参照）。試験した各運動の間に少なくとも2-3分間休息するように被験者に依頼する。
      注：各トレーニングエクササイズのテストを含むすべてのトレーニングエクササイズには、強度トレーニング装置が使用されていました。
  2. RETグループ全体に1週間に3回、監督された筋力トレーニングを8週間実施するよう依頼する。ウォームアップの後、上記の8つの標準的な訓練を実施するよう参加者に依頼してください。彼らは各セットで12回運動を繰り返し、各運動の3つのセットを実行する必要があります。各セットの間に1分、各エクササイズの間に2〜3分休ませる。
    1. 被験者には、同心円期（ すなわち、筋肉短縮期）にはできるだけ早く各運動を行い、偏心相（ すなわち、筋の伸長相）。
      注：被験者は任意の順序で演習を行うことができます。しかし、レグエクササイズを開始したり終了したり、提示された順序で8つのエクササイズを試行してもらいます。 8つのエクササイズには、強度トレーニング装置を使用してください。
    2. 各トレーニングセッションでは、1回の運動ごとに1 RMの75〜80％で3組を実行するよう参加者に依頼します。参加者が3組のすべての運動で12回反復することができた後、セッションの負荷を約5％増加させる。

3.亜最大サイクリング試験

注：試験1日目に準最大サイクル試験を行います（はじめにおよび図1を参照）。

  1. 2つの最大レベルを含むサイクル・エルゴメーター・テストを、それぞれ4分14,15分間行います。第1の作業速度を低く（30W）、第2の作業速度を60-12に設定するサイクルエルゴメータの負荷間に休止時間はありません。
    注：最初の負荷はすべての被験者で同じですが、2番目および最後の準最大レベルは各被験者の最大心拍数の約65〜85％でなければなりません。両方の負荷は、8週間のトレーニングの介入期間の前後で同じでなければならない。
    1. 試験の前に行われた熟知試験に2番目に高い負荷レベルを設定するには、その人がどのように物理的に能動的であるかを尋ね、被験者が最初に短期間サイクルするようにする。テストリーダーは、最終的な準最大負荷が適切であるかどうかについて、被験者の心拍数に基づいて意見を作成します。
    2. 3分15秒、3:30分、3:45分に観察されたHRの平均値をとることによって、低および高作業速度の最後の1分間に、胸部ベルトを介して心拍数モニタを使用して平均定常心拍数（HR）を記録する。 、および各作業時間で4:00分。
    3. エルゴ・スパイロメトリック装置を使用して、ガスの組成（O 2およびCO 2 ）が失効し、インスピレーションを受けた空気の中にある。両方の作業負荷で呼吸交換比（RER; CO 2 / O 2 ）を登録し、最後の1分間（15秒ごとに4つの測定値から）のRER平均値を定量化する。

4.膝伸展筋力：静的、偏心、同心のピークトルクと力の発生率

注：試験1日目に膝強度の測定を行います（序文と図1を参照）。

  1. 記録の前に、サブマックスレベル（すなわち、最大心拍数の約65〜85％）でサイクルエルゴメーターで8〜10分間サイクリングすることにより、ウォームアップを実施するように被験者に依頼する。
  2. 被験者に等速動力計のベンチに座るように依頼する。肩と腰の上にストラップで被験者の胴体を固定する。被験者のシャンクをダイナモメーターシャフトに2本のストラップでしっかりと固定します：1本は膝の下に、もう1本はただのものですアンクル。ひざ関節軸を動力計軸の回転中心に合わせます。
  3. 被験者が固定されたら、被験者が等速動力計に座っている最大の随意の膝強度をピークトルクとして評価する。最初に、被験者が膝強度器具（等速性動力計）に精通するためのいくつかの試験を行うことを可能にする。
  4. 右脚を30 deg / sの一定の角速度で4つの最大自発偏心および同心膝伸展を（交互に）実行するように個人に依頼します。モーションの範囲を90°〜15°（直線脚= 0°）に設定します。
    1. 偏心の仕事では、15°から90°の膝の角度からの全運動を通して最大の努力でダイナモメーターシャフトに抵抗するように被験者に頼んでください。同心円タスクでは、膝伸展のダイナモメーターシャフトの下肢を、運動範囲全体にできるだけ固く押すように被験者に依頼します。
  5. ダイナミックレコーディング後に4分の休憩を取る。その後、静的最大随意収縮トルク（MVC）を65°の膝角度で4回評価する。すべての静的試験では、同じ動力計に座っている被験者に動力計の軸（これは現在65°で固定されている）に対して高速かつ激しく蹴るように尋ねてください。
  6. トルク（強度）信号の場合は、等速ダイナモメータに接続されたアナログ/デジタルコンバータボックスを使用してアナログトルク信号をデジタルに変換します。
    注：コンバータはアナログ信号をダイナモメータからデジタル信号に自動的に変更します。その後、自動的にデータが収集されるコンピュータにエクスポートされます。
    1. コンピュータのソフトウェア解析プログラムでサンプリング周波数を5 kHzに設定します。デジタル信号をコンピュータに保存して、ソフトウェア分析プログラムを使用して次の強度値分析を行います。
  7. その後の解析では、偏心、同心および静的測定における各被験者の4つの試験から得られた最高値。ソフトウェアプログラムでは、4つの試行のうち最も高い値をクリックし、コンピュータ画面に表示された強度値を書き留めます。
    1. 各被験者の偏心および同心円記録で最も高いピークトルクを記録し、4回の静的試験の中で最高の強度値を記録する。
      注：座位における膝伸筋の等速ダイナモメーター試験は、適切な信頼性と有効性を有する16,17 。
  8. 静的試験の中で最も高い値で0〜30msおよび0〜200msの間の力（トルク）発達（RFD）の速度を測定する。膝伸筋の強さ（時間：0 ms）の収縮の開始のために7.5-Nmレベルでゼロの値を設定します18,19 。カーソルを移動する（筋肉用のソフトウェアプログラム強度分析）をyスケール上の「7.5Nm」値と比較して、0msの位置を得る。
    1. 事前テストの評価のために、カーソルを30 ms値に設定します（時間0 ms後）。 30msでNmの上昇を示す値を書き留めます（Nmが7.5Nm = 0msから増加）。テスト後の値についても同じ手順を実行します。
    2. 0-30 msの期間にわたる試験前のNm値（分母）と比較して、試験後のNm値（分子）のパーセンテージの増加を計算する。従って、プレテストからポストテストまでのRFD上昇率をパーセントで表示する。 0〜200 msの時間間隔について同じ分析を行います。

筋肉生検

注：試験2日目に筋生検を行います（はじめにおよび図1を参照）。

  1. conchotome 20を使用して、大腿筋の外側の筋肉の中央部分から筋生検を行います。
    1. 生検の前に、1-2mLの局所麻酔を皮下に筋膜に注入する。数分後、膝蓋骨から前上腸骨棘までの距離の約1/3の皮膚と筋膜を通って小さなメスで切開する。コンコモトを使用して約100〜150mgの筋肉組織を抽出する。
  2. 液体窒素中で凝固点まで冷却したイソペンタン中の組織化学のサンプルを凍結し、-80℃で保存する。筋肉組織30〜50mgのサンプルを保管してください。
  3. タンパク質を液体窒素中で迅速に凍結し、-80℃で保存します。筋肉組織30〜50mgのサンプルを保管してください。

6. OGTT

注：試験3日目にOGTT（経口ブドウ糖負荷試験）を行います（はじめにおよび図1を参照）。運動とOGTTとの間の時間は、48時間を超えなければならず、前と後の間で類似していなければならないテスト。 2時間の経口OGTTを使用して、この時間中の頻繁な血液サンプルが正常レベルまたは増加レベルを示しているかどうかを調査し、糖尿病または前糖尿病状態を示す。

  1. 一晩絶食し、試験日または前日に激しい運動をしなかった被験者について、朝にOGTT試験を実施する。
  2. グルコースの摂取の15分前、直前、腹腔内の静脈カニューレを介して腹腔内の静脈カニューレを介して血液サンプル（4mL）を採取し、続いてグルコース摂取後15,30,60,90および120分後に250g / L溶液中のグルコース75g）。
  3. 血液サンプルを1,500 xgおよび4℃で10分間遠心分離し、将来の分析のために-20℃で血漿を保存します。サンプルを使用して、標準のグルコースレベルテストを実行します（ステップ7）。
  4. グルコース、インスリン、およびc-ペプチドについては、グルコースの基礎グルコースレベルを上回る時間積分を決定することによって曲線下面積（AUC）を計算する。 OGTTの結果を使用する方程式：10000 *√[（グルコース基礎 *インスリン基礎 ）*（グルコース平均 *インスリン平均 ）に従って、松田法21を用いて全身に対するインスリン感受性を計算する。

7.血液サンプル分析

  1. 自動分析装置で静脈血漿中のグルコース濃度を定量する。 2時間のOGTT 22の後、血糖値> 7.8mmol / Lでの耐糖能異常レベルを設定する。
  2. インスリンおよびc-ペプチドの血漿分析を行うためにELISAキット22を使用する。プレートリーダーを使用してください。プレートリーダー（それぞれ別々の機会に）にインスリンとc-ペプチドのELISAプレートを入れてください。
    注：プレートリーダーは、一定の吸光度でプレート上のサンプルを測定することにより、インスリンの量およびc-ペプチドの量を測定する。血中TG、HDL、アポリポタンパク質A1およびアポリポタンパク質Bを、カロリンスカ大学病院、ストックホルム、スウェーデン。

8.筋肉試料の分析

  1. イムノブロッティング
    1. まず、10 -1 mbar以下の圧力で12時間凍結乾燥機内で筋肉サンプルを凍結乾燥する。それを解剖し、針と鉗子を使って血液と結合組織がなくなるように軽い顕微鏡で解剖する。 -80℃で保管してください。
      注：筋肉の適切な量は、乾燥重量1〜5mgの間ですが、プロトコールは、単繊維の至るところで1mg未満に調整することができます。 1回の生検で存在する筋組織の量が少ないため、そのRET参加者の値はイムノブロッティングに使用されませんでした。
    2. 筋肉サンプルを均質化する 2mM 4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、5mMエチレングリコール - ビス（2mM） （β-アミノエチルエーテル）-N、N、N '、N'-テトラアセチル50mMβ-グリセロリン酸、1％TritonX-100,1mM Na 3 VO 4,2mMジチオスレイトール、20μg/ mLロイペプチン、50μg/ mLアプロチニン、1％ホスファターゼ阻害剤カクテル、および40μg/μLPMSF（フェニルメチルスルホニルフルオライド）。
      1. 0.5 mmの酸化ジルコニウムビーズを筋肉のある各チューブに入れます。緩衝液を添加し、スピードステップ7-8（ここでは最大10）および4℃で2×1分間ホモジナイズする。
    3. ホモジネートを10,000×gで10分間遠心分離する。残りの上清を新しいチューブに移し、構造タンパク質を含むペレットを廃棄する。
    4. 市販のキットを用いて、660 nmでプレートリーダーを使用して、上清中のタンパク質濃度を分光光度法で測定する。
      1. 続いて2倍Laemmliサンプルバッファーとホモジナイジングバッファー（1：1）でサンプルを1.5μg/＃181; L。 95℃で5分間加熱してタンパク質を変性させます。分析前に希釈したサンプルを-20℃で保存する。
    5. ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）のために、各サンプルから30μgのタンパク質を18ウェルのプレキャスト勾配ゲル（4〜20％アクリルアミド）に負荷し、300Vで氷上で30分間電気泳動する。
    6. トランスファーバッファー（25mMトリス塩基、192mMグリシン、および10％メタノール）中で4℃で30分間ゲルを平衡させる。 0.2μmの孔径を有するポリフッ化ビニリデン膜にタンパク質を4℃で3時間、300 mAの定電流で移す。
    7. 等しい負荷と移動を確認するには、膜を全タンパク質染色24で染色します。それぞれの標的タンパク質について、各対象からの全ての試料を同じゲル上にロードし、同時に全てのゲルを流す。
    8. Tris緩衝食塩水（20mMトリス塩基、192mM NaCl; TBS; pH7.6）中、室温で1時間膜をブロックし、5％脱脂乳。
    9. 2.5％脱脂粉乳を含み、0.1％Tween-20（TBS-TM）を補充したTBSで希釈した一次抗体（材料リスト参照）で一晩膜をインキュベートする。
    10. 一次抗体インキュベーション後、TBS-TMでメンブレンを洗浄し（2×1分+ 3×5分）、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合した二次抗体（材料リスト参照）と共に室温で1時間インキュベートする。 TBS-TM（2×1分および3×10分）で再度洗浄し、再びTBSで4回5分間洗浄する。
    11. 6〜12mLの化学発光基質を膜に5分間適用する。 2つの透明プラスチックシートの間に膜を置く。膜を外光を遮るCCDカメラの前に置く。ケミルミネッセンスカメラフィルターを使用して連続露光を行います。
      1. ソフトウェアプログラムを使用して、2分間10回の曝露を取得するか、または信号が飽和するまで曝露を取得する。標準設定を使用してください。両方のオプティカルフィルタ設定を使用してください。o化学発光とレンズ設定を取得する。
    12. 彩度に至らない最高の露出を使用し、バンドの輪郭をマークします。同じソフトウェアを使用してバンドを強度x mm 2として定量化する。バンド強度からバックグラウンドノイズを差し引く。結果を総タンパク質染色液に対して提示し、それをベースラインと比較したパーセント変化として表す。
  2. 組織化学
    注：以下の組織化学技術は、以前の刊行物25に記載されている方法に基づいている。
    1. 組織化学のために、クライオスタットを用いて-20℃で連続断面（10μm）を切断する。ガラスキュベットに保存されたガラススライド上に断面をマウントし、室温で生検スライスを風乾します。
    2. ATPアーゼ染色のためのpH4.3,4.6および10.3でのプレインキュベーションのために、各pHレベルの緩衝液を調製する。キャピラリーを視覚化するために、アミラーゼ-PAS法27を用いた断面図で示す。
    3. 較正溶液をラベル付き較正ビーカーに注ぐことによってpHメーターを較正する。適切なボタンを押して、メインメニューからpHを選択します。
      1. 脱イオン水でプローブをすすぎ、最初のキャリブレーションビーカーにプローブを置きます。メンブレンに気泡がないことを確認してください。最初の校正溶液を測定し、次の校正溶液を提示します（ディスプレイは次の溶液を求めます）。
      2. プローブを脱イオン水ですすいだ後、第2キャリブレーションビーカーに入れます。メンブレンに気泡がないことを確認してください。第2の較正溶液を測定し、次の較正溶液に進む。
      3. プローブを脱イオン水ですすぎ、第3の較正ビーカーに入れる。メンブレンに気泡がないことを確認してください。第3の較正溶液を測定する。
        注：キャリブレーションが良い、ディスプレイは簡単に表示されます、 "第3バッファOK"とメインメニューに戻ります。
    4. ATPase染色のために以下のようにバッファーを使用してください。
      1. pH10.3の溶液を調製するには、（A）グリシン4.506g、CaCl 2 4.8g、NaCl 3.51gおよびdH 2 O 600mL、および（B）NaOH 2.176gおよび540mL冷暗所または冷蔵庫に保存してください。 1ヶ月以内に使用してください。
      2. pH 4.3および4.6で溶液を調製するには、「酸プレインキュベーション」を行います。 6.47gの酢酸Na、3.7gのKCl、および500mLのdH 2 Oを用いてプレインキュベーション用の酸を調製する。その後、2.5gのdH 2 Oを250mLのdH 2 Oに溶解することによって1％CaCl 2溶液を調製する。 ％CoCl 2溶液を5gを250mLのdH 2 Oに溶解することによって調製した。
      3. 上記のようにこれらのソリューションを保管し、使用してください。最後に、0.2％硫化アンモニウムを200μLの20％（NH 4 ） 2 Sを40mLのdH 2 Oに混合する。後者を新鮮に調製する。
    5. 以下のように、特定のpH値で溶液を調製する。 pHメーターの校正後、キュベットとカルシウムとコバルトの塩化物を冷蔵庫から取り出し、室温に暖めてから染色します。
      1. pH 10.3の場合、約25mLの溶液Aを小（約70mL）ガラスビーカーに加える。 pHを測定する。必要なpHが10.37に達するまで溶液Bを添加し続ける。染色が濃すぎる場合は、pHを上げてください。明るすぎる場合はpHを下げてください。
      2. pH4.6では、約25mLの「酸プレインキュベーション」を小さなガラスビーカーに加える。 pHを測定する。 5M酢酸を用いてpHを低下させる。汚れの画像が暗すぎる場合は、pHを上げて明るくしてください。明るすぎるとpHが低下して暗くなります。染色が役に立たない場合は、別のpHを試してください：4.8 inst4.6のead。
      3. pH4.3では、4.6と同じ操作を行うが、さらに酢酸を加える。汚れが濃すぎる場合はpHを下げ、暗すぎる場合はpHを上げて繊維を指定してください。
      4. 次のようにATP溶液を調製する。キュベット（10mL）あたり0.017gのATPを計量するので、3キュベットあたり0.051gまたは4キュベットに対して0.068gとする。 pH 10.3（シリンダースケールガラスを使用）で30mL（3キュベット、10mL /キュベット用）の溶液をとり、ATPを秤量したガラスビーカーに入れる。
        1. 十分に混合し、pHを測定する。 pHが正確に9.40に達するまで、濃HClを用いてpHを低下させる。
      5. 様々なpH値でのインキュベーションのために、以下を行う。 10.3溶液を1つのキュベットに入れ、37℃の水浴中で9分間インキュベートする。 4.3溶液を別のキュベットに入れ、室温で5分間インキュベートする。 4.6溶液を最後のキュベットに入れ、RTで1分間インキュベートする。
      6. 好ましいpHに続いて各キュベットの内容物を以下のように適用する。 dH 2 Oで15回洗浄する。生検試料にATP溶液（0.170gのATP / 100mLのH 2 O）を加える。 37℃の水浴中で30分間インキュベートする。 dH 2 Oで15回洗浄する。
      7. キュベット内の生検試料にCaCl 2溶液（1gのCaCl 2 / 100mLのH 2 O）を加える。 RTで3分間インキュベートする。 dH 2 Oで15回洗浄する。キュベット内の生検試料にCoCl 2溶液（2gのCoCl 2 / 100mLのH 2 O）を加える。 RTで3分間インキュベートする。 dH 2 Oで15回洗浄する。
      8. それを30秒間（NH 4 ） 2 S溶液に入れ、ヒュームフードの下で15回素早く洗う。生検スライスをスライドガラスに接着する。泡を避けるために、生検を絞るが、あまりにも硬くはない。
    6. ファイバーのアーチファクトまたは縦方向の切れ目のない断面の1つの領域を選択します。李の下で分析するソフトウェアを使用してght顕微鏡。
    7. 生検当たり少なくとも150〜200本の繊維の平均から、コンピュータ断層画像（CSA）、毛細血管および繊維タイプの分類（ すなわち、 I型、IIA型またはIIX型）をコンピュータ画像解析によって評価する。断面の筋線維の顕微鏡写真から、3種類の筋繊維（ すなわち、 I型、IIA型およびIIX型）は、pH染色（ すなわち、 4.34、4.65および10.37）。
    8. まず、いくつかのタイプIの繊維にマーキングすることから始める。その後、プログラムは自動的に他のタイプIファイバを登録する。すべてのタイプIファイバが正しくマークされていることを確認してください。特定のファイバーをマークするには、「ベクター」ボタンをクリックします。カーソルを使用して、個々に選択された各筋線維の面積を測定します。
    9. タイプI繊維の分析後、タイプIIAおよびタイプIIXについて同じ手順を続ける。各タイプの筋繊維の平均±SEM（ すなわち、 I型、IIA、およびIIX）は、RETおよびCON群の繊維およびCSAの量に関して計算すべきである。
      注：横断面積（CSA）、毛細血管および繊維タイプの分類（ すなわち、 I型、IIAおよびII型）は、生検当たり平均163±9本の繊維から評価した。

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結果

材料

この研究では、65〜80歳のBMI値が20〜30kg・m -2の比較的健康な女性および男性21人が参加し、2つのグループに無作為に割り付けられました。両方のグループの個人は、比較的低い身体活動レベル（ すなわち、中等度の毎日の身体活動レベルおよび規則的な運動トレーニングなし）を有していた。 1グループ（n = 12,6女性および6男性）は、1週間に3回、8週間トレーナーの下でRETを行い、他のグループは対照（n = 10、5人の女性および5人の男性）を務めた。 RET群とCON群は、年齢、性別、BMIの点でバランスが取れていた（ 表1 ）。ドロップアウトを補うために、より多くの被験者がRETグループに募集された。 CONグループよりもRETグループでより多くのことが予想された。

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ディスカッション

この研究では、高齢被験者の筋肉機能/形態、好気性能力、耐糖能に対する短期進行性抵抗トレーニングの効果を調べるために、多くの技術が用いられてきた。主な所見は、対照群と比較して、筋好気性能力、耐糖能、筋力、筋肉質（ すなわち、細胞シグナル伝達および筋繊維組成に関与するタンパク質）において多くの改善が生じたことであった。たとえば、静的、偏心および同心の最大膝伸展強度（8-12％）;訓練負荷（19-72％）、最初の0-30ms（52％）における力発達の最大速度（RFD）。いくつかのミトコンドリアタンパク質（30〜90％）;筋肉タンパク質合成に関与するタンパク質AktおよびmTor（両方とも69％）。

高齢者は、そのようなプロジェクト中に健康を維持するのが困難な場合があります。 testiによるさまざまな怪我のリスクを認識している必要があります訓練されていない高齢者の間でのトレーニング。トレーニング期間の終了時にRETグループの1人が元の背中の問題を再発しました。しかし、訓練プロジェクト中の怪我や不快感は、古い参加者の調査の終了後も長時間に渡って残っていなかった。トレーニン...

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開示事項

著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

謝辞

著者はAndréeNienkerk氏、Dennis Peyron氏、SebastianSkjöld氏にトレーニングセッションやいくつかのテストを監督してくれたことに感謝しています。参加している被験者に。 Tim Crosfieldに言語リビジョンのために;スウェーデンのスポーツ・ヘルス・サイエンス・スクールから経済的支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウェスタンブロット
Pierce 660 nm Protein Assay KitThermo Scientific, Rockford, IL, USA22662
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo Scientific34096
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)Thermo Scientific78429
Restore PLUS Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46430
PVDF メンブレン用ピアスリバーシブルタンパク質染色キットThermo Scientific24585
10 st - 4–20% Criterion TGX Gel、18 ウェル、30 µLBio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA567-1094
免疫ブロット PVDF メンブレン バイオ・ラッド162-0177
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad161-0374
2x Laemmli SampleBuffer Bio-Rad161-0737
10x Tris/GlycineBio-Rad161-0771
2-MercaptoethanolBio-Rad161-0710
Tween 20Bio-RadP1379-250ML
Band Analysis with Quantity One バージョン 4.6.3.softwareBio-Rad
1% ホスファターゼ阻害剤コクテールSigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA
strong>Antibodies
mTOR (1:1,000)Cell Signaling, Danvers, Massachusetts, USA2983
Akt (1:1,000)Cell Signaling, Danvers9272
Secondary anti-rabbit and anti-mouse HRP-linked (1:10,000)Cell Signaling, Danvers
Citrate synthase (CS) (1:1,000)Gene tex, San Antonio, California, USA
OXPHOS (1:1,000)Abcam, Cambridge, UK
strong>Equipment - Analysis of muscle samples
Bullet Blender 1.5 for homogenizingNext Advance, New York, USA
プレートリーダーTecan infinite F200 pro、Männedorf, Switzerland
Histochemistry
Mayer hematoxylinHistoLab, Västra fröルンダ、スウェーデン 1820
オイルレッドoシグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ00625-25y
NaClシグマアルドリッチ793566-2.5キロ
塩化コバルトシグマアルドリッチ60818-50G
アミラーゼシグマアルドリッチA6255-25MG
ATPシグマアルドリッチA2383-5G
グリシンVWR-化学品/ VWRインターナショナル、Spånga、スウェーデン101196X
塩化カルシウムVWR化学品/ VWR - 国際22328.262
イソペンタンVWR化学品/ VWR - 国際24872.298
タノール96%VWR化学品/ VWR - 国際20905.296
NaOHMERCK、ストックホルム、スウェーデン1.06498.1000
Na酢酸MERCK1.06268.1000
KClMERCK1.04936.1000
硫化アンモニウムMERCKU1507042828
酢酸 100%MERCK1.00063.2511
シフス&急性;試薬MERCK1.09033.0500
過ヨウ素酸MERCK1.00524.0025
クロロホルムMERCK1.02445.1000
pHメーター LANGEHACH LANGE GMBH, デュッセルドルフ, ドイツ
光学顕微鏡Olympus BH-2, Olympus, Tokyo, Japan
Cryostat Leica CM1950Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Leica software Leica Qwin V3Leica Microsystems
Gel Doc 2000 - Bio-Rad, camera setupBio-Rad Laboratories AB, Solna, Sweden 
ソフトウェアプログラムQuantift One - 4.6 (version 4.6.3;Bio Rad)Bio-Rad Laboratories AB, ソルナ, スウェーデン 
経口グルコス耐性試験、OGTT
Glukos APL 75 gAPL、ストックホルム、スウェーデン323,188
自動分析装置 Biosen 5140EKF Diagnostics、Barleben、ドイツ
血漿キットのインスリンとC-ペプチド ELISAMercodia AB、ウプサラスウェーデン10-1132-01、10-1134-01
プレートリーダーTecan infinite F200 pro、Männedorf, Switzerland
Further equipment
Measures of fat-free massFFM-Tanita T5896, Tanita, Tokyo, Japan
すべてのトレーニングエクササイズのための筋力トレーニング機器Cybex International Inc., Medway, Massachusetts, USA 
サイクルエルゴメータ Monark Ergometer 893E、Monark Exercises、Varberg、スウェーデン 
心拍数モニターRS800、PolarPolar Electro OY、Kampele、フィンランド
Oxycin-Pro - 自動エルゴスパイロメトリーデバイスErich Jaeger GmbH、Hoechberg、ドイツ
等速性ダイナモメーター、Isomed 2000、膝筋力D&R Ferstl GmbH, Henau, Germany
CED 1401 データ収集システムと Signal softwareCambridge Electronic Design, Cambridge, UK
筋力分析用ソフトウェア, Spike 2, version 7Signal Hound, LA Center, WA, USA
統計分析用StatisticaソフトウェアStatistica, Stat soft. inc, Tulsa, Oklahoma, USA
筋肉生検機器
Weil Blakesley conchotomeWisex、Mölndal、スウェーデン
麻酔 カルボカイン、20 mL、20 mg / mL;アストラゼネカ、Södertälje, Sweden169,367
Surgical BladeFeather Safety Razor CO, LTD, 大阪, 日本 
<<州、米国エ局所11048030

参考文献

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