私たちは、解剖、固定、およびステロイドホルモンの生合成とその調節機構を研究するために、ショウジョウバエの幼虫と大人の女性のステロイド産生器官の免疫染色のためのプロトコルを記述します。ステロイド産生臓器に加えて、我々は、ステロイド産生器官の神経支配並びにそのような生殖細胞系列幹細胞のようなステロイド産生標的細胞を可視化します。
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方法論記事
フルーツフライで免疫染色でステロイド合成器官とそのインタラクティブ臓器を可視化するためのプロトコル
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
多細胞生物では、細胞の小グループは、成長と再生への全身応答を誘導する、その生物起源の活動の専門機能に恵まれています。昆虫で、幼虫の前胸腺（PG）と、成人女性の卵巣プレイエクジステロイドと呼ばれる主要なステロイドホルモンの生合成における重要な役割。これらのecdysteroidogenic器官は生合成のタイミングは、環境手がかりに影響され、それを通して神経系から神経支配されています。ここでは、ステロイドホルモンの生合成とその調節機構を研究するための適切なモデルシステムを提供キイロショウジョウバエを 、飛ぶecdysteroidogenic臓器や幼虫でのインタラクティブな臓器や果物の大人を可視化するためのプロトコルを記述します。巧みな解剖は、私たちは脳、腹側神経索、および他の組織を含むecdysteroidogenic臓器とそのインタラクティブな臓器の位置を維持することができます。を用いた免疫染色ecdysteroidogenic酵素に対するntibodiesは、組織特異的プロモーターにより駆動されるトランスジェニック蛍光タンパク質と共に、ecdysteroidogenic細胞を標識するために利用可能です。また、ecdysteroidogenic器官の神経支配はまた、特異的抗体又はニューロンの様々なタイプのGAL4ドライバーの集合によって標識することができます。したがって、ecdysteroidogenic器官およびそれらの神経接続は、免疫染色およびトランスジェニック技術によって同時に可視化することができます。最後に、我々は、その増殖とメンテナンスエクジステロイドによって制御されている生殖細胞系列幹細胞を、視覚化する方法について説明します。この方法は、ステロイドホルモンの生合成とその神経調節機構の総合的な理解に貢献しています。
概要
多細胞生物では、細胞の集団は、体全体のために不可欠である彼らの生体活動の専門機能に恵まれています。その任務を果たすために、各組織または器官は、それらの機能に関連する遺伝子のシリーズを発現し、開発のコンテキスト内でそれらの活性を編成するために他の組織と通信します。このような特殊な細胞機能およびインター器官相互作用を特徴づけるために、我々は、細胞の他のタイプの多アーキテクチャにそのまま保持されると共にセルのグループを指定する必要があります。
そのような特殊な器官の一例は、多くの生合成酵素が活性ステロイドホルモン1にコレステロールから変換ステップを仲介ステロイド産生器官です。これらの酵素の遺伝子のほとんどは、特にステロイドの器官で発現され、生合成経路がしっかり体液入力とニューロンの入力を介して多くの外部刺激により調節されます。一度合成、ステロイドホルモンは、体液中に分泌され、遺伝子2の種々の発現を調節するため、多くの組織および器官を標的とします。したがって、ステロイドホルモンの作用は、恒常性、成長、および再生を維持するためのシステム応答を誘導します。
ステロイドホルモン生合成の機能及びステロイドホルモンの多面的な行動を調査するために、 キイロショウジョウバエは、適切なモデル系として利用することができます。幼虫の段階....
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プロトコル
注：プロトコルの全体的なスキームを図1に示されています。
1.幼虫リング腺の解剖（RG）
NOTE：Dで。 cyclorrhaphous双翅目に属するメラノは 、PGは、複合内分泌器官内リング腺（RG、 図2D）と呼ばれます。それはPGを外科的（後述する）他のタイプの細胞から分離されることが不可能であるため、実用的な目標は、解剖によって無傷の、無傷RGを単離することです。
- 適切な発達段階での幼虫の準備
注： キイロショウジョウバエの幼虫の発達段階を同期させるために、狭い時間ウィンドウ内の卵を収集するために、適切なタイミングで幼虫を収集する必要があります。- 25℃でのグレープジュース寒天プレート上で2時間、卵を集めます。
- 新たに孵化し収集1 ST齢ピンセットで解剖顕微鏡の下で幼虫とマッシュポテト標準酵母/コーンミールフライ食品を含む小さなバイアルに移します。
注：幼虫の年齢は「卵は産卵後の時間（HAEL）」、「時間ハッチ後（ほら）」、または「L3の脱皮後の時間（hAL3E）」で表されます。 - 適切な時点で、....
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結果
私たちは、ステロイド産生器官やキイロショウジョウバエの幼虫と大人の女性で彼らのインタラクティブな臓器を可視化するために上記のプロトコルを使用していました。プロトコルの全体的なスキームを図1に示されています。
PG（ 図2D）を含むRGは、脳よりも小さく、より透明であり、脳（ 図2A-C及び図3-E）の前方、背側に位置しています。 PG細胞を標識するために、いくつかのグループがecdysteroidogenic酵素（ すなわち 、ネバーランド23、24 Spookier、シュラウド20、ファントム25、肉体25、及びシャドウ26）に対する抗体の様々なタイプを生成しました。これらの.......
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ディスカッション
私たちは、エクジステロイド生合成およびキイロショウジョウバエにおけるその調節機構を研究し、そして解剖および免疫染色のためのプロトコルを考案しました。エクジステロイド生合成のタイミングは、ニューロンの入力33を介して、環境手がかりに影響されるので、解剖時の脳、VNC、および他の組織と一緒にecdysteroidogenic器官の神経支配を維持するために不可欠です。
上述したように、 キイロショウジョウバエ PGはコーパスallata（CA）と複合内分泌器官RGとコーパスcardiaca（CC）（ 図2D）を形成します。 PGは、エクジステロイドを生成しながら、CAおよびCCは、それぞれ、幼若ホルモン及びadipokineticホルモンを産生します。この解剖学的特性はDでecdysteroidogenesisを研究、研究者への障害となってきました。 ショウジョウバエ 、他の昆虫に比べて。しか.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されていません。
謝辞
私たちは、この作品のために彼らの技術支援のため玲子喜瀬とTomotsune Amekuに感謝します。我々はまた圭伊藤、オルガ・アレックシーエンコ、明子琴、正幸三浦、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター、京都ストックセンター（DGRC）、および株式および試薬のための発達研究ハイブリドーマバンクに感謝しています。この作品は、日本学術振興会科研費助成金番号16K20945、内藤財団、井上科学研究賞からYSNへの助成金によってサポートされていました。文部科学省科研費助成金番号16H04792からRNへの助成金によって。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| <ストロング>エッグコレクション | |||
| ティッシュ培養ディッシュ(55mm) | AS ONE | 1-8549-02 | ぶどう果汁寒天プレート |
| 用コレクションカップ | 光化学 | ||
| 酵母ペースト | オリエンタルドライイースト、東京 | ||
| ぶどう果汁100% | ウェルチ食品 | ||
| 飼育幼虫 | |||
| 小さなバイアル(12ml、40回;23.5 mm、PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| 使い捨てループ | AS ONE | 6-488-01 | |
| 標準フライフード | Blooingtonストックセンターのウェブサイトで私たちをレcepi。 | ||
| 解剖 | |||
| 解剖顕微鏡 | カールツァイス | ステミ 2000-C | |
| 解剖顕微鏡 | ライカ | S8 AP0 | |
| 組織培養皿 (35×10mm, 未処理) | 岩城 | 1000-035 | |
| シルガード | 東レ | 石炭シリコン 皿内 | |
| テルモ針 (27G,0.40 x 19 mm) | テルモ | NN-2719S | を切る「ナイフ」 |
| イノックス #5 | デュモン | ||
| 昆虫ピン (直径0.18mm) | フィレット解剖 | 滋賀ブランド | |
| 夏目製作所 | MB-50-10 | ||
| fixation | |||
| ultra純水 | メルク ミリポア | ||
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | |||
| ホルムアルデヒド | ナカライ テスク | 16222-65 | |
| パラホルムアルデヒド | ナカライ テスク | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| 抗SRO(モルモット)、1:1000 | |||
| 抗GFP(ウサギ)、1:1000 | Molecular Probes | A6455 | 島田丹羽、丹羽、2014 |
| 抗GFP(マウスmAb、GF200)、1:100 | 中来テスク | 04363-66 | |
| 抗5HT(ウサギ)、1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1(マウス) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| 抗DE-カドヘリン(ラット)、1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| 抗nc82(マウス)、1:50 | DSHB | nc82 | |
| 二次抗体 | |||
| ヤギ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート | Life Technologies | A-11008 | |
| ヤギ抗マウスIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート | Technologies | A-11001 | |
| ヤギ抗ラットIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 546コンジュゲート | Life Technologies | A-11081 | |
| ヤギ抗モルモットIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 555コンジュゲート | Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546色素標識ファロイジン | ライフ技術紹介 | A-22283 | |
| <ストロング>マウント試薬 | |||
| マイクロスライドガラス | 松波硝子工業 | SS7213 | |
| 角型顕微鏡カバーガラス | 松波ガラス工業 | ||
| FluorSave試薬(マウンティング試薬) | Calbiochem | 345789 | |
| トランスファーピペット 1 ml (ディスポーザブルスポイト) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700レーザー走査型顕微鏡システム | カールツァイス | 倒立Axioオブザーバー。Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | これは、64 ビットの Microsoft Windows7 オペレーティング システム | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| です。GMR45C06-GAL4 | ブルーミントンショウジョウバエストックセンターから。(#46260) | ||
| UAS–GFPです。UAS–mCD8::GFP | gifts(東京大学伊藤和彦さんより) | ||
| w[1118] | |||
| w; ファントム-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w;UAS-mCD8::GFP;TRH-GAL4 | Ref29、Alekseyenko、O.V、Lee、C.&を参照してください。クラヴィッツ、EA(2010) | ||
| w;UAS-mCD8::GFP | ブルーミントンショウジョウバエストックセンターから。(#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | ブルーミントンショウジョウバエストックセンターから。(#51941) |
参考文献
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell.....
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再版と許可
