3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法

Summary

ここでは、細胞凝集を通じて3D細胞スフェロイドを形成するための迅速で柔軟なプロトコルについて説明します。これは、複数の細胞タイプに容易に適応でき、細胞遊走、浸潤、アノイキスアッセイなどのさまざまなアプリケーションでの使用や、細胞-マトリックス相互作用のイメージングと定量化に適しています。

Abstract

単層細胞培養物は十分に複雑な細胞-細胞及び細胞-マトリックス相互作用に関与する組織のインビボ挙動をモデル化しません。三次元（3D）細胞培養技術は、接着細胞培養物の欠点に対処するために開発され、最近の技術革新です。 インビトロ組織類似体を生成するためのいくつかの技術が開発されてきたが、これらの方法を確立すること、高価、しばしば複雑であり、特殊な装置を必要とし、一般的にのみ、特定の細胞型との互換性により制限されます。ここでは、腫瘍の様々な成長と正常細胞株と互換性のある一貫したサイズの多3Dスフェロイドに細胞を集約するための迅速かつ柔軟なプロトコルを記述します。我々は、足場非依存性スフェロイドの生成を促進し、高度に再現可能な方法で細胞単層の形成を防止するために、血清およびメチルセルロース（MC）の種々の濃度を使用します。 INDIVのための最適条件idual細胞株はスフェロイド形成培地中MCまたは血清濃度を調整することによって達成することができます。生成された3Dスフェロイドは、細胞シグナル伝達または遺伝子発現研究、候補薬物のスクリーニング、またはそのような腫瘍細胞の浸潤および遊走などの細胞プロセスの研究に含めた幅広い用途での使用のために収集することができます。プロトコルはまた、容易に単一細胞からクローンスフェロイドを生成するように適合され、足場非依存性増殖およびアノイキス耐性を評価するために適合させることができます。全体として、我々のプロトコルは、組織の三次元微小環境を再現し、正常細胞および腫瘍細胞のインビボ増殖をモデル化するために、3D細胞スフェロイドを生成し、利用するための簡単に修正する方法を提供します。

Introduction

腫瘍細胞の挙動の生物学的に関連する評価は、これらが十分に生体内で見つかった細胞微小環境を反映していないため、部分的には、従来の2次元（2D）細胞培養法を用いて挑戦されています。培養物（ 例えば 、Boydenチャンバーアッセイ）に細胞外マトリックス成分を組み込んだ別のアプローチは、生体内の組織環境の複数の生理的に代表的なものです。しかしながら、それらは個々の細胞の挙動の評価に限定することができ、組織または腫瘍増殖^1、2、3に寄与する細胞-マトリックス及び細胞-細胞間相互作用のインビボでの組み合わせで複合体を再現しません。

多細胞スフェロイドの使用は^、より正確にin vivoでの細胞増殖¹のコンパクトなアーキテクチャを再現最近のアプローチであります^4。スフェロイドは、正常細胞の細胞-マトリックス相互作用を調査するために使用することができるだけでなく、転移性増殖または薬剤耐性⁴のように、腫瘍進行の特性をモデル化するために、腫瘍....

Protocol

注：すべての試薬および消耗品は、 物質一覧に記載されています。

細胞凝集により1スフェロイド生産

1. メチルセルロース溶液：100ミリグラム/ mLのメチルセルロースの100ミリリットルを準備します。
   1. 熱50mLの超純H ₂ Oに80℃です。 10 gでメチルセルロース粉末を追加し、粒子が均一に分散するまで攪拌します。
   2. 冷たい超純H ₂ Oで最終体積に持参し、溶液が透明になるまで4℃で撹拌し、淡黄色、そして目に見える固形物が含まれていません。
   3. 未溶解の固体を除去し、0.45μmのフィルターを通過します。調製した溶液を等分し、最長12ヶ月間4℃で保存することができます。
      注：メチルセルロースは、細胞 - 細胞接着を増強し、接着細胞単層の形成を阻止するために、非細胞毒性、不活性、懸濁剤として作用します。メチルセルロースは、水溶性であり、spher次洗い流すことができますOID世代。
2. スフェロイド形成培地
   注：使用直前にスフェロイド形成培地を準備します。保管しないでください。
   1. 適切な培養培地中で1~5 mg / mlでのメチルセルロース溶液を希釈します。
   2. 殺菌および未溶解固形....

Results

我々は、細胞撥プレートとMCを補充したスフェロイド形成媒体を使用して個別のスフェロイドを生成するための柔軟で効率的な方法を説明します。 MCおよび血清の適切な条件の下では、個々の細胞が落ち着くとウェル底への最小限の遵守とスフェロイドを形成するために、ウェルの中央で一緒に接着します。このプロトコルを使用して、スフェロイドは、細胞株の様々な（ 図2B）から生成されました。 MCおよび血清濃度の滴定は、単一のスフェロイドの断片化することなく、操作を可能にするのに十分に頑強であるが形成される最適な条件を同定するために、各細胞株のために必要とされます。最適には、スフェロイドは、直径200〜500ミクロンの間であった、と最小限の細胞破片と緊密に付着細胞から成っていました。スフェロイドは、彼らが収集され、多種多様なアッセイで使用することができるように、損傷を与えることなく、穏やかな処理を生き延びました。

図3A）によって損なわれる可能性があります。.......

Discussion

私たちは、安価で広く入手可能な試薬を用いたin vivo組織のアーキテクチャをモデル化するために、3Dスフェロイドを生産するための迅速かつ柔軟な方法を提示します。我々のプロトコルは、細胞凝集を媒介し、細胞単層の形成を最小限にするためにMC ^8,9の非細胞毒性および接着促進特性を利用します。動物源から単離されたタンパク質ベースのマトリックスとは異なり、MCは、不活性でない成長因子を含まず、かつ容易に残差行列が存在しない様々な用途に使用するための球状の単離を可能にすること、洗浄することによって除去されます。私たちのプロトコルは、様々な実験条件下で成長させたスフェロイドの直接比較を可能にする、均一なサイズのスフェロイドを生成するために、一貫性のある細胞数の急速な凝集を使用しています。この方法は、（複数の腫瘍関連細胞型の固定数を組み合わせることにより、インビボ腫瘍増殖にモデル化するために混合培養に適合させることができますより正確に腫瘍環境を表すために、例えば、線維芽細胞、白血.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffers
10x Phosphate buffered saline	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AM9625
カルシウム溶液	Sigma-Aldrich	21114	PBS+洗浄バッファーに使用されます。塩化カルシウムを添加してPBS+洗浄バッファーをオートクレーブしないでください
マグネシウム溶液	Sigma-Aldrich	M1028	PBS+ 洗浄バッファーに使用されます。塩化マグネシウムを添加してPBS+洗浄バッファーをオートクレーブしないでください
Name	strong>Company	カタログ番号	コメント
スフェロイド形成用
96ウェルU底細胞撥水プレート	Greiner Bio-One	650970
ダルベッコの改良型イーグルス培地	Sigma-Aldrich	D5546	SH-SY5Y、PANC-1、TPC-1細胞株の培養用
F12K 中型	サーモフィッシャーサイエンティフィック	2112722	TT細胞株の培養用
ウシ胎児血清	Sigma-Aldrich	F1051	フィルター 使用前に微粒子汚染物質を除去するために
メチルセルロー	スSigma-Aldrich	M7027	で100 mg/mLに調製
ロズウェルパーク記念研究所 培地	Sigma-Aldrich	R8758	HCT-116、BxPC-3細胞株の培養用
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissociation buffer
Name	Company	カタログ番号	コメント
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3.1 mg/mL;使用中は氷上で保持します
DMEMフェノールレッドフリー低グルコース	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11054-20	Phenol Redサプリメント培地と比較してバックグラウンド蛍光が少ない
グリア細胞株由来神経栄養因子	Peprotech	450-10	化学誘引剤
名前	会社	>カタログ番号	コメント
For Immunofluorescence Microscopy
#1.5 Coverglass	Electron Microscopy Sciences	72225-01	切除されたスフェロイドの取り付け用
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	アクチンを1:200で染色するために使用
ウシ血清アルブミン	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	BSAブロッキングバッファーに使用
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	退色防止
グリセロール	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	MOWIOL封入剤に使用
ImageJ Software	Freeware, NIH	-	画像解析に使用
Microslides	VWR International	48312-024	切除されたスフェロイドの取り付け用
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	MOWIOLの取り付け媒体に使用
パラホルムアルデヒド	EMD-Millipore	PX0055-3	固定バッファーに使用
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	透過化バッファーに使用