方法論記事

動力学的成長試験のための温度、光およびpHモニタリングを有するベンチスケール藻類光合成バイオリアクターの構築およびセットアップ

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DOI：

10.3791/55545

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2017年6月14日

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1Department of Civil, Construction, and Environmental Engineering, North Carolina State University, 2Department of Plant and Microbial Biology, North Carolina State University

この記事について

サマリー

本稿では、他の方法と組み合わせて、適切な動態パラメータを推定するために使用できるベンチスケールの光合成バイオリアクターの組み立てプロセスと操作について説明します。このシステムは、センサー、データ収集および制御ユニット、およびオープンソースのデータ収集ソフトウェアを使用してpH、光および温度を連続的に監視します。

要約

微細藻類栽培のための光合成バイオリアクター（PBR）の最適な設計および操作は、微細藻類ベースのバイオ燃料生産の環境および経済的性能を改善するために不可欠である。異なる条件下で微細藻類の成長を推定するモデルは、PBRの設計と操作を最適化するのに役立ちます。効果的であるために、これらのモデルで使用される成長パラメータは正確に決定されなければならない。藻類の増殖実験は、培養環境の動的性質によって制限されることが多く、動力学的パラメーターを正確に決定するためには制御システムが必要である。制御されたバッチ実験を設定するための最初のステップは、生データの収集とモニタリングです。このプロトコルは、微小藻類増殖実験の実施に使用できるベンチスケールの光合成バイオリアクターの組み立ておよび操作のためのプロセスを概説している。このプロトコルでは、アクリル製の平板型、ベンチスケールのPBRのサイズおよび組み立て方法を説明します。また、設定方法についても詳しく説明していますデータ取得および制御ユニット、アナログセンサー、およびオープンソースのデータ収集ソフトウェアを使用して、pH、光、および温度を連続的に監視するPBRを提供します。

概要

地球規模の気候変動と有限の化石燃料資源への懸念が高まるにつれて、政府は化石燃料消費を削減し、新しい持続可能な輸送燃料の開発を促進する政策を策定している。米国環境保護庁（EPA）は、再生可能燃料規格（RFS）を策定しました。これは、米国輸送用燃料の年間混合物140億ガロンのうち36％が2022年までに再生可能な燃料源から得られることを要求しています。これらを満たすためには、将来の再生可能エネルギー基準1 。

微細藻類に基づくバイオ燃料の使用は、温室効果ガス排出量を削減しながら国内のRFSを満たすのに役立つ可能性を秘めている2 。 Microalgaeベースのバイオ燃料は、トウモロコシや大豆などの陸生食品作物に基づく第一世代のバイオ燃料に比べ、いくつかの利点があります。第一世代バイオ燃料とは異なり、藻類-b藻類は海水や排水を利用して年間を通じて耕作でき、不毛な土地で耕作することができるため、陸上、水、食糧関連の資源をほとんど消費しません。微細藻類は陸生作物と比較して高い成長率を有し、高レベルの脂質を蓄積する可能性があり、容易にバイオディーゼル3に変換することができる。現在、藻類の栽培、脂質分離、およびバイオディーゼルへの脂質精製からなる、エネルギー集約的な生産プロセスの高いコストのために、工業スケールの藻類 - バイオ燃料植物は存在しない。これらのプロセスをより効率的かつ持続可能にするためには、より多くの研究が必要です。

人工環境で光合成微生物を生産するための光学的に透明なPBRは、最も有望な栽培方法の1つと考えられている3 。しかし、現在の設計では、藻類からバイオ燃料への生産プロセスを行うために必要な容積生産性が依然として不十分であるより効率的かつ経済的に魅力的な4 。光の照射と減衰、栄養素とCO 2の輸送、微細藻類の成長を考慮する強力な数学モデルは、PBRの設計と操作の最適化を大幅に促進します。これらの最適化モデルの種特異的増殖パラメータを決定するためには、ベンチ規模の増殖実験が必要である。

運動学的試験は、意図しない増殖阻害剤を防ぐために、実験装置の注意深い監視および制御を必要とする。藻類の光合成特性（ すなわち、 CO 2の消費と光の吸収）を考慮すると、制御された条件を維持することはベンチスケールのPBRにおいて特に困難である。 式1に示すように、成長培地中の溶存CO 2の量は、一般にfigure-introduction-1 （ 方程式2 ）は、少なくとも、a1）CO 2分圧および溶液中に溶解するガスの量を決定するヘンリー平衡定数（ 式3 ）。 2）炭酸イオンおよびpHの種生成および活性に影響を及ぼす増殖培地の初期化学組成（ 式4および5 ）。 3） 式3-5 5に影響を与える温度 。

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炭素の様々な段階および化学種別は、PBR内の一貫した溶存炭素濃度を測定および維持するための課題を生じさせる（ 例えば、藻類がCO 2を消費するにつれてpHが上昇し、溶解したCO 2基質を増加させると、成長を阻害する酸性環境につながる可能性がある） 6 。

藻類動態試験中の条件を制御するための追加の複雑さの層は、PBR内の光強度を含む。 PBR内の平均光強度は、入射光強度だけでなく、設計（ 例えば、材料、形状、深さ、混合）、藻類バイオマス成分（特にクロロフィル）の吸光度、藻類細胞の散乱特性を改善する。藻類が成長するにつれて、平均光度は減少する。このような光強度の変化は、全細胞およびバイオマスの増加、細胞あたりのクロロフィル含量の増加、またはその両方によって増加するかどうかにかかわらず、最終的にはクロロフィル生産の増加1細胞あたりの量、または炭水化物および脂質貯蔵物のエネルギー使用7 。原子炉内から光強度を連続的に監視することは、貴重な情報を提供する。このデータは、条件が特定の範囲内にあることを確実にするのに役立ち、他の測定値（バイオマス、クロロフィル濃度、反応器深さ、入射光など ）と組み合わされた場合、藻類増殖および吸光度パラメーターの推定に役立ちます。

特定の条件下で藻類がどのように増殖するかを理解するためには、pH、溶存CO 2 、光強度および温度をベンチスケールの動力学実験でモニターする必要がある。多くの藻類の生育設定は、動態モデルを較正するのに必要な程度まで条件を監視するために装備されておらず、モデリングプロセスは非常に困難です8 。多くの企業がベンチスケールのPBRを自動化および制御で提供していますが、ベンチスケールセットアップは非常に高価（〜20,000ドル）になる可能性があり、特定の研究課題の実験的な考慮事項すべてに対応できない可能性があります。

バッチ実験のためのコントロールフィードバックシステムを構築するための最初のステップは、ライブデータ取得です。本書では、連続光、pHおよび温度モニタリングを備えたベンチスケールのPBRを構築および設定する方法を示すことを目的としています。このリアルタイムのモニタリング設定は、実験者の裁量で、実験条件が所望の範囲内に留まることを確実にするのに役立つ。このプロトコルでは特定の制御メカニズムは詳しく説明されていませんが、これらのステップバイステップの手順は、より高度な制御フィードバックを実装する前に必要なデータ集録フレームワークの基礎を提供します。

プロトコル

1.ベンチスケールのPBRボディとリッドを構築する

注：説明の目的で、 Dunaliella sp。 、細胞壁を欠く約10μmの耐熱性微小藻類を、このPBRの構築のためのモデル生物として使用した。

  1. 研究ニーズに必要なPBR量を決定する。
    1. このPBRの実験目的を決定する。
    2. アッセイに必要な量を含む、藻類測定アッセイ（ M ）が藻類種の成長を特徴付けるのに必要であるかどうかを決定する;技術的複製の数n ;サンプリング周波数f ;実験の継続時間、 t 。
      注：プロジェクト特有の研究課題、藻類種、利用可能な機器は、測定された藻類の特性、これらの測定に使用された方法、およびこれらの測定がどれくらい頻繁に行われるかを決定する。バイオマス;細胞数;合計葉緑素色素、タンパク質、脂質、炭水化物、および外部硝酸塩濃度測定は、成長を評価する一般的な方法であり、5〜14日間の毎日のサンプリングは、増殖試験9,10についての一般的なアプローチである。
    3. 式6を用いて、1回の実験を通してサンプリングに必要な総培養体積V sを計算する 。
      figure-protocol-1
    4. 式（7）を用いて、ステップ1.1.3からのV sと最大体積除去率Fを用いて、目標PBR体積V pを推定する。
      figure-protocol-2
      注記：PBR内の条件（混合パワー、光分布など ）を確実にするためには、全培養量（ 例えば 20％以下）培養容積が除去されるにつれて、実験の過程にわたって変化する。
      1. バイオマスが10日間の実験であると仮定すると、細胞数;タンパク質、脂質、炭水化物、および硝酸塩の総濃度を毎日3回測定し、合計サンプリング容量約600mLを使用する。全培養容積の18.75％以下を除去することを目的とする場合は、少なくとも3.2Lの全作業槽容積を使用する。
  2. PBR実験用のセンサーとアクセサリーを選択してください。
    1. 連続モニタリングに使用するpHプローブ、ライトプローブ、および温度プローブを選択します。
      注：センサーはデータ取得ユニットと互換性があり、内部の培養条件（pH範囲、光、熱、藻類の破片、塩など ）に耐えなければなりません。ここでは、 Dunaliella sp。海洋微小藻類である。
    2. exを満たすインペラーの設計とモーターを選択する周囲の混合要件。
      注：例えば、低せん断の軸方向羽根車は、細胞壁がなく容易に剪断することができるため、 Dunaliella藻類にとっては良い選択です。これらの藻類は鞭毛の移動を有し、強い混合を必要としない11 。低い混合速度は、12 Vのミニギアモータを使用して達成することができます。インペラとシャフトは3D印刷できます（3D印刷情報は材料リストにあります）。
  3. PBR本体とふたを組み立てます。
    1. ステップ1.1の体積計算に基づいて、実験目的および潜在的な制約（ 例えば、空間）を念頭に置いて、反応炉の寸法を決定する。
      注：この形状はPBR全体の光減衰を最小限に抑え、実験を通してより一貫した光分布を提供するので、より低い表面対体積比を有するPBR設計が好ましい。
    2. 光学的に透明なキャストの5つの部分をカットステップ1.3.1で確立されたPBR設計およびサイズに従って、テーブルソーを用いてアクリルシート（厚さ約0.25〜0.5インチ）を形成する。
    3. 200~400グリットのサンドペーパーを使用して、ジョイントの端が滑らかにされているが、丸められていないことを確認します。
    4. テープやクランプと一緒にアクリル部分の端を固定します。
      注：アクリルセメントは接着剤ではありません。アクリル結合面が粗い場合、またはアクリル片が均一に整列しない場合、この結合セメントは有効ではない。
    5. 換気の良い場所で、針ディスペンサーを使用して関節に沿ってアクリルセメントを塗布する。プラスチックの表面はすぐに一緒に付着します。ピースを24時間放置する。
      警告：アクリルセメントを使用するときは、マスクや手袋を着用して、吸入や皮膚に触れないようにしてください。
    6. PBRが水密であることを確認するために、粘性アクリルセメントをジョイントに塗布します。セメントの指示に従ってセメントを24〜48時間乾燥させておいてください。乾燥時間は変化し得る。
    7. 記入してください目に見える漏れを確認するために水を入れてください。漏れがない場合は、リアクタをペーパータオルに置き、24-36時間後に漏れの兆候がないか再確認してください。
      注：〜2 Lを超えるPBRを組み立てるには、厚さ0.5インチ以上のアクリルシートを使用する必要があります。薄いシートは水圧下で撓んでリークを起こすことがあります。ガスケットおよび再強化ネジは、アクリルセメントのより堅牢な代替物として使用できます（ 図1 ）。このタイプの組み立てには精密機械が必要であり、アクリルは容易に割れるので、非常に慎重に行う必要があります。
    8. PBRリッドの設計には機械工場を使用し、センサやその他のPBRアクセサリやニーズ（インペラ、ガスライン、サンプリングポートなど ）を収容するポートを備えています。内部コンポーネントが相互に干渉しないようにしてください。
      注記：PBRおよびPBRリッドの構成/設計は、リアクターの付属品および実験の目的に依存します。 図1を参照PBRリアクタとリッドの設計例（詳細は材料のセクションを参照してください）。このPBR設計は、プロトコルの残りの部分について参照されます。

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図1：センサとミキサを備えたカスタマイズされたベンチスケールのPBRセットアップのイメージこの設定では、ミキサー、蓋のねじ穴を通して蓋に固定された電極、特別に設計された蓋に取り付けられた光センサーが示されています。この蓋のデザインには、12 V DCミニギアモーターの取り付けも含まれています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

2.データ集録/制御ユニットによるセンサーのセットアップと構成

注：センサは、物理的な世界を測定可能なアナログ信号、しばしば電圧に変換します。データ収集ユニットは、デジタル世界と物理世界との間のインターフェイスとして機能し、これらのアナログ信号を読み取り、それらをコンピュータによって指示された離散値に変換するために使用することができる。ここで説明するデータ取得ユニットは、16ビットのアナログ入力分解能を持ち、最大14のアナログ信号（±10V）を読み取ることができ、一部のセンサー（最大5V）に必要な電力を供給することができます。これらの手順では、アナログ信号をPBR内の光、pH、および温度のより意味のある値に変換するために、このデータ集録/制御ユニットを設定する方法の概要を示します。これらの指示には、これらの測定値を完全に解釈し、不確かさを定量化するために必要な重要な概念（ すなわち 、量子化、精度、応答時間など ）は詳しく述べられていません。

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図2：センサ - データ収集/制御ユニット接続図この図は、pH、光、および温度センサーをこのプロトコルに使用されるデータ収集および制御ユニットに設定する方法を示しています。 pHおよび光センサーの信号処理コンポーネントが示されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

  1. ローパスフィルタを使用してデータ取得/制御ユニットで光センサをセットアップして設定します。
    注記：一般的な参考図については、 図2を参照してください。メーカーのセンサ仕様は、信号線、電源線、およびアース線の色による違いを示します。ローパスフィルタは、電気信号から不要なノイズを除去するために抵抗とコンデンサを使用する単純な回路です。このタイプのフィルタは、より高い周波数の電気信号を減衰させますnは抵抗と容量によって決まるカットオフ周波数です。このフィルタは、センサ信号から電気ノイズを除去または平滑化するのに役立ちます。
    1. ワイヤーストリッパーを使用して、〜2インチの緑のコネクターワイヤーを切断します。片方の端部を絶縁して0.25インチ、他方の端部から約0.5インチを取り除く。
    2. 光センサーのアナログ信号出力線を識別します。少なくとも0.25~0.50インチの金属線が電線の絶縁部を越えて露出していることを確認してください。
    3. 1000Ω抵抗の片方の脚部をコネクタワイヤの約0.5インチの剥いた端に注意して包んでください。光センサーのアナログ信号線の露出部分の周りに抵抗のもう一方の脚を包みます。
    4. 抵抗器の脚をワイヤにはんだ付けするには、はんだ付け用の鉛フリーはんだを使用してください。はんだを2〜5分間冷却させます。
      警告：はんだとはんだごては非常に高温になり、ユーザーが適切な訓練を受けていないと非常に危険です。教育ビデオはオンラインで見つけることができます。安全眼鏡などの予防措置は非常に重要です。このプロセス中に電線を電源装置または他の装置に接続しないでください。
    5. コネクタワイヤの一方の端に約1.5インチの熱収縮チューブを差し込み、はんだ付けされたワイヤと抵抗を覆うまでピースをスライドさせます。すべての金属部分が完全に覆われていることを確認してください。
    6. ヒートガンを使用して熱収縮させる。チューブが抵抗とワイヤの周りをしっかりと包み込むようにしてください。露出した裸線はない。
    7. ドライバーを使用して、光センサーのアース線をデータ集録/制御ユニットのグラウンド（GND）端子に接続します。
    8. ドライバーを使用して、シグナルコネクタワイヤの自由端をフリーアナログ入力（AIN）端子に固定します。
    9. ステップ2.1.8と同じAIN端子と負のリード（ つまり短い方のレッグ）に、ステップ2.1.7と同じGND端子に1,000μFコンデンサの正のリード線（ つまり長い方のレッグ）を固定します。コンデンサの脚と電線の両方が端子にしっかりと接続されていることを確認してください。
    10. 光センサーの電源入力線を特定し、この電線をデータ集録/制御ユニットの電圧源（VS）端子に固定します。
  2. ユニティゲインアンプとローパスフィルタを使用してデータ収集ユニットでpH電極を設定して設定します。
    注：pH測定の性質（ すなわち 、高インピーダンスおよび低電圧）のために、pHプローブとデータ収集装置との間に単一利得増幅バッファがしばしば必要とされる。ローパスフィルタは周囲の電気ノイズから信号を保護するためにpHを測定するのにも有益です。
    1. トランスミッタワイヤを使用してユニティゲインアンプをpHプローブに接続します。
    2. 正と負のポート端子を持つ同軸アダプタをユニティゲインアンプの他端に接続します。
    3. 緑色の6インチのピースを2枚とピペットを1枚カットしますワイヤーストリッパーを使用して黒色コネクターワイヤーを切断します。黒いコネクターワイヤーの両端から約0.25インチの絶縁材を剥がします。
    4. ワイヤーストリッパーを使用して、緑色のコネクターワイヤーの端部から約0.25インチおよび約0.5インチの絶縁材を剥がします。
    5. 1つの緑色のコネクタワイヤの約0.5インチの剥がれた部分の周りに、1000Ω抵抗の1脚を慎重に包んでください。もう一方の緑色のコネクタワイヤの約0.5インチの剥ぎ取られた部分の周りに、他の抵抗器の脚部を包みます。
    6. 抵抗器の脚をワイヤにはんだ付けするには、はんだ付け用の鉛フリーはんだを使用してください。はんだを2〜5分間冷却させます。
    7. コネクタワイヤの一方の端に約1.5インチの熱収縮チューブを差し込み、はんだ付けされたワイヤと抵抗を覆うまでピースをスライドさせます。すべての金属部分が完全に覆われていることを確認してください。
    8. ヒートガンを使用して熱収縮させる。プラスチックが抵抗とワイヤの周りをしっかりと包み込むようにしてください。露出した裸線はない。
    9. 黒いcの一端を固定する（黒）の端子ポストに接続します。このワイヤのもう一方の端をデータ集録/制御ユニットのGND端子に差し込み、ドライバを使用して固定します。
    10. 緑色のコネクタワイヤの一端（抵抗器を直列に接続）を同軸アダプタの正の（赤色の）端子ポストに固定します。このコネクタワイヤのもう一方の端を、データ集録/制御ユニットの空いているAIN端子に挿入します。
    11. 1000μFコンデンサの正のリード線（ つまり長い方の端子）を識別し、このリードをステップ2.2.9と同じAIN端子に固定します。コンデンサの脚と信号線の両方が端子に確実に接続されていることを確認してください。
    12. ステップ2.2.8と同じGND端子に、1,000μFコンデンサの負のリード（短い方のレッグ）を固定します。
  3. 信号、グランド、および電源を接続して、温度センサーをデータ集録および制御ユニットに接続します。AIN、GND、およびVS端子を解放するためにプローブの両端に接続します。

3.ライブデータの取得と実験ファイルの設定

注記：ここで説明するデータ収集および制御ソフトウェアは、データ取得および制御ユニットと通信して、ユーザ指定の時間間隔でセンサデータをモニタおよびロギングします。以下の手順では、このソフトウェアでpH、温度、および光を監視および記録するための制御ファイルを設定する方法について説明します。これらの手順は、資料セクションに記載されているソフトウェアとデータ集録および制御装置に固有のものです。詳しい説明は、製品のユーザーマニュアルに記載されています。

  1. USBケーブルを使用して実験装置の近くのコンピュータにデータ集録/制御装置を接続し、必要なすべてのドライバをダウンロードします。
  2. データ集録および制御ソフトウェアをダウンロードして開きます。
  3. ソフトウェアの各センサーに「コンバージョン」を設定します。
    注：物理的なボルトを変換するには年齢信号を意味のある値に変換するには、較正によって確立された変換係数を適用する必要があります。多くのセンサーには、製品固有の仕様書に記載されている工場較正ファクターが付属しています。変換式は、セットアップとセンサーに固有のものです。多くの変換式パラメータ、特に電極用のパラメータは、較正によって定期的に更新する必要があります。センサの寿命と校正頻度は、製品固有の仕様と作業環境に依存します。
    注記：ユーザーはこれらの仕様を完全に読んで理解する必要があります。 表1は、材料リストにあるセンサの変換を示しています。温度プローブの変換例を以下に示します。
    1. メインのホームページの右側にあるソフトウェアワークスペースの「コンバージョン」に移動します。
    2. 「volts_to_celsius」などのコンバージョン名を追加し、変換式を入力します（55.56 x 値）+ 255.37-273.15。
チャネル名 コンバージョン名 式 ノート
温度 volts_to_celsius （55.56×値）+ 255.37-273.15 ボルトを摂氏に変換するメーカー変換式。
光 volts_to_PPFD 値x 500 電圧を光合成光子束密度（μmolm -2 s -1 ）に変換するメーカーの変換係数、メーカーのLED補正は適用されません。
pH volts_to_pH （-17.05×値）+ 6.93 pH電極の電圧値をpH値に変換するための校正依存変換式（図4b）。 pHチャネルにのみ変換を適用する較正を行う。

表1：データ取得ファイルのチャネル変換テーブルセンサーのチャネル情報と変換情報をデータ収集ソフトウェアに入力する方法の例。

  1. センサーデータを取得するには、ソフトウェア内の各センサーに適切なチャネルを設定します。
    注記：各センサーには、ソフトウェア内の独自のアナログ - デジタルチャネルと、データ集録/制御ユニット内の指定アナログ入力端子が必要です。
    1. ソフトウェア内の「チャンネル」ページに移動します。
    2. センサーチャネル名を追加します。スペース文字は使用できません。
    3. 適切なデバイスを選択して、対応するチャネルのデータを収集します。このデバイスはデータ取得デバイスに対応します。
    4. データ取得・制御ユニット等を参照するための機器番号を入力してくださいデータ取得装置。 1つのユニットしか使用されていない場合、デフォルトの数はゼロであることが多い。
    5. 入出力タイプ（「I / Oタイプ」）のアナログ - デジタル「A〜D」を選択し、データ取得制御ユニットのAIN端子番号に対応するチャネル番号を入力します
    6. 希望のサンプリング「タイミング」を入力します。この値は、センサー信号が読み取られる頻度を示します。 1.0を入力して、1秒ごとに読み取り値を取得します。ロギングの前に1分間隔でデータを平均化するには、「平均」ボックスをチェックし、平均化の長さを60と指定します。
    7. 該当する場合は、ドロップダウンメニューから適切なコンバージョンを選択します（コンバージョンを生成するには、ステップ3.3を参照）。そうしないと、すべてのチャンネルデータが電圧として表示/記録されます。
  2. 実験データを記録するために "Logging Set"を設定してください。
    1. ソフトウェアワークスペース内の「Logging Panel」に移動し、ew logging setを実行し、それに応じて名前を付けます。出力ファイルの種類と場所を選択します。拡張子 '.csv'が出力ファイル名で指定されている場合、ASCIIファイルタイプはコンマ区切りの値ファイルを提供します。
    2. このセットにログするために必要なすべてのチャネルを追加してください。
    3. ワークスペースのロギング・シーケンスを右クリックし、適切なオプションを選択して、必要に応じてロギングを開始および停止します。
      注記：データを積極的に記録するときは、ファイルにアクセスしないでください。この操作により、ロギングプロセスが中断される可能性があります。継続的に記録されたファイルのファイルの場所は、クラウドディレクトリに保存または書き込まないでください。
  3. 「ページ」を設定して、データとグラフを表示します。
    1. ソフトウェアワークスペース内の「ページ」ディスプレイに移動します。デフォルトの空白ページのいずれかをクリックします。
    2. ページ上に数値的に読み取ったセンサー出力を表示するには、ページに「変数値」表示を追加します。
      1. リグ空白ページ内の任意の場所をクリックし、[表示]を選択し、[変数値]オプションをクリックします。小さなボックスが画面に表示されます。
      2. この新しく作成されたボックスを右クリックし、[プロパティ]を選択します。ディスプレイのキャプション（例えば、「Temperature in Reactor」）、チャネル参照（「Temperature [0]」など）、および関連する単位（「摂氏」など）を入力します。 「OK」をクリックし、表示ページに戻ります。
    3. センサデータをグラフィカルにリアルタイムで表示するには、2Dグラフを表示ページに追加します。
      1. 空白ページ内の任意の場所を右クリックし、[グラフ]を選択してから[2次元グラフ]を選択します。小さなプロットが画面に表示されます。
      2. 新しく作成したグラフを右クリックし、[プロパティ]を選択します。 "Traces"タブ内で、 "Y Expression："のボックスに希望のセンサーチャンネル名（たとえば "Temperature"）を入力し、 "Time"がwritteであることを確認します"X Expression："のボックスにnを入力します。 「OK」をクリックし、表示ページに戻ります。

4. pHプローブの校正

注：pHキャリブレーションは、実験の前に実験の目的の温度で行う必要があり、それに応じてpHチャネル変換を更新する必要があります。 pH電極の測定値は実験中に変動することがあります。このドリフトの程度を判定するために、実験セットアップを実行した後に較正プロセスを繰り返し、測定値を比較する。 pH電極は、製造者の指示に従って、実験の前後に適切な保存溶液に適切に保存しなければならない。

  1. ステップ2の説明に従って、pHセンサーと温度センサーを接続します。
  2. pH電極と温度プローブの両方をpH校正バッファー7に挿入します。
  3. プローブの温度が所望の温度になっていることを確認するために、グラフィックディスプレイを確認してください実験を実行する（ステップ3.6.2.2）。
  4. pH電極の電圧出力が安定するようにします（ つまり、電圧の読み値はもう一方向に変化しません）。安定化を確認するには、グラフィック表示を使用してください。
  5. 温度とpHの電気的データを30秒〜60秒間ファイルに記録する（ステップ3.5）。このプロセス中、pHチャネルにはいかなる変換も適用してはいけません。
    注：pH電極は電気的ノイズに敏感であるため、pHチャネルのサンプリングタイミングが遅い方が望ましい場合があります（ たとえば、 「タイミング」= 0.1秒）。タイミングが遅くなると、より多くの計算リソースが必要になることに注意してください。
  6. バッファー4と10について較正を繰り返します。センサーの応答が-57〜-59 mV / pHの間であることを確認します（ 図3a ）。
  7. pHバッファー値と電圧をプロットし、ラインをフィッティングすることにより変換式を生成する（ 図3b >）。手順3.3で説明した変換式を更新します。
  8. この変換をpHチャネルに適用し、チャネル設定を更新して、ロギングに必要な平均化を含めます。

5.藻類実験のためのPBRを設定する

注：以下の手順は、 図1に示すDunaliellaとカスタムメイドのPBRに固有です。さらに、このシステムはこのように設計されていないので、これらの設定指示は無菌プロトコルには従わない。

  1. 実験および実験目的に必要に応じて、藻類接種物および増殖培地を調製する。
  2. ステップ2.2-2.3で説明したように、pHおよび温度ワイヤをデータ収集および制御ユニットに接続します。
  3. 手順3.3および4で説明したように、 pHチャネルの変換式を較正し、更新します。

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図4：ミキサーの配線図この図は、ミニギアモーター、電源、3Dプリントされたインペラーとシャフトを使用してPBRのミキシングデバイスを設定する方法を示しています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

  1. 付属品とセンサーを備えた温度制御インキュベーター内にPBRを設置します。視覚化については、 図4を参照してください。
    1. リッドポートに光センサーワイヤーを通し、付属のネジを使用してセンサーヘッドをリッド延長マウントに取り付けて、光センサーをPBR内に設置します。このポートを大気に近づけないように、ラバーストッパーまたはグロメットを使用してください。
    2. インペラーシャフトをDCミニギアモーターの上に置き、ミキサーインペラーをPBR蓋に取り付けて固定しますPBR蓋の内側のシャフト。シャフトを止めねじと六角レンチで固定します。
    3. 藻類特異的増殖培地を添加し、蓋をし、蓋をねじで固定する。インキュベーター内にPBRを置きます（25℃または希望の温度に設定）。
    4. 温度プローブを指定のポートに挿入し、ラバーストッパーを使用してポートに固定します。
    5. pHプローブをPG-13.5ネジ式マウントを使用してリアクターのリッドポートに固定します。
    6. 手順2.1で説明したように、光センサーワイヤーをデータ収集ユニットに接続します。
  2. ミキサー羽根車に所望の速度で動力を供給します。
    1. 設定に隣接して可変直流電源を設定します。電源装置の電源を入れ、電圧値が0ボルトになるまで電圧ノブを調整します。電源を切ります。
    2. インペラモーターの電源ラインを可変電源の正および負の出力端子に接続します（ 図5 ）。
      警告：活線または回路を接続または触れないでください。ワイヤを接続する前に、すべての電源がオフになっていることを確認してください。モータ、電源、ワイヤ間の互換性を保証するため、製造元の指示書/仕様書を必ずお読みください。
    3. 電源を入れ、電圧ノブを回して所望の混合速度に達するまでゆっくりと電圧を上げます。 1分間当たりの回転数を測定することによって混合速度を計算する。

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図5：リアクタ実験設定図温度制御インキュベーター内のPBR実験装置の可視化。この設定には、成長ランプとPBRが含まれ、センサーとPBRのふたの中に固定されたミキサーがあります。 ここをクリックしてくださいこの図のより大きなバージョンを見る。

  1. 成長ランプを設定してPBRを照らします。
    注：このDunaliella特定の研究に必要な光合成光強度レベルを達成するために、青色および赤色スペクトルで発光する高出力LED成長ランプを選択した。照明器具のサイズと形状は、光がPBRの入射面を均一に照らすように選択する必要があります。保育器が内部の熱源を処理できることを確認します。そうしないと、インキュベーターの寿命を短くしたり、インキュベーター内の損傷や過度の加熱を引き起こす可能性があります。
    1. PBRの前面に沿ってランプの中心を合わせます。光路がリアクタの背面に取り付けられた光センサに向いていることを確認してください。
    2. 光をオンにし、必要に応じて成長ランプを反応炉に向けてまたは反応炉から直接移動させることによって、光度を調節する。センサーの可変ディスプレイにライトが点灯していることを確認してください読書。
  2. PBR内の光、温度、およびpHの測定値が安定しており、必要な範囲内にあることを確認するために、センサーデータを6〜24時間モニタリングして記録します。必要に応じて調整します。
    注記：電気ノイズは、バウンス、不安定な読み取り、および/または突然の値の変化によって、PBR環境が明らかに変化することなく、しばしば観察されます。
  3. サンプリングピペットのラバーストッパーを外し、藻類接種物を移送ピペットで加えます。
  4. サンプルを取り出して、実験が望む範囲内に収まるように条件を監視する。
    1. 必要に応じて、ピペットを使用してサンプリングポートから分析のため培養物を除去する。
      注：サンプル量、頻度および実験期間は、ステップ1.1.2に依存します。
    2. ソフトウェアのデータ表示をチェックし、インキュベーターの空気温度を手動で調整して水の温度を維持することにより、PBR内の水温をモニターするR定数。
      注：この調整はインキュベーターの製造元の指示に依存します。
    3. 必要に応じてPBR内のpHを監視して調整し、pHが実験の予想範囲内に収まるようにします。
      注記：ここでは、pHは、圧縮されたCO 2タンク（99.99％）に合わせて12 Vソレノイドバルブ（通常閉）で制御されています。必要に応じて、データ取得および制御ユニットおよびソフトウェアの制御機能を使用してバルブを開けた。このセットアップではアクセサリリレーボードとDCモジュールが必要で、特定の研究目標に合わせたカスタムコンピュータプログラミングを使用して実装されました。

結果

このリアルタイムモニタリングシステムのデータは、ベンチスケールのPBR内で藻類の動的培養環境を示し、システムの監視と制御の必要性を強調しています。記録された温度データ（ 図6 ）は、藻類の生育に伴う光照射、インキュベーターの空気温度、エネルギー散逸がPBR内の温度をどのように変化させるか、リアルタイムデータをインキュベーターの温度制御を調整するために使用する方法を示しています。

実験の過程で測定された光は、この成長する環境の動的性質をさらに強調する。 図7で観察されるように、光合成光子束密度（PPFD;μE-m -2 s -1 ）として測定された光センサーの読み取り値は、藻類が添加されてすぐに85 PPFDに落ちる前に約100 PPFDであった反応器に藻類培養物を接種する。光は、7日目に5PPFD未満に低下し続けた。この光度の減少は、バイオマスおよび細胞数の増加、および/またはクロロフィル含有量の増加による吸収の増加によるものであり、藻類は7日目まで活性が低い光レベル。さらなる推論を行うには、追加の生物学的測定が必要である。

連続的に記録されたpHデータは、全体として、実施されたpH制御アルゴリズム（ 図8 ）を用いてこの実験中にpHが適切に制御されたことを示している。このデータは、分ごとの示度と1時間の平均値を示しており、藻類の培養とリアルタイムでのpHのモニタリングに関する重要なポイントを示しています。最初に、PBRに藻類を接種した直後に、pHを所望の設定値7.6を上回って上昇させた。この変化は、PBRに添加された培養種子が、H値は、接種材料を増殖させるために使用されたフラスコがpH制御されていないため、設定値より高い。第2に、このライブデータは、どのように敏感なpH電極が外部電気ノイズに重大であるかを強調する。この感度は、1日目と2日目との間の電極値の急激な上昇によって示される。これらの突然のpH値の変化は、隣接する実験装置からの電磁弁からの電気的ノイズによって生じた可能性が高い。この電気的外乱は、pH制御アルゴリズムを早期に起動してCO 2をPBRに注入した。その結果、pHは所望の設定値以下に低下した。 pH電極の感度は極端な異常値をもたらし、制御システムを破壊する可能性があります。

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図3：pH応答および較正の例グラフ。 （ a ）thの応答グラフの例e pHセンサー（ b ）pHセンサーの較正グラフの例。変換に使用する式があります。回帰分析は95％の信頼区間を示す。エラーバーは表示されません（標準エラーは0.03％未満です）。これらのグラフは、pHセンサが適切に接続され、その信号が非常に安定していることを示している。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図6：7日間の実験中のPBR内の温度測定濃い青色の点はセンサーデータの1時間の平均を表し、淡い青色の点は1分（取得タイミング1秒、平均長さ60）で得られたセンサー読み取り値を表し、メーカーが提供する変換係数を使用して温度に変換します。黒い矢培養温度を25℃付近に保つようにインキュベーターの温度設定を調整したとき（この所望の設定点は赤い点線で示されている）。温度の変動は、藻類の成長およびインキュベーター温度の変化に起因する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図7：7日間の実験中にPBR内の光の測定濃い青色の点はセンサーデータの1時間の平均を表し、淡い青色の点は1分（取得タイミング1秒、平均長さ60）で取得し、デフォルトの光センサー工場較正値を使用してPPFDに変換したセンサー読み取り値を表します。">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図8：7日間の実験中のPBR内のpH測定。濃い青色の点はセンサーデータの1時間の平均を表し、淡い青色の点は1分ごとに記録されたセンサーの読み取り値（0.1秒の獲得タイミング、平均長さ600）を表し、較正によって確立された変換式を使用してpHに変換される。 99％CO 2ガス注入を用いてpHを7.6〜7.5に維持した。赤い点線は、所望のpH範囲を示す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このPBRシステムは、ベンチスケールの藻類の動力学的成長実験を監視および制御する能力を提供し、増殖を定量化するために用いられる実験的アッセイからのより反復可能な結果を​​可能にする。しかしながら、センサの測定値が反応器の状態を正確に反映することを保証するためには、センサ測定の限界と不確実性を理解することが重要です。この理解には、センサに関わる測定原理、校正のプロセスと頻度、測定の不確実性、およびセンサが測定できないものについての基本的な知識が含まれます。例えば、ここで説明した光センサの電気的応答は、可視スペクトル範囲にわたって均等に分配されず、このセンサデータがどのように分析されるかによって、特定の補正係数をセンサ出力に適用する必要があります。

温度の変化や変動も非常に重要です。センサー応答をフルエンスします。センサの読み値に影響を与える潜在的な干渉を理解することも非常に重要です。この干渉は、建物からの周囲の電気ノイズであるか、測定環境から生じる可能性があります（ 例えば、ナトリウムイオンはpH値が10を超えるとpHの読み取りに大きな影響を与える可能性があります） 12 。さらに、複数のプローブを溶液、特に高イオン伝導性の塩溶液に浸漬することも潜在的な干渉源である。 pH（またはイオン強度、溶存酸素、溶存CO 2 など ）を測定する電極は、周囲の電気ノイズに特に敏感であり、容易に摂動することができます。電極信号を保護するために使用される信号調整は、他の要因がプローブの読みを妨げないことを保証するものではありません。品質管理の一環として、ハンドヘルドpHプローブ、ハンドヘルド分光計、温度計などの他の実験装置を使用して、tセンサーの読み取り値を確認し、システムが正しくセットアップされ、正しく作動していることを確認してください。

取り組まなければならないもう1つの限界は、センサー上の藻類および/または培養環境の可能性のある影響である。例えば、藻類の破片または泡が光センサのフォトダイオードレセプタを覆う場合、測定値に影響が及ぶ。同様に、pH電極は非常に敏感で、正確な測定値を保証するために特別な注意が必要です。これらの電極は、H +イオンの蓄積による内部接合部の両端の電圧差を測定することによって機能する。正確な測定を維持するためには、プローブ内の水和バッファー層が必要です12 。反応器内の条件に依存して、この層は消耗し、プローブが沈んだ間にセンサの応答は実験の経過にわたって変化し得る。予備試験では、pH電圧出力は、20日間の実験の間に〜0.2pH単位を超えてドリフトしなかった、特にpHの微調整/定量が必要な場合には、センサ応答におけるこの変化を特徴づけ、最大の実験実行時間を確立するために、さらなる評価を実施すべきである。

藻類の成長を分析するために構築された現在のベンチスケールのPBRシステムの多くは、藻類の成長にどのような影響を与えているかを識別するために、必要に応じて内部培養環境を厳密に監視および制御していません。このプロトコルは、リアルタイムモニタリングを使用してPBRを構築するための段階的な指示を与えることにより、より制御された実験を容易にするのに役立ちます。さらに、このライブデータは、実験条件をよりよく制御するためだけでなく、潜在的に成長速度（ 例えば、一般的な成長速度の基準としての光学密度の読み）を推定するために利用することができる。

制御された実験システムは、藻類の研究をより再現性のあるものにするのに役立ちます。ベンチスケールのPBRモニタリングされ、制御されているエープルは、実験設計における意図しないアーチファクトを最小限に抑えることによって実験効率を高めることができ、藻類バイオ燃料を持続可能な代替燃料源にする努力を促進するのに役立つ。

開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

著者らは、この研究資金のために、研究とイノベーションの新興フロンティア（受賞番号1332341）を認めています。著者はまた、Andrew Grieshop博士と、LabJackとDAQFactoryのオンラインサポートコミュニティを支援し、このプロセス全体を通じて提供されている支援に感謝したいと思います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
キャストアクリルシートマクマスターカー8560K2447/8 ''厚さ、12 x 36 ''、光学的にクリア、購入したシートのサイズはリアクターの寸法によって異なります。
アクリルセメントマスターカー7517A4Scigripプラスチックパイプセメント、アクリルの #4SC 非白化。PBR組立にガスケットやネジを使用する場合は不要です。
アクリルセメントアプリケーターニードルカー75165A136セメントアプリケーターニードル、25ゲージ、1インチ、ステンレス鋼、PTFEライニング。
アクリルセメント用プラスチックディスペンシングボトルマクマスターカー7544A67プラスチックディスペンシングボトル、2オンスサイズ、5個入りパック。
粘性アクリルセメントマスターカー7515A11Scigripプラスチックパイプセメント。ミディアムボディのアクリルセメントで、PBR本体の隙間をシールします。
PG-13.5 スレッドタップMcMaster Carr2485A14pH電極を蓋に固定するために使用できます(該当する場合)。
PBRと蓋NCSU精密機械工場カラム藻類 3.2L リアクターリビジョンEこの機械工場は一般に公開されています。ショップマネージャーに連絡してください。
pHセンサーHamilton238643EasyFerm Plus 120、オートクレーブ可能、ミリボルト出力。
光センサーApogee InstrumentsSQ-225増幅 0-5 ボルト電気校正量子センサー、防水。
温度センサーLabJackEI1034ステンレス製、防水温度センサー。
BNCエンド付きpHトランスミッターワイヤーSigma-AldrichHAM355173-1EAこのワイヤーは、pHプローブの種類によって異なります。ワイヤがpHプローブと互換性があり、BNCコネクタの端があることを確認してください。
ユニティゲインプリアンプオメガエンジニアリングPHTX-21ハイインピーダンスpH測定に必要なpH電極用信号処理アンプです。
同軸アダプター、BNCメス-バインディングポストAmazonSMAKN B00NGD5K80プリアンプからマイクロコントローラーへのpH信号の接続用。
コンデンサ (1000 uF)AmazonNichicon BCBI4950ローパスフィルター用。
抵抗器(1000Ω)ラジオシャック2711321ローパスフィルター用。
フックアップワイヤーラジオシャック2781222ローパスフィルターの作成、センサーとマイコンの接続、モーターの配線に。
熱収縮チューブRadioShack2781611ローパスフィルターアセンブリ用。
データ収集・制御ユニットLabJackLabJack U6センサーからの電気信号を処理し、データ収集・制御ソフトウェアと通信します。
DAQFactoryデータ収集ソフトウェアDAQFactoryDAQFactory Express Release 5.87c Build: 2050無料でダウンロードでき、最大10チャンネルまで対応。
ミニDCギアモーターマクマスターカー6331K31ミキサーインペラ用モーター。
インペラとシャフトN/AN/A3Dファイルの著者にメールを送ります。
可変DC電源AmazonTekpower HY1803D可変DC電源、0-18V @ 0-3A。
グローランプハイドログローSOL-1このモデルはもう入手できません。
インキュベーターThermo ScientificPrecision Model 818この特定のインキュベーターは、温度設定に関係なくノンストップで作動するため、内部の熱源に耐えることができます。
マクマクマスターアクリルマク

参考文献

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