ここでは、S100A12（calgranulin C）を発現、精製する方法を紹介します。我々は、ヒト病原体H.ピロリに対するその抗菌活性を測定するためのプロトコルを記載する。
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この記事について
サマリー
要約
カルグラニュリンタンパク質は先天性免疫の重要なメディエーターであり、カルシウム結合タンパク質のEFハンドファミリーのS100クラスのメンバーである。いくつかのS100タンパク質は、遷移金属を高親和性で結合し、「栄養免疫」と呼ばれる過程において、それらを侵入する微生物病原体から効果的に隔離する能力を有する。 S100A12（EN-RAGE）は亜鉛と銅の両方に結合し、マクロファージや好中球などの生来の免疫細胞に非常に豊富に存在します。本発明者らは、S100A12の活性金属結合構成における発現、濃縮および精製のための洗練された方法を報告する。このタンパク質の細菌増殖および生存度分析における利用は、S100A12が細菌病原体であるヘリコバクター・ピロリに対して抗菌活性を有することを示している。抗菌活性は、栄養素の亜鉛をキレート化するS100A12の亜鉛結合活性を前提としており、これにより、成長およびpに亜鉛を必要とするH.pyloriが飢えているロリファーション。
概要
S100タンパク質は、機能の多様な配列を有するカルシウム結合タンパク質のEFハンドファミリーのクラスである1 。それらは組織および細胞特異的様式で発現され、広範囲の細胞機能を調節する2,3 。カルシウム結合タンパク質に特有のS100タンパク質は、細胞内および細胞外の両方の機能を発揮します4,5 。細胞内では、Ca 2+結合は、タンパク質結合パートナー6を特異的に標的とする疎水性表面を露出する構造変化を誘導する。この細胞内機構は、細胞増殖、分化およびエネルギー代謝などの重要な過程を調節する。細胞外環境では、S100タンパク質は2つの機能を示す7 。 1つは、それらは損傷関連分子パターン（DAMP）タンパク質として作用し、炎症促進性サイトカインパターン認識受容体8,9 との相互作用による免疫性免疫応答。さらに、S100タンパク質クラスのいくつかのメンバーは、栄養免疫と呼ばれる過程で微生物病原体を飢餓にさせる働きをする転移金属を封鎖する10,11 。
S100A12（カルグラヌリンCおよびEN-RAGEと....
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プロトコル
1.S100A12の発現
- コンピテントBL21 DE3細胞を、標準熱ショックプロトコール18を用いてpGEMEX-S100a12プラスミドで形質転換する。氷上の微量遠心管内で50μLの細菌に1〜5μLのプラスミドを添加する。 20分間インキュベートする。
- 細胞を42℃で30秒間熱ショックする。
- 細胞を氷上で2分間インキュベートする。
- 500μLのSOC培地を細胞に添加する。オービタルシェーカー上で250rpmで振とうしながら37℃で1時間インキュベートする。
- LB寒天培地（100μg/ mLアンピシリン添加）で150μLの形質転換反応をプレートする。 37℃で12〜16時間インキュベートする。
- 一つのコロニーを選ぶ。 LB（100μg/ mLアンピシリンを補充）2mLを接種する。
- オービタルシェーカー（300 rpm）で37℃で4〜6時間インキュベートする。 OD 600は、1〜3の吸光度単位を読み取る必要があります。
- 50μLのZYM-5052 autoinduに500μLのスターター培養液を加えます100μg/ mLのアンピシリンを補充した培地で処理した。最良の通気と最大の発現のために、250mLのバッフル付き三角フラスコを使用してください。 37℃で24時間振とう（300rpm）。
- 細菌懸....
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結果
S100A12の発現および精製
3段階の精製により、50mLの細菌培養液から約40mgの組換えS100A12を産生した。第一段階は、内因性大腸菌（E.coli）タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿であった 。この工程の後に、陰イオン交換クロマトグラフィー（ 図 1A ）を行った。タンパク質は、クーマシーブリリアントブルー（ 図1B ）で染色されたSDS-PAGEによって追跡されます。精製手順の最後のステップは、タンパク質を分子量および形状によって分離するサイズ排除クロマトグラフィー用のS100A12を含有する画分をプールすることを含んでいた（ 図2A ）。 S100A12はホモダイマー（サブユニットあたり92アミノ酸）であり、約21kDaの全分子量を有する。サイズ排除クロマトグラフィーから集.......
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ディスカッション
ヒトS100A12の発現および精製の両方のための効率的なプロトコールが提示される。 E.coli発現系は、特にmg量が生化学的および生物物理学的研究のために必要とされる場合、組換えタンパク質の製造に使用される最も一般的なツールである。ここに記載されている手順の重要な強化は、標準的なルリアブロス培地18での発現と比較して、精製タンパク質の収率をほぼ30倍増加させる自動誘導培地26の使用である。さらに、自動誘導培地は、タンパク質発現ワークフローを大幅に簡素化します。従来の増殖培地を用いて、指数増殖期の間に誘導剤を添加できるように、培養物を連続的にモニターしなければならない。自動誘導メディアを使用している場合、倍増時間を監視する必要はありません。培養物を飽和まで増殖させる。自動誘導による成長の初期段階培地上では、大腸菌はグルコースを炭素源として使用する。グルコースが枯渇すると、バクテリアはタンパク質発現を誘導する炭素源としてラクトースに切り替わります26 。自己誘導.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。
謝辞
この研究は、退役軍人事務所職業訓練賞1IK2BX001701、CTSA賞UL1TR000445、翻訳科学進歩センター、国立科学財団賞番号1547757および1400969、およびNIHグラントGM05551によって支持されました。その内容は、著者の責任であり、必ずしも移民科学振興機関または国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| S100A12 Expression< | |||
| strong>Expression cells | |||
| BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 | |
| Autoinduction medium components | |||
| Yeast | Extract Research Products International | Y20020-250.0 | |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 | |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 | |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 | |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 | |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 | |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 | |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 | |
| グリセロール | 研究製品インターナショナル | G22020-1.0 | |
| D-グルコース | 研究製品インターナショナル | G32040-500.0 | |
| ラクトース | Sigma-Aldrich | L2643 | |
| Selection agent | |||
| ampicillin | Research Products International | A40040-5.0< | |
| strong>S100A12 精製 | |||
| AKTA 開始クロマトグラフィーシステム | GE | 29-220-94 | |
| HiTrap Q セファラオス高速フロー | GE | 17-5156-01 | |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 | |
| Nanodrop lite 分光光度計 | モフィッシャーサイエンティフィック | ND-LITE | |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0< | |
| em>H. pylori Culture | |||
| 血液寒天培地 | Lab Supply Company | BBL221261 | |
| Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 | |
| コレステロール (250x) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| β-メルカプトエタノール | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| トリスベース | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 塩化亜鉛 | Sigma-Aldrich | 229997 |
参考文献
- Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354(2013).
- Chen, B., et al.
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