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方法論記事

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

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DOI：

10.3791/55586

⸱

2017年4月8日

 ,  ,  , 
1Cancer & Stem Cell Biology Programme, Duke-NUS Medical School

この記事について

サマリー

ここで説明したジェノタイピング技術、キャピラリーゲル電気泳動に結合する蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループット遺伝子型決定を可能にします。これは、他の遺伝子型判定技術が直面している制限を回避し、配列決定法よりも費用対効果の高いです。

要約

プログラマブル・ゲノム・編集ツールの開発は、特定のゲノム配列は、細胞および生物全体の機能に果たす役割を理解するための逆遺伝学の使用を容易にしました。この原因は、途方もなくCRISPR / Cas9システム - 研究者が対象で、他のもののうち、ノックアウト、するために、ゲノムやトランスクリプトームを操作ノックダウン、または遺伝子にノックすることを可能にする汎用性の高いツールの最近の導入によって助けられています方法。遺伝子をノックアウトするために、CRISPR / Cas9媒介二本鎖切断は、切れ目サイトでのヌクレオチドのフレームシフトの原因挿入または欠失を導入する非相同末端結合DNA修復経路を募集します。しかし、個々のガイドRNAは、望ましくないオフターゲット効果を引き起こす可能性があり、これらを除外するために、複数のガイドRNAの使用が必要です。ターゲットのこの多様性はまた、今度はEFの使用を頼むれ、クローンの大量スクリーニングが必要であることを意味しノックアウトクローンの遺伝子型を決定するために、ハイスループット技術をficient。現在のジェノタイピング技術のいずれかは、それゆえ、高スループットのために、彼らは不適当、固有の限界に苦しむやコスト高を招きます。ここでは、詳細テンプレートとして粗細胞溶解物からのゲノムDNAを使用する蛍光PCRを用いて、次いで、キャピラリーゲル電気泳動によりPCRフラグメントを解決するためのプロトコル。この技術は、断片間に1つの塩基対の違いを区別するのに十分に正確であり、従って、標的遺伝子のコード配列におけるフレームシフトの有無を示すに十分です。この正確な知識を効果的に確認シーケンシング工程の必要性を排除し、ユーザーがプロセスに時間とコストを節約することができます。また、この技術は、ここで他の場所に示すように、多数の遺伝子に対するガイドRNAによって標的様々な組織起源の種々の哺乳動物細胞を遺伝子型決定に汎用性であることが証明されました。

概要

逆遺伝的アプローチは、科学者たちは、細胞または生物全体のゲノム中の特定の変化の影響を解明することができました。例えば、特定の遺伝子の発現は、これは、細胞の又は上の機能に及ぼす影響を決定するために、遺伝子ノックダウン1、2（部分的還元）または遺伝子ノックアウト3、4（完全切除）によって減衰させることができます生物の発生。

遺伝子ノックアウト実験は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）などの配列特異的プログラマブルヌクレアーゼ、の導入以来、より簡単になってきました。しかし、定期的にクラスタ化されたのは比較的最近の特徴付けは短い回文構造の繰り返し（CRISPR）を散在/ Cas9システムは、世代を実行するために、世界中のすべての実験室のためのそれは非常に簡単になりましたEノックアウト実験。本質的に、CRISPR / Cas9システムは、2つの必須成分、認識し、ゲノム中の特定の配列、及びCas9呼ばれるエンドヌクレアーゼに塩基相補性を介して結合する単一ガイドRNA（sgRNA）、から成ります。ゲノムDNA上のsgRNA-Cas9複合体の特異的結合および作用の余波は、DNAの二本鎖切断です。これは、今度は、その後の非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え（HR）経路を介して修復される細胞内のDNA損傷応答機構をトリガします。 NHEJ修復メカニズム（ただしHRメカニズム）は、多くの場合、挿入/欠失（インデル）の変異が生じ、修理の現場でのヌクレオチドのランダムな挿入または削除になりますので、それがシフトするエクソンの読み枠を引き起こす可能性があります。これは、その後、翻訳とナンセンス媒介崩壊5、6の早期終了に伴う遺伝子のノックアウトをもたらすことができます7。

遺伝子ノックアウトにCRISPR / Cas9システムの導入によって得られる利便性にもかかわらず、標的細胞のクローンの遺伝子型決定は、特に、8、9の設定ハイスループットで、ボトルネックのままです。主要な固有の制限を受けるか、財政的に高価であり、いずれかの既存の技術。これらのクローンは同一の対立遺伝子を有しているので、例えば、10の二重鎖DNA中のミスマッチを検出する酵素アッセイでSURVEYORまたはT7E1アッセイは、野生型クローンおよびホモ接合変異体（対立遺伝子同一に変異させるクローン）を区別することができないので、彼らのDNA配列11に不整合が存在しません。また、高スループットの設定で、変異体クローンの遺伝子型決定におけるゴールドスタンダードと考えられているサンガー法の使用は、その高いコストのために望ましくありません。ここでは、DETを提示します他の既存の遺伝子型決定技術の制限を回避し、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループットスクリーニングを実施するのに特に有用であることができ、蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法、のailedプロトコル。このメソッドは、実行することが技術的に簡単で、時間とコストを節約できます。

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プロトコル

1. CRISPR / Cas9標的単一細胞クローンを取得

  1. 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した抗生物質を含まないダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）2mL中ウェルあたり500,000細胞で6ウェルプレートにシードHepG2細胞。 37℃で24時間、5％CO 2インキュベートします。
  2. プラスミドを、製造業者の指示に従って適切なトランスフェクション試薬を用いて目的の遺伝子に対してCas9と特定sgRNAを共発現する細胞をトランスフェクトします。
    注：以前に4記載したように例えば、sgRNAは、pSpCas9（BB）-2A-GFPベクターにクローニングすることができます。
  3. 新鮮な抗生物質を含まない培地の2mLのトランスフェクション後16時間 - 培地4を置き換えます。
  4. トランスフェクション後約48時間、細胞をトリプシン処理により単一細胞懸濁液を収集します。
    1. 0.25％トリプシンEDTAの0.2 mL中に細胞をトリプシン処理し、5分間37℃でインキュベートします。培地1mLを加え、再懸濁thoroughlY。
  5. 以前に12を説明したように、GFP陽性クローンの細胞を選別し、約3,500の細胞を集めます。
  6. プレートペニシリン/ストレプトマイシンを補充した培養培地8mlにディッシュあたり500、1,000〜2,000細胞で10cmディッシュ上のGFP陽性選別細胞。 37℃で、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
  7. それらが裸眼で見えるように十分な大きさの単一細胞コロニーに成長するまで、5日ごとに培地を交換し、37℃で、5％CO 2で細胞を維持します。ほとんどの癌細胞株の場合、これはメッキの日から約2週間かかります。
  8. コロニーは、適切なサイズ（肉眼で、すなわち、目に見える）である場合に、10％FBSを補充したDMEMの200μLを含む96ウェル培養プレートのウェルに個々のコロニーを移します。
    1. 培地の小容量の200μLピペットを用いて単一細胞コロニーを吸引します。徹底的中で細胞を再懸濁数回粉砕することによりdividual井戸。
  9. 90％のコンフルエンス-それらが50に達するまで、5日ごとに培地を交換し、37℃で、5％CO 2で細胞を維持します。 48時間 - ほとんどの癌細胞株の場合、これは約24かかります。

2.直接溶解法を用いた粗ゲノムDNA抽出

  1. 細胞が50に達すると - 90％のコンフルエンスに、マルチチャンネル真空吸引またはマルチチャンネルピペットを使用して可能な限りウェルから培養培地をできるだけ多く除去します。
  2. 各ウェルに0.05％トリプシン-EDTA（フェノ​​ールレッドを含まない）の25μLを添加し、7分間37℃でインキュベートします。
  3. ピペッティングにより数回上下徹底的にトリプシン処理した細胞を再懸濁します。彼らはプラスチックの表面から剥離されていることを確認するために、顕微鏡下で細胞を確認してください。
  4. 空の96ウェル培養PLATに単一細胞懸濁液の約5μLを移すことによって、個々のクローンの複製を作成します電子。各ウェルに培地200μLを添加し、陽性クローンを蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動を用いて同定されるまで（下記参照）の細胞を維持します。シリアル10cmディッシュまたは選択した任意の他のスケールに細胞を拡大（セクション7を参照）。
  5. （10 mMトリスpHは8.0、2.5mMのEDTA、0.2 MのNaCl、0.15％SDS、0.3％のTween-20）自家製直接溶解緩衝液10μL12にステップ2.3からの単一細胞懸濁液の5μLを加えます96ウェルPCRプレートとを数回ピペッティングにより完全に混和します。手短に遠心（ウェルの底まで液体をもたらすこと）。
  6. 一緒にステップ2.4からの複製と、ステップ2.3からの細胞懸濁液の残り〜15μLに培地200μLを添加し、37℃、5％CO 2でインキュベートします。
  7. 細胞およびゲノムDNAの放出の完全な溶解を確実にするために、次の熱サイクリングプログラムにステップ2.5からの溶解物を供する：65℃3について0秒、30秒、8°C、1.5分間、1分間、3分間、1分間、3分間、97°C、8°C、65°C、97°C、1を65°C、65°C分、および10分間80°C。簡単に溶解物を遠心分離します。
  8. ヌクレアーゼフリー水40μLを追加することにより、溶解物を希釈し、ボルテックスミキサーを用いて完全に混合します。遠心分離簡潔に。希釈した溶解物を直ちに使用するか、または品質の著しい損失なしに数ヶ月間-20℃で保存することができます。

3. CRISPR / Cas9標的領域を増幅する蛍光PCRを行います

  1. 各CRISPR / Cas9標的領域のための設計2のフルオロフォアで標識されたフォワードプライマー（両方の5' 末端で標識されました）。互いから300塩基対よりもさらにある部位を切断する非標的野生型対照とCRISPR / Cas9標的クローンについて青色フルオロフォア標識プライマーについて、例えば、緑色フルオロフォア標識プライマー（二つの別々のターゲット領域として考慮されるべきである。 マテリアの表を参照 LS）。
    1. 従って、これらのフォワード標識プライマーおよび非標識リバースプライマーを調達。 500bpの長い - プライマーは、選択した任意のツールを使用して設計することができることとアンプリコンは200でなければならないことに注意してください。
  2. 標識されたプライマーを用いて標的領域を増幅するために、以前に12記載のようにPCRを行います。
    1. 20μLの反応工程2.8から希釈した溶解物を3μlを使用して、次の熱サイクリングプログラム（ 表1参照）：10分（1サイクル）、94℃で、 10秒間94℃、30秒間64℃、1分（4サイクル）68°C。 10秒間94℃、30秒間61°C、1分（4サイクル）68°C。 10秒間94℃、30秒間58℃、1分（4サイクル）68°C。 10秒間94℃、30秒間55℃、1分間68°C（35サイクル）。
  3. サイズおよびアンプリコンの相対的な量を確認するために1％アガロースゲル上のPCRアンプリコンの5μLを解決SS = "外部参照"> 12。
    注：すべてのサンプルについて、この手順を実行するには、奨励が、必要はありません。サンプルの選択された数を解決することは一般にサンプル中に存在するアンプリコンの量を推定するのに十分です。

キャピラリーゲル電気泳動4.準備のサンプル

  1. 野生型のアンプリコン（非標的親細胞）と約2.5 ng /μLでのヌクレアーゼフリー水にCRISPR / Cas9標的DNAを希釈します。各標的DNAサンプル（標的サンプルあたり希釈野生型サンプルの0.5μLの最小値が必要とされる）に追加されるのに十分な野生型DNAサンプルを希釈してください。
  2. 等しい比率で希釈し、野生型と標的DNAサンプルを混合（ 例えば、標的試料の1μLと野生型試料の1μLを混合します）。
  3. 脱イオン化ホルムアミドの8.7μLを混合したアンプリコンの1μLを添加し、遺伝的ANと互換性のある96ウェルPCRプレートに色素標識サイズ標準の0.3μLalyzer。
    注：ホルムアミドのマスターミックスを使用すると、サイズ標準（ すなわち、ホルムアミドのプレミックスの製造及び29でサイズの標準：前に標準化された金額を確保するためのアンプリコンのほかに1比）が推奨されます。
  4. しっかりプレートを密封し、PCRサーモサイクラーを用いて、3分間95℃でサンプルを加熱します。
  5. 直ちに加熱工程の後、氷上でプレートを置き、少なくとも3分間インキュベートします。

ジェネティックアナライザーでキャピラリーゲル電気泳動を行う5.

  1. アッセイパラメーター、機器のプロトコル、および遺伝的解析装置に接続され、キャピラリーゲル電気泳動ソフトウェア上のサイズ-呼び出しプロトコルを設定します。
    注：この手順は、最初の電気泳動操作のために必要とされます。プログラムは、将来の使用のために保存することができます。その後の実行のために、5.2の手順に直進。
    1. ソフトウェアのダッシュボードの「新しいプレートの作成」アイコンをクリックしてください。
    2. Rを与えます国連はダミーの名前とは、次のオプションを選択します。井戸の数、96;プレートタイプ、フラグメント;キャピラリーの長さ、50センチメートル。およびポリマー、POP7。 「割り当てプレートコンテンツ」ボタンをクリックします。
    3. 下に「アッセイ」、「新しいアッセイを作成」をクリックしてください。新しいパネルが表示されます。
    4. アッセイ「FPCR-CGEアッセイを」名前を付けて、「アプリケーションの種類」が正しくとして設定されていることを確認し、「フラグメント。」
    5. 下の「新規作成」ボタンをクリックすることで、機器のプロトコルを設定する「インストゥルメントプロトコル。」
      1. 適切な領域で、次のオプションとパラメータを設定または選択します。アプリケーションの種類、フラグメントを、キャピラリーの長さ、50センチメートル。ポリマー、POP7。色素セット、G5;実行モジュール、FragmentAnalysis。プロトコル名、FPCR-CGEインストゥルメント・プロトコル。オーブン温度60°C。電圧を実行し、19.5 kVの。電圧、15 kVのを事前に実行します。注入電圧、1.6 kVの。ランタイム、1,330秒。前の実行時間、180秒。注入時間、15秒;そして、データ遅延、1秒。
    6. Clボタンやプログラムを保存するために、次に「ライブラリに保存」ボタン「アッセイに適用」をICK。継続してパネルを閉じます。
    7. 下の「新規作成」ボタンをクリックすることで、サイズの呼び出しプロトコルを設定する「Sizecallingプロトコル。」
      1. 適切な領域で、次のオプションとパラメータを設定または選択します。プロトコル名、FPCR-CGE Sizecallingプロトコル。サイズ標準、GS500（-250）LIZ。サイズ発信者、SizeCaller v1.1.0デベロッパー。解析設定、 - 。分析範囲、完全;完全な範囲を、サイジング。法、地方南部を呼び出すサイズ。プライマーピーク、現在;ブルー、グリーン、オレンジチャンネル、（チェック）。最小ピーク高さ、すべてのチャネルのための175。スムージング、なしを使用します。使用ベースライン（ベースラインウィンドウ（PTS））、（チェック）51。最小ピーク半価幅、2。ピークウィンドウサイズ、15;多項式の次数、3。勾配閾値ピークスタート、0.0;勾配閾値ピークエンド、0.0; QC設定、 - 。サイズの品質、 - 。値が<0.25である場合には失敗。値が<0.75であれば合格。 80から0塩基対から直線を想定0 BP;そしてアクチュエプルアップフラグもしプルアップ0.1≤比プルアップスキャン≤1。
    8. 「アッセイに適用」ボタンをクリックし、プログラムを保存するために「ライブラリに保存」ボタンをクリックします。継続してパネルを閉じます。
    9. アッセイは、もう一度「ライブラリに保存」ボタンをクリックすることで保存されていることを確認し、「閉じる」ボタンをクリックしてパネルを終了します。
    10. 戻る「割り当てプレート内容」ページで、下の「新しいファイル名条約の作成」リンクをクリックして「ファイル名の表記。」
    11. プログラム「FPCR-CGEファイル名を。」という名前を付けます
    12. 下に「使用可能な属性、」（例えば、「ファイル名を指定して実行の日、」「ファイル名を指定して実行の時、」「まあポジション、」と「サンプル名」など）、ファイル名に表示されます目的の属性を選択します。実行結果が格納される目的のファイルの場所を選択します。
    13. その後、「アッセイに適用」ボタンをクリックし、プログラムを保存するために「ライブラリに保存」ボタンをクリックします。継続してパネルを閉じます。
    14. 戻る「プレート内容の割り当て」ページで、下の「新しい結果グループの作成」リンクをクリックして、「結果のグループ。」
    15. プログラム名「FPCR-CGEは、グループ結果を。」
    16. 下に「使用可能な属性、」（こうした「アッセイ名」など）、ファイル名に表示されます目的の属性を選択します。実行結果が格納される目的のファイルの場所を選択します。
    17. 「アッセイに適用」ボタンをクリックし、プログラムを保存するために「ライブラリに保存」ボタンをクリックします。継続してパネルを閉じます。
  2. 以下の手順で実行し、電気泳動のためのプログラムを設定します。
    1. ダッシュボードに移動し、「新しいプレートの作成」アイコンをクリックしてください。
    2. （簡単に参照するための日付、細胞株、および遺伝子名を含む）は、所望のように実行に名前を付けます。次のオプションを選択します。井戸の数、96。プレートタイプ、フラグメント;キャピラリーの長さ、50センチメートル。およびポリマー、POP7。 「割り当てプレートコンテンツ」ボタンをクリックします。
    3. 必要に応じて、サンプルの各ウェルにラベルを付ける（ 例えば、サンプルがウェルがネガティブコントロールであることを示すために、「NC」と命名することができます）。
    4. 「アッセイ」、「ファイル名の表記、」および「結果グループの下に追加ライブラリからの」リンク「ボックス、クリックして」と5.1.17へのステップ5.1.3で作成したプログラムを選択します。
    5. 分析対象となるすべてのウェルをハイライト表示し、下の該当するプログラムを選択し、「アッセイ」、「ファイル名の表記、」と「その横のボックスをチェックして結果グループ」。
  3. 遺伝子解析装置のトレイ上にプレートをロードする前に、96ウェルプレート上のゴム製シールを適用し、遺伝子解析装置に付属のプラスチックケースに密閉プレートを置きます。
  4. 遺伝子解析装置の前面に「トレイ」ボタンを押し、そして場合トレイ再装置の前面を痛、ドアを開けてトレイに入れ、プレートをロードします。プレートが所定の位置にロックされていることを確認してからドアを閉じます。
  5. ボタン「ファイル名を指定して実行のためのリンクプレート」をクリックします。
  6. 「ファイル名を指定して実行のためのロードプレート」ページでは、すべての試薬及び条件が正しいと順序になっていることを保証するために最終チェックを行います。
  7. 「スタートファイル名を指定して実行」ボタンをクリックします。 24のサンプル（96ウェルプレートの最初の3x8ウェル）の各ランが完了するまでに55未満分を要します。

塩基対の違いを決定するために、電気泳動図の分析6.

  1. キャピラリーゲル電気泳動の実行が完了すると、結果を分析する分析ソフトウェアを開きます。
  2. アイコンを、実行ファイルを含むフォルダを検索し、「プロジェクトにサンプルを追加」をクリックします。ステップ5.1.12からの結果ファイルの割り当てられた場所を思い出してください。
  3. 完了した実行とCLの各注入のすべての結果ファイルを選択します「リストに追加」ボタンで嫌。これらのファイルの名前は、「インジェクション」で始まり、実行の詳細が含まれています。
  4. 分析を進めるための「追加と分析」ボタンをクリックしてください。
  5. 最初のサンプルをクリックし、最後のサンプルまでカーソルをドラッグして、実行中のすべてのサンプルを選択し、「表示プロット」アイコンをクリックしてください。
  6. サイズ標準の品質を確認するには、オレンジ色のアイコンをチェックし、色付きのアイコンの残りの部分をオフにして、結果のオレンジ色のチャネルを開きます。これは、サイズの呼び出しは、正確かつ信頼性があることを確認することが重要です。
  7. 非標的コントロール由来の断片と標的クローンに対応するピークを表示するには、これらのチャネルからの測定値を開くために青と緑のアイコンを確認してください。
  8. 最初の結果プロットの横軸の上にカーソルを置き、選択し、右クリックし、「すべて表示」を決定するために一目ですべての結果を表示するためにスクロールダウン実行してすべての主要な問題がある場合。プロットの関連軸上でマウスを右クリックし、値の特定の範囲にズームインするには、「ズームに...」を選択し、関心の値の範囲内のキー。
    注：一つの潜在的大きな問題は、すべてのサンプルは、低強度のピークを与えるということです。これは、キャピラリー電気泳動ランまたは容易PCR工程を繰り返すことにより、または、それぞれ、下部希釈係数を使用してアンプリコンを希釈することによって修正することができるアンプリコンの過剰希釈、前にフルオロフォアで標識されたアンプリコンの長期貯蔵に通常です。
  9. 結果を保存するには、以下の手順に従ってください。
    1. 青と緑のチャンネルが選択されていることを確認し、「サイズ表」アイコンをクリックしてください。
    2. 「ファイル」を開いて選択することで、タブ区切りテキスト（.txt）形式で値のテーブルを保存「エクスポートテーブルを。」それに応じてファイルに名前を付け、選択したファイルの場所を選択します。
    3. プロットを保存するにはPDF形式の実行のSは、「ファイル」に移動し、「印刷」オプションをクリックしてください。関連するPDFライターを押し選択して「印刷」をそれに応じてファイルに名前を付け、選択したファイルの場所を選択します。
  10. 非標的野生型対照とCRISPR / Cas9標的クローンから誘導された断片のサイズの差を計算するために、以下に説明する手順に従います。
    1. スプレッドシートプログラムとステップ6.9.2からタブ区切りテキスト（.txt）ファイルを開きます。 （青や緑のチャネルを示す）「染料/試料ピーク」、「サンプル・ファイル名」（最初の文字は、ウェルまたはサンプル名を示す）、「サイズ」（の大きさを示す：表は、これらの4つの重要な列を含める必要があります）と呼ばれる断片、および「高さ」（ピークの蛍光強度を示します）。
    2. 関連するピークを選び出すために、予想される大きさの範囲内にないものを除外する。
      注：一般的に、インデル変異はめったに以上になりませんサイズは100-bpの差より、従って、そのサイズ（緑色チャネルにおける支配的なピーク）野生型コントロールピークから100以上の塩基対だけ異なるピークが除外されます。これは、簡単にスプレッドシートの「条件付き書式」機能でオプション「間」を使用して行うことができます。
    3. バックグラウンドレベルから区別できない非特異的なピークを除去するために、その高さが2,000単位より低いピークを除外するために、スプレッドシート・プログラムの「条件付き書式」機能の下に「より小さい」オプションを使用します。このカットオフ値は、経験的に決定され、適合と見なさここ従って調整することができます。
    4. 前者から後者を差し引くことにより、青色チャネル（CRISPR / Cas9標的クローン）および緑色チャネル（非標的野生型コントロール）における唯一のピークが得られたピークの各々の間のフラグメントサイズの差を計算します。
      注：各キャピラリーelectrophorに起因する値を使用することが重要ですESISサンプルは、のように、野生型コントロールの断片サイズのサンプル間の差異があってもよいです。
    5. もしあれば、中に挿入またはから削除された塩基対の数、問題のゲノム配列を決定するために、最も近い整数に丸めた値。遺伝子をノックアウトすることは重要である場合には、フレームシフトは、コード配列であることを保証するために、そのインデル変異は、3塩基対の倍数でないクローンを選択します。

クローンのノックアウト状態の7.検証

  1. 0.25％トリプシン-EDTAの25μLを用いて細胞をトリプシン処理し、5分間37℃でインキュベートすることにより、24ウェルプレートに（ステップ2.4および2.6からの）96ウェルプレートからの個々のノックアウトクローンを展開。
  2. トリプシン処理した細胞に培地を125μLを（DMEM、10％FBSを補充した）を添加し、十分に再懸濁します。
  3. 室温で5分間400×gで15 mLチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を移します。
  4. 、真空吸引またはピペットを使用して、可能な限り媒体のできるだけ多くを除去培地500μlに細胞ペレットを再懸濁し、24ウェルプレートのウェルに細胞懸濁液を移します。細胞が80~90％コンフルエントに達するまで37℃、5％CO 2でインキュベートします。
  5. 24ウェルプレートから6ウェルプレートに、6ウェルプレートから、それらが80に達する10 cmのディッシュに直列に個々のクローンを展開 - 次ボリュームを使用して繰り返すステップ7.1 7.4に、90％コンフルエンスに： （6ウェルプレートに24ウェルプレートから拡大するため）、0.25％トリプシンEDTAおよび培地150μLの50μLの0.25％トリプシンEDTAおよび培地1mL（200μL6-膨張させますウェル）を10cmディッシュにプレート。
  6. 0.25％トリプシン-EDTAを1mLを用いて、5分間37℃でインキュベートした細胞をトリプシン処理することにより90％のコンフルエンス - それらが80に達したときにクローンを収穫。
  7. トリプシン処理した細胞とresuspeに培地5mlを（DMEM、10％FBSを補充した）追加徹底的ND。
  8. 室温で5分間、400×gで2つの15 mLチューブ、遠心分離機に均等に細胞懸濁液を転送し、そして可能な限り多くのメディアを削除します。細胞の一部は、ゲノムDNA抽出のためであり、他方は、総タンパク質抽出のためのものです。
  9. サンガー配列決定を経由して検証するために、以下の手順に従ってください。
    1. 先に説明したように12個のクローンからゲノムDNAを抽出します。
    2. セクション3.2で説明したように、CRISPR / Cas9標的部位に及ぶ領域のPCR増幅を行ったが、非標識プライマーを使用します。タグからの蛍光は、その後のサンガー配列決定のステップを妨害するように、このステップのための標識プライマーを使用しないでください。
    3. 先に説明したように12、PCRクリーンアップキットを使用してアンプリコンを精製します。
    4. シーケンス記載previouslように、クローンの遺伝子型を決定するステップ7.9.2で使用されるPCRプライマーを用いて精製したアンプリコンY 12。
  10. 以前に12記載のようにウェスタンブロット分析を介して、検証のために、野生型細胞と標的クローンから全タンパク質を抽出します。
    1. 以前に12のように、標的遺伝子のタンパク質に対する適切な抗体を用いたウエスタンブロット分析を行います。真のノックアウトクローンは、タンパク質の発現を欠いています。

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結果

ここで説明する蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動技術は、外来DNAの送達に適している実質的に任意の細胞株におけるゲノムの任意のターゲッティング可能な領域に適用可能であることが予想されます。我々は以前、大腸癌細胞株12における三つの遺伝子を標的とすることにより、その適用を実証しています。ここで、我々は肝細胞癌細胞株の遺伝子型決定でその有効性を示し、CRISPR / Cas9を対象とHEPG2は、1と同様にヌクレオソームタンパク質1（NAP1L1）遺伝子に対して構築します。実際に、我々は正常に多数の他の遺伝子12、13を対象とする非ヒト哺乳動物細胞系を含む種々の他の細胞を、遺伝子型蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を利用しています。

実験ワイズ、蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動tec...

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ディスカッション

選択のモデル細胞株に特異的な遺伝子のノックアウト遺伝子が特定の細胞のコンテキストで果たす役割を解明するためのルーチンとなっています。実際には、いくつかのゲノムワイドスクリーンはゲノム14、15、16に実質的に全ての公知のヒト遺伝子を標的とするためにCRISPR / Cas9システムを使用する現在利用可能です。これらの大規模スクリーン（又は関心のある個々の遺伝子の標的も小規模）を用いて、設計と同じ遺伝子の異なる遺伝子座を標的sgRNAsを利用することが重要です。使用異なるsgRNAs間で一貫性のある結果が明確遺伝子の枯渇の真の効果を降伏でしょう。このように、単一の遺伝子の標的を正確に使用される個々のsgRNAの各々からのクローンの多くの遺伝子型を決定するために大量の遺伝子型決定のステップを必要とするであろう。蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法は、彼の説明しました再は、正確にこのタスクを実行することができます。

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

著者は、キャピラリーゲル電気泳動実験を助けるため女史タン市ミンさん、ヘレン・オング、博士ザオ・イ感謝したいと思います。この作業は、/ 2011分の1314 NMRCとMOE ACRFティア2基金助成金MOE2011-T2-1-051を付与NMRC / IRGによってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
HEPG2細胞ATCCHB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)Thermo Fisher ScientificSH30022.01
HyClone Fetal Bovine SerumThermo Fisher ScientificSV30160.03
pSpCas9(BB)-2A-GFP プラスミドAddgenePX458
Lipofectamine 2000サーモフィッシャーサイエンティフィック
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィック25200056
トリプシン-EDTA(0.5%)、フェノールレッドなしサーモフィッシャーサイエンティフィック15400054
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)サーモフィッシャーサイエンティフィック15140122
HyClone ウォーター、分子生物学グレードGE ヘルスケアSH30538.02
CRISPR sgRNA インサートオリゴヌクレオチド (センス)AITbiotechなし配列: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'CRISPR
sgRNA インサートオリゴヌクレオチド (アンチセンス)AITbiotechなし配列: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'
非標識PCR増幅フォワードプライマーAITbiotechなし配列: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3';このプライマーは、PCR増幅対立遺伝子の配列決定にも使用されます
6-FAM標識蛍光PCRフォワードプライマーAITbiotechなし配列:5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'HEX
標識蛍光PCRフォワードプライマーAITbiotechなし配列:5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'
非標識PCR逆プライマーAITbiotechなし なし配列: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq
PCR Core KitQIAGEN201223
Hi-Di ホルムアミドサーモフィッシャーサイエンティフィック4311320
GeneScan 500 LIZ 色素サイズ 標準サーモフィッシャーサイエンティフィック4322682
MicroAmp 光学式 96ウェル反応プレートサーモフィッシャーサイエンティフィック4306737
3500xL 遺伝子分析装置Thermo Fisher Scientific4405633
3500 Series 2 プログラムThermo Fisher Scientific4476988
Gene Mapper 5 プログラムThermo Fisher Scientific4475073
Gentra Puregene Cell KitQIAGEN1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up SystemPromegaA9282
NAP1L1 抗体 (N-term)AbgentAP1920b
Nuclear Matrix Protein p84 抗体 [5E10]GeneTexGTX70220
ペルオキシダーゼ AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch111-035-144
ペルオキシダーゼ AffiniPure Sheep 抗マウス IgGJackson ImmunoResearch515-035-003
11668027

参考文献

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ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました
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