方法論記事

マウスモデルにおける覚醒時膀胱内圧測定の実施手順の評価

DOI：

10.3791/55588

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2017年5月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Vermont, 2Department of Urology and Biomedical Laboratory, University of Southern Denmark, 3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest University, 4Institute for Clinical Medicine, Aarhus University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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本研究では、自由に動くマウスで覚醒膀胱内圧測定を行うための手術手順と実験技術について述べる。さらに、最適化と標準化をサポートする実験的証拠を提供します。

要約

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覚醒充填膀胱内圧測定は、自由に動くマウスの膀胱機能を評価するために長い間使用されてきたが、使用される具体的な方法は実験室によって異なる。この研究の目的は、膀胱内チューブを埋め込むために使用される顕微手術手順と、覚醒し、自由に動くマウスに膀胱圧を記録するための実験技術を記述することであった。さらに、手術データ、管の種類およびサイズが下部尿路機能および記録感度にどのように影響するかを示すための実験データを提示する。圧力記録に対するチューブ直径の影響は、異なる内径を有するポリエチレンおよびポリウレタンチューブの両方で評価された。続いて、両方の材料から得られた最も優れたチューブを、雄のC57BL / 6マウスの膀胱のドームに外科的に移植した。手術後2、3、5、および7日目に、健康で無傷の動物および動物に、12時間の一晩排尿頻度を記録した。収穫時に、膀胱肉眼観察を用いて腫脹の徴候を評価し、続いて病理学的分析のために処理した。 2および3日目に膀胱腫脹の最大限度が観察され、有意に膀胱機能障害を示す行動排尿データと相関した。 5日目までに、膀胱組織学および排尿頻度が正常化した。我々の研究で得られた文献と証拠に基づき、我々は、覚醒マウスの膀胱内圧および空隙体積のインビボ記録のための以下のステップを提案する：1）手術顕微鏡および顕微手術ツールを用いて手術を行う、2）ポリエチレン-10 3）膀胱膨潤が解消した術後5日目に膀胱内圧測定を行う。

概要

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充填膀胱内圧測定法（FC）は、膀胱充填が遅い間に圧力を記録するためにカテーテルを膀胱内に配置することを含む診断方法である。下部尿路機能を評価するための臨床診断法として1927年に初めて導入されたが、現在でも広く使用されている。研究アプリケーションでは、FCを使用して、健常な動物モデルおよび罹患動物モデルの膀胱機能を試験し、薬理学的作用物質の効果を研究することができる。げっ歯類動物モデルは、下部尿路機能を調査するために一般的に使用される。 2この哺乳動物群では、FCはラットでの使用のために最初に開発された。 3ここで、チューブを膀胱に埋め込み、FCを行う方法は、許容可能なレベルの再現性を有する多くの研究者によってよく記述され、使用されている。 4トランスジェニックおよびノックアウト株の利用可能性は、マウスを数多くの研究分野にとって貴重な種にし、下部尿路機能不全の分野を含む。マウス膀胱内圧測定を実施するために使用される方法論は、実験室間でかなり異なるため、結果を比較することが困難である。 5

エキソビボモデルと比較して、FCは下部尿路の解剖学的構造を保存し、排尿サイクルの貯蔵および排尿段階の間に膀胱とその出口との協調機能を評価することができる。以前の研究は、多くの一般的に....

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プロトコル

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動物は、施設ガイドラインに従って、バーモント大学動物飼育施設に収容された。すべての動物実験は、実験動物のケアおよび使用のためのNational Institutes of Healthガイドに従って実施した。

1.膀胱内チューブインプラント

  1. 外科処置のための管および器具の準備
    1. 移植のためにカテーテルを作るためにPE10チュービングの7cmピースを切断します。
    2. 端を開いたフレームに向かってゆっくりと前進させてPE10チューブの一端にフレアを作ります。
      注：フレアが発生するとすぐに素早くチューブを引き抜きます。
    3. PE10チューブの外側のフレア端から4.5,5,5 cmのグルーガンの低熱量設定を使用して、汎用のホットグルーを3滴塗布します。これらは、動物の背中のチューブを固定するのに役立ちます。 （ 図1 ）
    4. チューブを70％浸漬して滅菌する。その後、使用前に滅菌0.9％NaClで洗い流してください。システムに気泡が入るのを避けるため、チューブを満たしたままにしておきます。
    5. 手で近位端を左右に操作して30ゲージの針をハブから分離することにより、PE10カテーテルの端をシールするために30ゲージのプラグを作成します。最後に熱い糊を塗ってください。シールは水密であることを確認してください。 （ <....

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結果

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管閉塞の間のシステム内の圧力の上昇および下降の一貫性における管材料および直径の間に有意差はなかった。ポリエチレン（PE）およびポリウレタン（PU）材料の両方において、膀胱壁の腫脹後の膀胱内チューブの移植が有意であった。 2日目に、重度の粘膜下腫脹が発症した。それは膀胱の断面の半分を占め、内腔の閉塞を引き起こした。 5日目に浮腫は完全に消散し、粘膜下領域に筋肉を部分的に侵入させる炎症細胞が浸潤したままになった。 7日目に、炎症性浸潤が有意に減少し、膀胱壁組織学は正常に戻った（ 図8 ）。 2日目および3日目に観察された組織腫脹の最大程度は、有意に障害された膀胱機能を示す行動排尿データと相関した（ 図9 ）。 poで正規化された無効周波数手術中5日目。

（最小の運動アーチファクトを有する）覚醒している自由に動くマウスの膀胱内圧は、10〜15cmH 2 Oのベースライ.......

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ディスカッション

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膀胱内チューブの最適な材料およびサイズ

チュービングの直径が圧力記録に及ぼす影響を決定するために、我々は異なるマイクロ流体チューブを試験した。 PE50（0.58mm ID）、ポリウレタンPU027（0.4mm ID）、PE25（0.46mm ID）、およびPE10（0.28mm ID）。各チューブについて、チューブを0〜30cmの範囲で垂直方向に急速に動かしながら、1mL /時で注入ポンプを作動させて圧力を記録した。最初のin vivo実験ではPE50チュービングを使用しようとしましたが、マウスの膀胱と比較してチュービングのサイズが不十分でした（ 図4A ）。これは、マウスの覚醒膀胱内圧測定のためにPE50チュービングを使用すると、アーチファクトが生じ、データの解釈が困難になることを示唆しているSmithとKuchelによる発見を支持するが、 12覚醒の非拘束、覚醒拘束、および麻酔したマウス膀胱内圧測定。 図9 において、PE10はPE5.......

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この研究は、バーモント大学外科、デンマーク独立研究評議会、およびオーデンセ大学病院によって資金提供されました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ポリエチレン(PE)10チューブInstechBTPE-1030Gコネクタ/プラグ適合
ポリエチレン(PE)50チューブInstechBTPE-5022Gコネクタ/プラグ適合
22Gシングルチャンネルステンレス鋼スイベルInstech375/22
炭素鋼ユーティリティエクステンションスプリング(9/64インチOD)グレインジャー1NAH1PE50チューブを保護します-長さにカット
22 GコネクタInstechSP22 / 12
Yutaozプロフェッショナルホットメルト接着剤接着剤ガンYutaoz低温設定(100°C;C) - 調整可能な温度範囲を持つ任意のホットメルト接着剤ガンが動作します
Surebonder DT-2010 万能のりスティックSurebonder任意の万能ホットグルーが動作します
デュモン #5 湾曲したマイクロ鉗子ワールド精密機器500232
デュモン #7 湾曲したマイクロ鉗子ワールド精密機器14188
ミニ解剖はさみ - ストレートWorld Precision Instruments503240
マイクロ蚊鉗子 (12.5 cm)World Precision Instruments500451
Dissecting はさみ - ストレートWorld Precision Instruments14393
Castroviejo ニードルホルダーWorld Precision Instruments503258
Isoflurane, USPPhoenix2%, 1 L/min 流量
ブプレノルフィン0.05 mg/kg
0.9% 塩化ナトリウム 灌漑、USPバクスター
6-0 エチロン ブラック モノフィラメント、非吸収性縫合エチコンブラダー
タイ 6-0 ビクリル バイオレット ブレイド、吸収性縫合エチコンマッスル 縫合糸、ランニング
6-0 プロレン ブルー モノフィラメント、非吸収性縫合エチコン皮膚縫合糸、縦型マットレス、埋設中断
KD Legato 210 注入/引き出しポンプKD Scientific1.5 mL/hr
使い捨て圧力トランスデューサDigitimerNL108T2
圧力増幅器DigitimerNL108A
Power1401-3 データ収集インターフェースDigitimer
Spike2 Cambridge Electronic Design LimitedPC圧力記録ソフトウェア
Leica MZ6 手術用顕微鏡 (3.2 - 20X)Leica MicrosystemsMagnification
適合 適合 高糸 糸 糸

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perez, L. M., Webster, G. D. The History of Urodynamics. Neurourol Urodyn. 11 (1), 1-21 (1992).
  2. Fry, C. H., et al. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol Urodyn. 29 (4), 603-608 (2010).
  3. Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A.

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