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方法論記事

ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト卵黄扁平上皮癌試料におけるT細胞亜集団の四色蛍光免疫組織化学

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DOI:

10.3791/55589

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2017年7月29日

 ,  , 
1Department of Pathology, Leiden University Medical Center, 2Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, Erasmus University Medical Center, 3Center for Gynecological Oncology Amsterdam, VU Medical Center

この記事について

サマリー

多パラメータ蛍光免疫組織化学を用いて、腫瘍微小環境における免疫細胞集団の数、相対分布、および局在を評価することができる。この文献は、口腔咽頭癌におけるT細胞亜集団を分析するためのこの技術の使用を記載している。

要約

4色蛍光免疫組織化学（IHC）技術は、それらの相対的分布および組織におけるそれらの局在を考慮に入れながら、目的の細胞集団を定量する方法である。この技術は、様々な腫瘍型の免疫浸潤を研究するために広く適用されている。腫瘍微小環境は、腫瘍部位に引き付けられる免疫細胞によって浸潤される。異なる免疫細胞集団は、腫瘍微小環境において異なる役割を果たすこと、および疾患の転帰に異なる影響を有することが見出されている。この原稿では、口腔咽頭扁平上皮癌（OPSCC）上の多パラメータ蛍光IHCの使用を例として説明します。この技術は、他の組織サンプルおよび目的の細胞型に拡張することができる。提示された研究では、大きなOPSCCコホート（n = 162）の上皮内および間質コンパートメントを分析した。我々は、全Tリンパ球（CD3 + ）、免疫抑制性調節間質から腫瘍上皮を区別するために核対比染色を用いて、T細胞（Tregs; すなわち FoxP3 + ）およびTヘルパー17（Th17）細胞（ すなわち、 IL-17 + CD3 +腫瘍内IL-17 +非T細胞の数が少ない患者において、多数のT細胞が無病生存期間の改善と相関することが見出された。これは、IL-17 +非T細胞がOPSCCにおける貧弱な免疫応答と相関し得ることを示唆し、これはIL-17と癌患者における生存率の間の相関と一致する。現在、7つまでの異なる蛍光色素を用いて新規なマルチパラメータ蛍光IHC技術が開発されており、腫瘍微小環境における免疫細胞のより正確な特徴付けおよび局在化が可能になる。

概要

口腔咽頭扁平上皮癌（OPSCC）は、口腔咽頭に由来する扁平上皮細胞癌の異種群である。 OPSCCの危険因子は、ヒトパピローマウイルス（HPV）感染症とアルコールとタバコの使用1、2が挙げられます。免疫反応の役割とこれを臨床現場でどのように使用するかは、まだ検討され始めています。腫瘍微小環境は、癌部位に引き付けられる免疫細胞によって浸潤される。 OPSCC患​​者3では、高いCD8 +細胞傷害性T細胞頻度が改善された生存と相関しているが、TregおよびTh17細胞を含む他のT細胞サブセットの役割は依然として不明である4 。 Th1およびTh17細胞は、腫瘍細胞を標的とする免疫応答を助長すると考えられているが、Tregsは、他のT細胞の活性を抑制する能力に関してよく知られている5 。しかしながら、Tregsは、異なる腫瘍のタイプ6における好都合な反応および好ましくない反応の両方と相関することが見出されている6 。血液中に存在する全ての免疫細胞が腫瘍に同程度まで浸潤するわけではないので、局所腫瘍微小環境を研究することは、腫瘍に対して指向される免疫応答の最も信頼できる尺度を提供する。この研究の目的は、免疫細胞の数とタイプと臨床結果との間の相関関係を決定することである。我々は、ヒトOPSCCにおける種々のT細胞亜集団の数および局在を分析するために、4色蛍光IHCイメージングを使用した。

我々は、分化経路がTh17細胞と密接に関連しているトータルTリンパ球（CD3 + ）、Th17細胞、および免疫抑制性FoxP3 + Tregsに焦点を当てた。 Th17細胞は、CD3とIL-17との組み合わせによって特徴付けられる。サイトカインIL-17はまた、非T細胞によって産生され得る7 。我々は、イントラ - エピトープの分布を決定したヘリカルおよび間質性T細胞、Tregs、Th17、およびIL-17 +非T細胞を、OPSCC症例の大規模シリーズで分析し、患者の生存との相関を分析した。多色蛍光IHCを使用して、CD3、Foxp3、およびIL-17の発現を、DAPI対比染色剤と組み合わせて同定した。このアッセイは、腫瘍細胞（DAPI核染色を使用）および浸潤T細胞集団（異なるマーカーの組み合わせを使用する）の両方の容易かつ明確な同定を可能にした。試料の調製および染色の後、蛍光顕微鏡および画像化ソフトウェアを使用して、使用される異なる蛍光色を分離し、腫瘍上皮および腫瘍関連間質の両方に存在する細胞の数および型を決定した。

免疫細胞集団を定量化および表現する別のアッセイは、フローサイトメトリー分析、または腫瘍または末梢サンプル（ すなわち血液または腹水）の飛行時間（CyTOF）分析によるサイトメトリーである。これを使用する異なる細胞型の局在化および相対的分布に関するすべての情報が失われる。末梢サンプルの使用および分析はまた、どの細胞が腫瘍微小環境に浸潤できるかについての情報を提供しない。血液および腹水免疫細胞の分析は、腫瘍組織8,9の免疫細胞浸潤の表現型および頻度を反映しないことが示されています。

もう一つの選択肢は、明視野顕微鏡の使用である。蛍光イメージングに対するこの技術の利点は、組織自己蛍光がないことである。いくつかの試料はより多くの自家蛍光、特に赤血球を含有するが、好中球顆粒球を含む他の細胞型も含まれるが、これらの領域はほとんどすべての試料の分析において容易に除去することができる。免疫蛍光法は、標的蛍光体のパネルを使用することにより、1つの試料中の複数のマーカーを分析する利点を提供するnt個の波長を有する。これは、特定の抗原についての十分な数の標識および市販の抗体アイソタイプの欠如のために、明視野顕微鏡法については現在同じ程度には不可能である。

ここで説明した多色蛍光IHC技術は、例えば、ヒト白血球抗原（HLA）とPD-L1 10、11などの異なる免疫細胞集団、ならびに腫瘍細胞発現分子を研究する癌の種類及び抗体の組合せさまざまに使用されています12 。このプロトコールは、多くの異なるタイプのサンプルおよび抗体を用いて確立され、検証されている。

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プロトコル

患者サンプルは、オランダの生物医学社会連合（www.federa.org）のヒト組織の適切な二次的使用のための行動規範に記載された医学的倫理ガイドラインに従って取り扱われた。

1.スライドの準備

  1. 切除された材料を使用する医療倫理委員会の許可を得た後、病理部門から切除された組織材料（あらゆる種類の組織）を入手する。
    注：現在の実験では、前治療（n = 162） 13として選択された1970年から2011年の間、オランダのライデン大学メディカルセンターで診断された原発性口腔咽頭腫瘍から前処置腫瘍サンプルを得た。組織の大きさは、腫瘍内部の4つの顕微鏡画像を確実に採取するのに十分な量の腫瘍組織の必要性によってのみ制限されていた。
  2. 最低12時間、4％緩衝化ホルマリン中で組織を固定する。 agの組織を脱水するエタノールを放出した。それをキシレンで洗浄し、パラフィンワックスに自動ティッシュプロセッサーを用いて包埋する。
  3. ミクロトームを用いてガラススライド上に4μm厚のホルマリン固定、パラフィン包埋（FFPE）組織切片を切断する。標準手順を使用して組織ブロックをマイクロトーンティッシュホルダーに置きます。
    1. 組織のリボンを切断し、45℃の脱イオン水を入れた水浴の表面に置きます。免疫組織化学的染色に適したスライドを使用して、セクションのすぐ下の水にスライドを置くことによってセクションを釣り上げる。慎重にスライドを斜め上に動かし、セクションを水中から取り出してスライドに貼り付けます。
  4. スライドを一晩37℃で乾燥させる。
  5. FFPEスライドを新鮮な100％キシレンに完全に浸すことにより脱パラフィンし、それぞれ5分間3回。新鮮な100％エタノール、70％エタノール、および50％エタノールで2回それぞれ5分間浸漬することにより、スライドを再水和する。。

2.抗原検索を実行する

  1. スライドを脱イオン水で5分間洗浄する。
  2. マイクロ波を用いてトリス - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）緩衝液（10mM Tris + 1mM EDTA、pH9.0）を沸騰温度まで予熱する。予熱されたEDTAバッファー中にスライドを浸し、この温度で10分間マイクロ波でバッファーを保持することによって抗原回収を行う。
    注：900 Wのパワーを持つあらゆる電子レンジを使用できます。
  3. スライドを2時間緩衝液中で冷却させる。

3.組織スライドを染色する

  1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でスライドを2回それぞれ5分間洗浄する。
  2. 疎水性ペンで組織の周りに円を描き、希釈された抗体がスライドからこぼれるのを防ぎます。もう一度PBSで洗浄する。これはオプションです。
  3. 1％w / vウシ血清aで希釈した一次抗体（抗CD3 1:50、抗FoxP3 1：200および抗IL-17 1:50）で組織をインキュベートする。PBS中、室温で一晩インキュベートした。
    注：1スライドあたりのボリュームは、組織のサイズに依存しますが、通常は50〜150μLです。 CD3、CD8、およびFoxP3抗体（ すなわち、ウサギIgアイソタイプ対照抗体、マウスIgG1アイソタイプ対照抗体およびヤギ抗体と同じ希釈でネガティブコントロールスライドに対する未知の特異性を有する同じアイソタイプクラスの抗体で一次抗体を置換するIgGアイソタイプ対照抗体）。
  4. スライドを5分間PBSで3回洗浄する。
  5. 一次抗体種および/またはアイソタイプ（ すなわち、ロバ抗ヤギIgG Alexa 488、ロバ抗ウサギIgG A546およびロバ抗マウスA647の1：200）を標的とする蛍光標識された二次抗体の組合せで組織をインキュベートする。 1％BSA含有PBS中、室温で1時間インキュベートする。
    注：1スライドあたりのボリュームは、組織のサイズに依存しますが、通常50〜150μLです。
    1. 後二次抗体を添加し、暗箱に保管するか、ボックスをアルミ箔で包むことにより、スライドを可能な限り光から保護する。

4.マウントおよび対比組織スライド

  1. スライドを5分間PBSで3回洗浄する。
  2. 核対比染色剤（ 例えば、 DAPI）を含有する水性防フェード装着培地を用いてスライドをマウントする。できるだけ早く（2週間以内に）蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析する。分析するまで4℃で暗所にスライドを保存する。

5.染色された組織スライドを分析する

  1. 20〜25倍の対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を用いて各スライドの4つの画像を取得する。スライドに含まれる全腫瘍領域のランダムな場所で画像を撮影し、腫瘍の代表的な部分をキャプチャします。
    注：250倍の標準倍率を使用する必要があります。任意の蛍光o使用される蛍光色素を視覚化するのに必要なフィルターおよびレーザーを備えていれば、レーザー走査顕微鏡を使用することができる。
    1. Alexa 488の視覚化のために、励起最大値490、最大発光量525を使用します。 Alexa 546の視覚化のために、励起最大値は556、発光最大値は573である。 Alexa 647の可視化のために、励起最大値650および発光最大値665を使用する。 DAPIの視覚化のために、励起最大値を358、発光最大値を461とする。
    2. イメージをイメージファイル（ すなわち、 jpegおよびtiff）として、ユーザが利用可能なソフトウェアに保存する。
  2. 病理学者に相談した後、腫瘍上皮細胞と間質細胞の核および細胞の形状に基づいて、腫瘍上皮と腫瘍間質領域とを区別する。
    1. 総間質の表面積を決定するには、（腫瘍細胞ではなく）間質細胞が占めるすべての領域の周りに線を引いて、顕微鏡の製造元が提供する画像分析ソフトウェアを使用して表面積を測定する。
      1. 画像の下にある「オーバーレイ」タブをクリックします。 「閉じたポリライン」シェイプを選択し、それをクリックします。腫瘍の上皮と間質の境界を境に、最初の点に再び到達するまでその領域をクリックします。これは、その領域の尺度となります。
        注：形状が閉じられると、数は、選択された画像（A = X 2ミクロン）の表面領域を取り囲む形状の横に表示されます。
    2. この表面積を総画像表面積（画像特性で提供される）から差し引いて、上皮表面積を計算する。提供された領域のサイズを記録し、それを上皮表面領域から差し引くことによって、血管、壊死および自家蛍光領域を取り除く。
    3. すべての表面積の数値をスプレッドシートファイルに保存して平均表面積を計算し、1スライドあたりの細胞数。
    4. 画像解析ソフトウェアを使用して、4つのチャンネルすべての蛍光をチェックすることにより、細胞が単一陽性か、二重陽性か、または三重陽性かを決定する。
      1. ImageJを使用して、各画像の一重、二重および三重陽性細胞を数えます。
        1. ImageJをダウンロードしてください。 "ファイル"と "開く"をクリックして画像を開き、分析する画像を選択します。 「ポイントツール」（4行の真ん中の赤い四角形）を右クリックし、「マルチポイントツール」を選択します。 「マルチポイントツール」をダブルクリックして、各セルタイプごとに異なるカウンター番号を選択して、画像内の異なるセルタイプの数を数えます。
          注：1つ、2つ、または3つの蛍光色の存在によって識別されるように、それぞれの異なる細胞タイプのすべての細胞を数えます。この核対比染色はすべての細胞に存在し、腫瘍細胞を免疫細胞と区別するために使用されるため、DAPIを除外する。各セルタイプがカウントされます別のカウンター番号を使用します。毎回異なるカウンター番号を選択することによって、腫瘍上皮および間質領域で別々に各細胞型の細胞数を数えます。血管や大部分の自家蛍光領域内の細胞は計数しないでください。
        2. スプレッドシートファイルに各画像の各カウンタービンで分析されたセルの数を記録します。
        3. 分析された腫瘍上皮および腫瘍間質の総表面積にわたって各細胞型の総細胞数を割る。

6.統計分析

注：すべての統計分析は、データの品質を保証するために統計学者と協議する必要があります。一般的な統計については、任意の医療統計ガイド14を使用してください。

  1. スピアマンのランク相関rho検定を用いて細胞頻度間の相関関係を試験する。
  2. 陽性細胞数の統計的差異を試験するWilcoxon Mann-Whitney検定を使用して、患者群間で評価した。
  3. Kaplan-Meier曲線生成および対数較正を用いて、細胞数と無病生存率（ すなわち、診断から死亡または疾患の局所再発または遠隔再発までの時間）の相関を試験する。ランク分析15 。
  4. Cox比例ハザード回帰分析を使用して多変量解析を実行します。

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結果

前述したように選択された1970年から2011年の間にライデン大学医療センター、ライデン、オランダで診断原発口腔咽頭腫瘍から得られたFFPE前処理腫瘍サンプルのシリーズ、（N = 162）は、13に記載のプロトコルを用いて染色しました。各スライドの1から4つのランダム画像を分析した（ 図1 ）。いくつかの自家蛍光細胞が示されており、完全な黄色の外観によって明確に区別することができる。真に二重または三重陽性の細胞は、予想される局在化（この場合、細胞膜または核である）において特定の抗体に対して陽性にしか染色されない。陰性対照スライドは、バックグラウンド組織自己蛍光よりも特異的な染色を示さず（ 図2および図4 ）、すべてのシグナルがプライマリによって認識された標的に特異的であることを確認した抗体。全ての腫瘍試料は、CD3 + T細胞...

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ディスカッション

記載されたプロトコールについて、最も重要な工程の1つは、使用される一次抗体の正確な希釈を決定することである。これらの特異的なAlexa標識抗体の製造元が推奨するように、標識二次抗体の希釈度は1：200であった。一次抗体の希釈は、好ましくは意図された組織型の2つの異なる試料（この場合はOPSCC）を用いて連続希釈によって決定されるべきである。最適な作業希釈は、バックグラウンドノイズなしで同じ濃度の陰性対照についてのシグナルがない場合に、明確なシグナルが得られる希釈である。入手可能な顕微鏡のタイプおよび研究者の好みに応じて、使用される二次抗体のタイプおよび使用される装着媒体に関して改変を行うことができる。意図した結果が得られない場合は、背景信号に問題を引き起こすことが知られているスライドガラスのタイプを調べることをおすすめします特定の種類の染色溶液（ 例えば、 Perma Blue）のために使用される。第二に、いくつかの抗原は、熱誘導性エピトープ回収の使用によって混乱する可能性がある。この場合、研究者は緩衝液の加熱工程を酵素誘発性エピトープ回収のような他の技術と置き換えることができる。第3に、疎水性ペンを使用す...

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開示事項

著者は商業的または財務的に利益相反を宣言していません。

謝辞

Simone Puntは、オランダ癌協会の助成金UL2010-4801の支援を受けました。我々は、このJoVEプロトコルが基づいている元の論文の共著者すべてに感謝したいと思います：Emilie A. Dronkers、Marij JP Welters、Renske Goedemans、SenadaKoljenović、Elisabeth Bloemena、Peter JF Snijders、Arko Gorter、Sjoerd vanバーグ。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Pathos Delta Ultra Rapid Tissue ProcessorMilestoneおよびHistostarAutomated tissue processor
HistostarThermo ScientificTissue block embedding machine
FormaldehydeBaker
XylolMerck
EthanolMerck
milliQ waterElagaPurelab Chorus
Paraffin wax/ParacleanKlinipath5079A
Microtome tissue holderLeicaRM225
Flex IHC sideDakoTissue slide
TrisMerk-Milipore1,083,821,000
EDTABaker1073
PBSBio-RadBUF036A
BSASigmaA9647
Rabbit anti-CD3Abcamab828滴定必要抗体希釈
Mouse IgG1 anti-FoxP3Abcamab20034滴定必要抗体希釈
ヤギ IgG 抗 IL-17R&D SystemsAF-317-NA滴定液化必要抗体
ウサギ Ig アイソタイプコントロール抗体Abcamab27472抗CD3
マウスIgG1アイソタイプコントロール抗体アブカムab91353抗FoxP3
ギIgGアイソタイプコントロール抗体サーモフィッシャーサイエンティフィック02-6202同じ最終濃度で使用抗IL-17
バ抗ウサギIgG A546ThermoFisher ScientificA100401:200を1%BSA/PBS
で希釈 ロバ抗マウス-A647ThermoFisher ScientificA315711:200を1% BSA/PBSで希釈
ロバ反ヤギIgG A488ThermoFisher ScientificA11055:200を1% BSA/PBS
VectaShieldで希釈 DAPIベクターラボラトリーズH-1200
LSM700 共焦点レーザー走査型顕微鏡 ツァイス
LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objectiveツァイス420852-9972-720
LSM Zen ソフトウェアツァイスバージョン 2009
LSM イメージ ブラウザツァイスバージョン 4.2.0.121でダウンロード可能 www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html.
SPSSIBM株式会社version 20.0
ImageJversion 1.50ihttp://rsb.info.nih.gov/ij でダウンロードできます。
希釈 と同じ最終濃度で使用 ヤと同じ最終濃度で使用 ロ 1

参考文献

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