神経系の再構築、変調、モデリングのための解剖学的にインスパイアされた3次元マイクロ組織工学ニューラルネットワーク

Summary

この原稿では、微細組織工学ニューラルネットワークの作成について詳しく述べる。三次元のミクロンサイズの構造物は、管状ヒドロゲルに包まれた凝集ニューロン集団にまたがる長い整列した軸索路からなる。これらの生存足場は、神経回路を再構成または調節するための機能的中継として、または灰白色物質の神経解剖学を模倣するバイオフィリックテストベッドとして役立ち得る。

Abstract

機能回復は、中枢神経系（CNS）内での損傷または疾患誘発性変性の後に、抑制的環境および神経発生のための限られた能力のためにほとんど起こらない。私たちは、損傷したCNS内のニューロンおよび軸索経路の消失に同時に対処するための戦略を開発している。この原稿では、ミクロ組織工学ニューラルネットワーク（マイクロTENNs）、ニューロンと、直径が数百ミクロンであり、センチメートルに伸びる予備形成されたヒドロゲルシリンダーの細胞外マトリックス（ECM）内腔にまたがる配列された軸索路からなる移植可能な構築物長さで。ニューロン凝集体は、三次元包囲体の極端に区切られ、軸索突起によって広がっている。マイクロTENNは、脳結合サイト構造の側面をエミュレートし、潜在的にネットワーク置換の手段を提供する、CNS再構成のための戦略として独特に準備されている。ニューロナル凝集体は宿主組織とシナプス結合して、欠損または損傷した回路を修復および/または調節するための新しい機能的な中継を形成し得る。これらの構築物はまた、細胞遊走および軸索経路探索のための発生機構を利用して、再生状態に基づいて相乗的な構造的および可溶性キューを提供することができる、前駆再生的「生きた足場」として作用し得る。微小TENNは、液体ハイドロゲルを長手方向に中心の針を含む円筒形の鋳型に注入することによって製造される。ヒドロゲルがゲル化したら、針を除去し、中空マイクロカラムを残す。内腔にECM溶液を添加して、ニューロン接着および軸索伸長に適した環境を提供する。解離したニューロンは、マイクロカラムの一方または両方の端部内で正確な播種のために機械的に凝集される。この方法論は、脳の神経解剖学の特徴を再現する可能性のある長期間突出した軸索路を有する自己完結型の小型構築物を確実に産生する。シナプスイム非標識および遺伝的にコード化されたカルシウム指標は、マイクロTENNが広範なシナプス分布および固有の電気活性を有することを示唆している。したがって、マイクロTENNは、脳経路の標的化された神経外科的再建のための有望な戦略であり、インビトロで神経生物学的現象を研究するためのバイオフィジックモデルとして適用されてもよい。

Introduction

外傷性脳損傷（TBI）、脊髄損傷（SCI）、脳卒中、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの中枢神経系（CNS）の障害および疾患の共通の特徴は、軸索経路および神経細胞の切断である損失1、2、3、4、5、6。例えば、虚血性脳卒中が治療されなくなると、軸索が1分間に軸索7マイルの速度で失われると推定される⁵ 。米国だけで約170万人が毎年経験しているTBIの場合、初期の損傷が長期の神経変性状態を引き起こすため、軸索変性は外傷後数年間続くことがあります⁴ 。これらの有害な影響をさらに悪化させるCNSは、再生のための都市1、7、8、9。傷害後、遠方の標的への誘導指向の欠如、神経突起伸長を妨げるミエリン関連阻害剤の存在、および反応性星状細胞によるグリア瘢痕の形成8,10,11,12を特徴とする阻害環境が生じる。グリアの傷跡は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのような分子が軸索の伸長を妨害する分子で、再生に対する生化学的および物理的障壁として働く8,11。さらに、成人CNSにおいて神経幹細胞が見出されているにもかかわらず、ニューロン新生の一貫した証拠が嗅球、海馬顆粒周囲領域、および脊髄^13,14の中心管を含むが、これらに限定されない。これらの障害は、傷害または疾患後の失われたニューロンおよび白質構造の機能的回復を妨げ、しばしばこれらの状態の人生の変化および長期間の影響をもたらす。

Protocol

動物を含むすべての処置は、ペンシルバニア大学の機関動物用ケアおよび使用委員会およびマイケルJ.クレセンツ退役軍人医療センターによって承認され、NIH公衆衛生サービス政策のヒューマンケアおよび実験室使用に関するガイドラインに従った動物（2015年）。

1.アガロースヒドロゲル（マイクロTENNの無細胞成分）の開発

1. アガロース溶液調製
   1. バイオセーフティキャビネット内で、20mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を2枚の10cmペトリ皿に移すことにより、マイクロカラム用のリザーバーを準備する。熱いビーズ滅菌器で細かい鉗子とマイクロアルペルを滅菌します。
   2. アガロース3gを秤量し、バイオセーフティキャビネット内の無菌ビーカーに移す。 3％重量/体積（w / v）の最終濃度のために100mLのDPBSを加える。きれいな磁気棒を入れて、ビーカーをアルミで覆うnum箔。
   3. ホットプレート/スターラーで100℃でビーカーを暖め、120〜200rpmで攪拌してアガロースを完全に溶解させます（溶液は曇りから透明に変わります）。その後、加熱と攪拌を続けてゲル化を防ぎ、必要に応じて加熱温度を変えて、アガロースを燃焼させないようにしてください。
      注記：レーザ切断装置とキャピラリチューブの両方での製造は、下のセクション1.2と1.3にそれぞれ示されています。いずれかのサブセクショ....

Results

マイクロTENNを位相差顕微鏡法を用いてモニターし、細胞構造および軸索伸長を評価した（ 図4 ）。一方向、2mmの長さのマイクロTENN内で、ニューロン凝集体はマイクロカラムの一端に限定され、内部コアを通して軸索の束を投影した。軸索は、 インビトロで 5日間（DIV）カラムの全長に及んだ（ 図4A ）。軸索が3DIV（ 図4B ）でマイクロカラム全体に及ぶので、双方向2mm長のマイクロTENNにおいてより大きな初期軸索成長速度があった。 5DIVにより、双方向マイクロTENNは、マイクロカラムの極端に維持された凝集体を連結する高密度軸索管を特徴とした。この細胞構造は、5-DINマイクロTENNにおいても観察され、軸索は5 DIVによってマイクロカラムに広がっていた（ 図4C ）。すべての場合に観察されるように、内腔のECMおよび幾何学的再刺激アガロースによって提示されたカチオンは、天然の神経解剖学の特徴を構造的に模倣する.......

Discussion

CNS傷害および疾患は、典型的には、付随するニューロン変性の有無にかかわらず、脳結合細胞を含む長距離軸索経路の喪失または機能不全をもたらす。これは、神経新生および再生を促進するCNSの限られた能力によって増強される。個々のまたはコンビナトリアルアプローチとしての成長因子、細胞および生体物質送達などの修復戦略の追求にもかかわらず、これらの技術は、神経細胞の変性および軸索結合の喪失の両方を同時に説明することができない14,22。これらの技術のギャップは、制御された持続的な方法でニューラルネットワークを修復し、変更し、探索する能力を制限する。したがって、マイクロTENN技術は、既存の方法とは対照的に、ニューロンの置換および長い軸索接続の再構築の両方を容易にする神経修復戦略の必要性に対処するために開発された。マイクro-TENNsは、宿主神経回路の標的再構築、置換および修飾のために特別に設計された脳結合細胞のシステムレベル構築ブロックに近づく予め形成された細胞構造を有する移植可能な生体足場である。これらの足場は、小型円柱アガロースヒドロゲルのECM含有管腔内の長い軸索路によって連結されたニューロンの個別の集団から構成される。これらの構築物は、.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
レーザーカッター	ユニバーサルレーザーシステムズ	PLS4.75	レーザーカットされたマイクロチャンネルモールドの製作に使用。
レーザーカットマイクロカラム作製装置	カスタムメイド	--------------	ご興味のある方は当研究室までお問い合わせください。原稿に記載されている寸法と設計図。
ねじ	--------------	--------------	#4-40、ねじ径3.05mm
ナット	--------------	--------------	#4-40、ねじ径3.05mm
鍼灸針(180&マイクロ;m直径)	Lhasa Medical	sj.16X40	直径は、マイクロカラムルーメンの所望のサイズに応じて変更することができます。
ペトリ皿	フィ	ッシャー08772B
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	Invitrogen	14200075
ポリスチレン使い捨て血清ピペット	フィ	ッシャー13-678-11D
アガロース	シグマ	A9539-50G
毛細管(398 µm diameter)	Fisher	21170D	直径は、マイクロカラムシェルの所望のサイズに応じて変更することができる。
ホットプレート	フィッシャー	SP88857200
磁気バー	フィッシャー	1451352
ピペット	シグマ	Z683884-1EA
25mmゲージ針	フィ	ッシャー14-826-49
マイクロメス	ロボズサージカル	RS-6270
はさみ	ファインサイエンスツール	14081-09
鉗子	ワールド精密機器	501985
ホットビーズ滅菌器	シグマ	Z378550-1EA
ステレオスコープ	ニコン	SMZ800N	すべての解剖ステップとマイクロTENN製造に使用されます。
ラットテールI型コラーゲン	コーニング	354236	4ºで維持します。Cを選択し、必要な場合にのみ取り外します。 使用中は氷を使用して温度を保ちます。
マイクロ遠心チューブ	フィ	ッシャー02-681-256
マウスラミニン	コーニング	354232	4ºで維持します。Cを選択し、必要な場合にのみ取り外します。 使用中は氷を使用して温度を保ちます。
神経基礎培地	Invitrogen	21103049	出生前および胚性ニューロン細胞の培養のための基礎培地。4ºで保管してください。Cと37ºで暖かい。使用前にC。
水酸化ナトリウム (NaOH)	Fisher	SS2661
塩酸 (HCl)	Fisher	SA48-1
リトマス紙	Fisher	09-876-18
ハンクの平衡塩溶液 (HBSS)	Invitrogen	14170112	4°Cで保存します。
0.25% トリプシン-EDTA	Invitrogen	25200056	-20 & ordm で保存します。Cと37ºで暖かい。使用前にC。
ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)I	Sigma		10104159001-20ºで保存。Cと37ºで暖かい。使用前にC。
B-27	Invitrogen	12587010	海馬および皮質ニューロンの培養のためのニューロベース培地に添加されたサプリメント。-20ºで保管します。Cと37ºで暖かい。使用前にC。
L-グルタミン	Invitrogen	35050061	-20 º で保存。Cと37ºで暖かい。使用前にC。
Sprague Dawley 胚 18 ラット	チャールズ リバー	001
パスツールピペット	フィッシャー	22-042816
15 mL 遠心チューブ	EMESCO	1194-352099
ボルテック	フィッシャー	02-215-414
遠心分離	機 フィッシャー	05-413-115
血球計算盤	フィッシャー	02-671-6
Objet30 3Dプリンター	Stratasys	--------------	ピラミッド型マイクロウェル金型の作製に使用します。
3Dプリントされたピラミッド型ウェルモールド	カスタムメイド	--------------	興味のある方は私たちの研究グループに連絡してください。原稿に記載されている寸法と設計図。
ポリジメチルシロキサン(PDMS)と硬化剤	フィッシャー NC9285739		ストマーと硬化剤がキットとして付属しています。化学薬品ドラフト内で使用してください。
漏斗	フィ	ッシャー10-348C
1mlピペット球根	グマ	Z509035
マイクロヘラ	フィッシャーS50821
12ウェル培養プレート	EMESCO	1194-353043
	ッシャー11-475-154
キュベーター	フィッシャー13	998 076
AAV1。Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	-80ºC.市販のアデノ随伴ウイルス(AAV)とGCaMP6fカルシウムインジケーター。
ホルムアルデヒド 40%	フィッシャー	F77P-4	ホルムアルデヒドは、発がん性があることが知られている有毒化合物であり、別の容器に廃棄する必要があります。
Triton X-100	Sigma	T8787	細胞膜の透過処理に使用される非イオン性界面活性剤です。
馬の血清	Gibco	16050-122
マウス抗Tuj-1/β-IIIチューブリン一次抗体	Σ	T8578-200UL	-20°Cで保存。
ウサギ抗シナプシン1一次抗体	シナプスシステム	106-001-20	°Cで保存。
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	4°Cで保存してください。
ロバ抗ウサギ 488 二次抗体	Invitrogen	A21206	4°C で保存します。
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	4°Cに保管。ヘキストは、発がん性物質として扱うべき既知の変異原物質です。 したがって、別のコンテナに廃棄する必要があります。
A1RSI レーザー走査型共焦点顕微鏡	ニコン	--------------	免疫標識コンストラクトの共焦点再構成を行うために使用されます。
エクリプスTi-S顕微鏡	ニコン	--------------	位相差像の撮影に使用。Nikon Elements Basic Researchソフトウェア(4.10.01)とインターフェースしたQiClickカメラを使用したデジタル画像取得。
高速蛍光顕微鏡	ニコン	--------------	ニコンエクリプスTi顕微鏡とカルシウムイメージング用のANDOR Neo/Zylaカメラの組み合わせ。
NIS Elements AR 4.50.00 ソフトウェア	ニコンインスツルメン	--------------	蛍光顕微鏡で撮影した記録からカルシウム過渡現象を特定するために使用しました。