筋肉組織を直接液体窒素中に浸漬されたときにアーティファクトを凍結マルチホールクライオバイアルが不要

サマリー

このプロトコルは、液体窒素に直接それらを沈めることにより、筋肉組織を凍結する手順を説明します。このプロトコルはまた、試料の窒素ガス際に液体窒素に接触組織表面の「ブランケット効果」を回避することができ、新たなクライオバイアルを強調しています。

要約

骨格筋生理学の研究は、適切にはっきりと見える細胞質コンパートメントでセクションを取得するために検体を処理する技術的な課題に直面しています。もう一つのハードルは、周囲の組織への筋線維のタイト同格です。組織固定し、パラフィン包埋のプロセスは、筋線維の収縮につながるので、凍結は切片のための筋肉組織を硬化させるのに最適な手段です。しかし、一般的に遭遇する問題、氷の結晶の形成は、理由は筋肉の高含水率の凍結切片の調製の間に発生します。ここで紹介するプロトコルは、最初に適切に液体窒素中でそれらを浸漬することにより、筋肉組織を凍結するための簡単で効率的な方法を説明します。単独で、液体窒素を使用しての問題は、次絶縁体として作用し、組織の冷却を阻害する、組織、窒素ガス障壁の形成を引き起こすことがあります。この「蒸気毛布」効果、NEを回避するために、Wクライオバイアルは、組織表面付近の液体の流れの速度を増大させるように設計しました。これは、バイアルの壁14個の入口穴の総数をパンチングすることによって達成されました。気泡力学によれば、より小さな気泡より少ないチャンスで液体流結果のより高い速度は、ガス障壁を形成します。液体窒素は、入口孔からクリオバイアルに流入すると、組織の周りの流速は、ガス障壁を排除するのに十分に高速です。予め冷却したイソペンタンを用いて、筋肉組織の凍結方法に比べて、このプロトコルは単純で、より効率的であり、スループット様式で筋肉を凍結するために使用することができます。さらに、この方法は、室温で非常に可燃性であるイソペンタン、へのアクセスを持っていない機関に最適です。

概要

骨格筋は、ビューの栄養と処理ポイントから肉を生産する動物の最も貴重なコンポーネントです。筋肉の成長の効率、そして得られた肉の品質：食肉業界では、二つの特に重要な側面があります。筋肉の主成分としては、筋線維は、成長のパフォーマンスと動物¹新鮮な肉質に直接関連しています。例えば、繊維の合計数（TNF）及び繊維の断面積（CSAF）は主に筋肉量と肉の品質を決定します。また、ファイバ型の組成物（FTC）が強く、新鮮な肉質^2に影響^を与えます。したがって、動物における筋線維特性の操作は、農場¹のコア収益性と競争力を高めるために非常に有効な方法です。

現在までに、いくつかの内因性および外因性の要因が筋線維を操作することが確認されているcharacteristICS ^1。この操作は、牛³におけるミオスタチン遺伝子 、ヒツジ⁴ Callipyge遺伝子 、およびブタ⁵ RYR1及びIGF2遺伝子として、特定の遺伝子を有する動物の標的選択によって達成することができます。また、特定のホルモンとダイエットの制御および治療は、筋線維特性⁶において重要な役割を果たしています。このように、遺伝的および栄養要因を組み合わせたアプローチは、赤身の肉の量と肉の品質を向上させることができるかもしれません。筋線維の構造の解明は依然として難題であるしかし、筋線維の研究では、食肉産業に限定されています。

筋肉繊維特性は、ミオシンアデノシントリホスファターゼ（ATPアーゼ）アッセイなどの組織化学的方法を用いて同定されます。この方法は、酵素が薄い（6-8ミクロン）の凍結切片に位置しているという事実に依存しています筋線維は、化学的に特定の製品と反応させることができます。しかし、筋肉の水分含有量にかかわらず位置（ すなわち、バック、腹部、または後肢^）7の、ブタ、ウサギ、マウス、およびヒトにおいて75％以上です。以前に^8,9を説明するように、凍結切片の調製中-成果物を凍結-筋肉のような高水分含有量は一般的に遭遇する問題の原因となります。ほとんどの場合、適切に我々の経験によると、食肉処理場の生産ラインで筋肉組織を凍結することはほとんど不可能です。

ここで紹介するプロトコルは、ハイスループットな方法で凍結切片のための筋肉組織を凍結する私たちの研究室で使用されるシンプルかつ効率的な方法を説明します。この方法のハイライトは、液体窒素中でフラッシュ凍結筋肉組織のために設計された新しいクライオバイアルです。現在のワークフローは、同時に組織を容易にすることができますはっきりと見え、細胞質コンパートメントおよび周囲組織への筋線維の緊密な並置と、優れた筋肉凍結切片のために凍結して処理。液体窒素は、組織と混合しないので、また、このプロトコルは、組織分析のためのオプションの広い配列に適用することができます。

プロトコル

現在の方法が確立され、私たちの研究室で組織染色のために1,000人以上の筋肉サンプルを収穫し、保存することが確認されています。動物のケアと使用を含むすべての手順は、中国の農業省によって確立されたガイドラインに従いました。

サンプル採取のために1.機器

1. 各極低温バイアル上のサンプルのアイデンティティにラベルを付けます。
   注：極低温バイアルを特別に凍結切片手順（ 図1A）のために、新鮮な組織サンプルを凍結するように設計されています。バイアルを金型工場（ 図1C）にポリプロピレンで作られています。
2. 適切な液体窒素タンク内の液体窒素、安全眼鏡、またはフェイスシールド、冷凍手袋、10cmの鉗子25センチピンセット、発泡スチロールのクーラー（内寸：20センチ×12センチ幅X 13.5センチメートル高い次の装置を得ます;外形寸法：幅×15センチメートル上位24センチ×16センチ）、プラスチックフィルム（幅×厚さ0.1mm長さ2.5cm×0.8 cm）で、メス、及びA4 PVC結合カバー（21センチメートル29.5センチX）（ 図1B）。

筋肉試料の調製

1. 先にサンプル収集の液体窒素を5分で発泡スチロールのクーラーを記入してください。
   注：液体窒素の一部が離れて沸騰し、新鮮なサンプルがそれに触れるとガスに変わるので、液体窒素の大きな柱が不可欠です。損失を補充する液体窒素の移送の頻度を低減するために、適切なサイズの発泡スチロールのクーラーは、サンプルの数に応じて予め取得されなければなりません。
2. 試料が得られたら、優しくA4 PVC結合カバーの上に置きますし、筋線維の方向を観察します。
   注：ここでは、豚の最後の腰椎に最初から最長ドリス筋の断面を使用しました。標本は約12センチ、長さは8センチ幅、5センチの高さです。
3. 試料Iを介して2つの平行切開を作るためにメスを使用N筋繊維の方向、長さが約3cmと0.6センチメートル離れ。約0.6センチ幅×0.6センチメートル1.5×高cmの長さの長方形に切開筋肉をトリム。
   注：筋線維の断面積を測定の信頼性は、主に切開筋肉の繊維配向に依存します。
4. 穏やか膜（ 図2A）の長辺に切開筋平行の長手方向軸と、プラスチックフィルムの一片上に試料を置くために10cmの鉗子を使用しています。
   注：筋線維の配向性と急速な凍結試料中のクラックを防止する接着機能を固定するのに役立つ保持機能：プラスチックフィルムは2つの機能を有しています。
5. 鉗子を使用して、ちょうど入口穴との間、標識された極低温バイアルの下部中央に筋肉組織を配置し、その後しっかりバイアル（ 図2B）をキャップ。

3.筋肉サンプルを凍結して保存しますS

1. 25センチメートルピンセットを使用して、迅速に液体窒素（約10~20秒）沸騰しなくなるまで待って、予め冷却した発泡スチロールのクーラーに液体窒素中で全体極低温バイアルを水没。
   注：凍結バイアルを液体窒素が沸騰しているとき、慎重に10〜20秒間、沸騰液体窒素中でバイアルを浸すフロートします。
2. 液体窒素貯蔵タンクや長期保存のために-80℃の冷凍庫に筋肉のサンプルを転送します。

4.スライドの調製

1. -20℃と-22℃の間にクライオスタットを予冷。
2. 取り外し、古いミクロトーム刃を破棄し、クライオスタットでナイフホルダーとアンチロールプレートを拭う、クライオスタットの新しいミクロトーム刃をインストールして、8ミクロンに切断厚さを設定します。
3. 液体窒素貯蔵タンクから極低温バイアル中に筋肉のサンプルを転送するか、-80℃の冷凍庫°クライオスタットに、液体窒素中またはドライアイスの上にそれを運びます。
4. 試料はクライオスタットの温度と平衡に30分待ちます。
   注：高い温度は、試料中の氷結晶の形成を引き起こす可能性があるため、標本に触れる可能性のある機器は、事前に冷却しなければなりません。
5. 水溶性グリコール及び樹脂（OCT）の最適切断温度製剤下試料ホルダーに試料をマウントします。 8-μmのセクションをカット。
   注：CSAFは、筋線維の断面積であるため、筋線維の配向に垂直に切断角度を調整します。
6. 室温マイクロスライドの中心に向かってセクションをマウントします。すぐに-80℃の冷凍庫でスライドボックスにスライドを置きます。スライドを室温で乾燥させないでください。

結果

クライオバイアル例示および凍結切片の調製の間に筋肉を凍結するための一般的な実験装置は、 図1に示されています。クライオバイアルは、金型工場にポリプロピレンから作られます。各バイアルは、14の入口孔の合計を持っている：一つはキャップ上にあります。別のは一番下にあります。残りの12形成する4本の平行線、互いに90°の4つの穴とそれぞれ。これらの入口穴は、場合「蒸気ブランケット」効果液体窒素に接触組織を回避するために、次の組織に液体窒素の流速を速めることができます。その結果、非常に少数の氷の結晶が凍結サンプルで形成します。重要なことには、イソペンタン、28°Cでの沸点を有する極めて揮発性及び可燃性の液体が、この手順で必要ではありません。

さらに、この方法の利点を強調するために、我々は最長dorsi筋を凍結しましたブタで5つの凍結方法を用いて、次いでその染色特性、ヘマトキシリン/エオシン（HE）染色（

ディスカッション

ここでは、筋機能の組織学的評価を行うために筋肉組織を凍結保存するための新しい、マルチホールクライオバイアルを記述する。このプロトコルにおいて重要な変性ステップは、マルチホールクリオバイアルに試料を直接液体窒素中に浸漬することです。我々の知る限り、これは既存の凍結方法のうち、筋肉凍結切片のための優れた凍結サンプル（代表的な結果を参照）を取得する最も簡単かつrapidest方法です。

筋肉の研究者が直面する技術的課題は、氷の結晶が区画する筋肉組織を強化する手段として凍結使用しているとき形成する可能性が最も高いということです。代表的な結果で述べたように、3つの要因が、適切な冷却源を選択する試料の水分を最小限に抑え、かつ冷熱源と接触して全表面のパーセンテージを増加させるなどの病理学的研究のための適切な筋肉の凍結を決定する際に重要な役割を果たしています。最初、凍結の割合は、区画する凍結組織の準備中に損傷を避けるために重要です。凍結が遅い場合には、大きな氷の結晶が細胞外に形成されているので、凍結された筋肉は、よく知られた「スイスチーズ」効果を示します。凍結が十分に速い急速ではない場合は、小型、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
クライオスタットミクロトーム	ライカ	ライカ CM1950
デジタルマイクロスコープ	ニコンニ	コンDS-U3
極低温バイアル  プラスチックフィルム			自発的にデザイン
液体窒素			一般使用
			一般使用
10cm鉗子			一般使用
25cmピンセット			一般使用
安全ガラス			一般使用
冷凍手袋			一般的な使用

された メス