アガロースゲル遅延アッセイによるtRNA（UUU）の産生および酵素TcdAとの複合体におけるtRNA（UUU）の分析のためのプロトコールが提示される。
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この記事について
サマリー
要約
本発明者らは、 大腸菌における tRNA（UUU）の発現および精製のための方法およびtRNA（U6U）脱水酵素であるTcdAへのtRNA（UUU）の結合のゲル遅延アッセイによる分析を実証し、トレオニルカルバモイルtRNAのアンチコドンステムループ（ASL）においてA37に結合した側鎖を環状t 6 A（ct 6 A）に変換する。 tRNA（UUU）をコードする合成遺伝子の転写は、1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いて大腸菌で誘導され、tRNAを含む細胞は誘導24時間後に収穫される。 RNA画分は酸性フェノール抽出法を用いて精製する。純粋なtRNAは、小型のtRNA分子をより大きな無傷または断片化核酸から効率的に分離するゲル濾過クロマトグラフィーによって得られる。 tRNA（UUU）へのTcdA結合を分析するために、TcdAをtRNA（UUU）と混合し、4℃で天然アガロースゲル上で分離する。遊離tRNA（UUU）はより速く移動し、TcdA-tRNA（UUU）複合体はゲルの染色時に観察される移動性遅延を受ける。我々は、TcdAがtRNA（UUU）結合酵素であることを示す。このゲル遅延アッセイを用いて、TcdA突然変異体および添加剤および他のタンパク質が結合に及ぼす影響を研究することができる。
概要
ゲル遅延アッセイ1 （電気泳動移動度シフトアッセイ、EMSAとしても知られている）は、タンパク質 - 核酸相互作用を研究し特徴付けるために設計された電気泳動法である。これは、精製された成分またはタンパク質（ 例えば 、細胞溶解物）または核酸（ 例えば 、tRNA）の複雑な混合物のいずれかを用いて、タンパク質-DNAならびにタンパク質-RNA相互作用ならびに特にtRNAとtRNA結合タンパク質との相互作用の分析を可能にするプール）。本発明者らは、精製tRNA（UUU）とアンチコドンステムループ（ASL）においてA37に結合したトレオニルカルバモイル側鎖を環化するN 6 -トレノニルカルバモイルアデノシン（t 6 A）デヒドラターゼであるTcdAとの相互作用の研究にゲル遅延アッセイを適用した。 tRNAの環状t 6 （ct 6 A） 2への変換。 TcdAはCsdL 3としても知られており、tcdA / csdL遺伝子は、 csdAおよびcsdE遺伝子5を有するクラスターを形成し、システインスルフリナーゼ脱硫酵素（CSD）系のシステインデスルフラーゼおよび硫黄受容体をコードし、 インビボで TcdA機能を維持する必要がある3 。
ゲル遅延アッセイの背後にある論理的根拠は、遊離核酸分子は、その大きな負電荷のためにアクリルアミドまたはアガロースゲルの前面に迅速に移動するが、同じ核酸のタンパク質複合体の電気泳動移動度は劇的に減少するということである。移動度の減少は、核酸 - タンパク質複合体における「シフト」として視覚化され、これは別個のバンドとして解決する。正に帯電した、より大きな核酸 - タンパク質複合体は、ゲル上の移動度のより大きなシフトまたは減少を示す。
複合体の電荷中和は普遍的な現象であるためタンパク質 - 核酸複合体については、ゲル遅延アッセイを広範囲の複合体および核酸型に適用することができる。この方法は、単純で安価であり、最小限の設備で実験室で実施することができる。少量のタンパク質とtRNAしか必要としません。これは、通常はより多くの量の試料を消費する代替的な生物物理学的技術に対して利点である。
ゲル遅延アッセイは、転写因子の研究に広く使用されている。アッセイは、多くの異なるDNA配列の転写因子の結合動力学、強度および特異性を分析するために用いられてきた。この分野では、EMSAが最初に開発されたのは確か6,7であった 。 RNA 8,9,10,11およびtRNA分子を用いたゲル遅延アッセイもリボソーム研究に用いられている我々がここで行ったように、転写後にtRNAヌクレオシドを修飾する酵素を分析することである。
多くの異なるパラメーターが、温度、タンパク質およびtRNAサンプルの品質、および結合の強さなどのゲル遅延アッセイの結果に影響を及ぼす。実験の慎重な計画と実行は、遊離核酸とタンパク質結合種の結果の解釈にとって非常に重要です。ここでは、プロモーターがShine-Dalgarnoリボソーム結合部位を欠く発現ベクターにクローニングされたtRNA（UUU）をコードする合成遺伝子を使用し、大量のtRNA 2の合成を導く。この詳細なプロトコールは、一般的なミスを避けながらtRNAゲル遅延実験を行うための明確なガイドを提供することを意図している。
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プロトコル
注意：使用前に関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。このプロトコルで使用される化学物質のいくつかは有毒で腐食性があります。ヒュームフードや個人用保護具（安全眼鏡、手袋、ラボコート、フルレングスのズボン、閉じたつま先の靴など ）の使用を含む、フェノールを使用してtRNAの抽出を行う場合は、適切なプラクティスを使用してください。このプロトコールは、毒性のない核酸染色を使用する。代替染色の使用は、毒性および/または発癌性（ 例えば 、エチジウムブロマイド）の場合には、染色剤の追加の予防措置および特殊処分を必要とすることがある。
1.アガロースゲルの調製
- 2gのアガロースを秤量し、ガラス瓶に加えて2％w / vアガロースゲルを調製する。
- 100mLの1×トリス - ホウ酸塩 - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（TBE）ランニングバッファーをアガロース含有ボトルに加える。電子レンジで加熱して溶かします。 30秒間隔で、内容物を旋回させて混合するアガロースが完全に溶解するまでこのステップを繰り返す。アガロース溶液を約50〜60℃に冷却します。
- 金型を作成するためにゲルトレーの開口部をテープで覆い、適切な櫛を配置してウェルを作り、溶融したアガロースをその中にキャストします。気泡の形成を避け、室温で凝固させる。
- 固化したら、ゲルトレーを電気泳動装置に入れ、ゲルが完全に覆われるまでTBEバッファーで満たします。
tRNAの調製
- 大腸菌におけるExpress tRNA（UUU）
- 午前中、発現ベクターpET23d-EcUUU 2 （ 大腸菌 tRNA（UUU）をコードする遺伝子を有する）で形質転換した凍結大腸菌 BL21（DE3）のバイアルを使用して、低塩Luriaブロス（LB）プレートに100μg/ mLのアンピシリンを補充した。コロニーが現れるまでプレートを逆さにして37℃のインキュベーターに入れてください（遅い午後oon）。
- よく増殖した単一コロニーを5 mL LB + 100μg/ mLアンピシリンに接種し、37℃で220 rpmで一晩増殖させます。
- 翌朝、細胞をペレット（4℃で10分間6,500 xg）し、培地を5 mLの新鮮なLB + 100μg/ mLのアンピシリンで置き換え、再懸濁する。この懸濁液を使用して、200 mL LBプラス100μg/ mLアンピシリンに接種します。 37℃、220rpmで5時間増殖させる。
- 590nm（OD 590 ）の培養物の光学密度が0.6〜0.8に達したら、tRNA（UUU）遺伝子の発現を誘発するために1mM IPTGを培養物に添加する。 37℃で3時間インキュベートする。
- 培養物を6,500 xgで10分間4℃で遠心分離して細胞を収穫する。
- 溶解および抽出
- 細胞ペレットを5mLの溶解緩衝液（0.3M酢酸ナトリウム、10mM EDTA）に再懸濁する。この時点以降、オートクレーブしたバッファーを使用し、4℃ですべてのtRNA含有サンプルを保持してtRNA分解。
- ヒュームフード内の再懸濁した細胞ペレットに1容量の酸性フェノール（pH 4.3）を加える。逆に1分間混合して細胞を溶解し、10,000×g（10分間、4℃）で遠心分離する。
- 有機（底）相を吸引しないように注意して、ピペットを用いて可溶性tRNA（UUU）（および他のtRNAプールのより小さい濃度）を含む上部の水相を集める。下層と、有機相と細胞破片からなるペレットを適切な容器に捨てる。
- 可溶性（水性）相を2.5体積％100％v / vエタノールと4℃で1時間徹底的に混合してtRNAを沈殿させます。混合物を15,000 xgで遠心分離する（30分、4℃）。
- 上清を注意深くデカントし、4mLゲル濾過バッファー（20mMリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム、pH7.4,0.1mM EDTA）にtRNAに富むペレットを再懸濁する。再懸濁したtRNAプール5μLを2％w / vアガロースゲル上で実行する。
注意：良質のtRNAは、単一バンド（50〜100bpの間の分子サイズ）として現れる。
- tRNA（UUU）の精製
- 標準的なクロマトグラフィーの実践12に従って、予めゲルろ過緩衝液中で平衡化した高解像度分取ゲルろ過カラム（寸法：16×600mm、ベッド容量：120mL、解像度範囲：1,000〜70,000Da）に再懸濁したtRNA（UUU） （移動相）。サンプルを溶出するために流速を1 mL / minに設定します。
注：tRNA（UUU）ピークは約75.5 mLで溶出します。典型的には、培養物の0.5〜1.0mg / LのtRNAの収率が得られる。 - 2％w / vアガロースゲルで5〜10μLの各サンプルを電気泳動することにより、代表的な溶出量でサンプルを分析します。
- 標準的なクロマトグラフィーの実践12に従って、予めゲルろ過緩衝液中で平衡化した高解像度分取ゲルろ過カラム（寸法：16×600mm、ベッド容量：120mL、解像度範囲：1,000〜70,000Da）に再懸濁したtRNA（UUU） （移動相）。サンプルを溶出するために流速を1 mL / minに設定します。
試料調製
- ロペス - エステパ（ Lopez-Estepa） らによる TcdAの発現および精製。 2 。
注：250μMまでTcdAを研究に使用することができる。 - 表1の対応する量のTcdAを適切に標識された1.5mL遠心分離管にピペットで入れる。 1.6mMのトリス （2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）（最終濃度）を添加し、ピペットを用いて穏やかに混合する。蓋を閉め、混合物を室温で5分間インキュベートする。
- 10μMのアデノシン三リン酸（ATP）および50mM MgCl 2 （最終濃度）を加える。ピペットで混合し、混合物を室温で5分間インキュベートする。
- 表1に従って精製tRNA（UUU）（セクション2.3）を加え、ピペットで混合し、室温で5分間インキュベートする。
- リン酸緩衝食塩水（PBS）を最終容量100μLまで添加する。適切に混合し、10％v / vの最終濃度にグリセロールを加える。
- サンプルをボルテックスし、チューブの内容物を短時間スピンダウンします（10,000 xg、1分、4℃）。
4.ゲルローディングと電気泳動の開発
- 泳動中にチャンバーを4℃に維持するために砕氷で満たされたトレーに電気泳動ユニットを置く。
- 慎重に、5μLの各サンプルを対応するウェルにピペットで移す。適切なDNAサイズマーカーを加える。
- 電極を電源ユニットの対応するスロットに差し込みます。電源装置の電源を入れ、電圧を100Vに設定し、ゲルを90分間流します。
5. tRNA-タンパク質相互作用を観察するためのゲル染色
- 1mLの適切なDNA染色液と50mLのTBEを混合することによって染色溶液を調製する。汚染容器をアルミニウム箔で覆うことにより、汚染溶液を日光にさらさないようにしてください。
注：DNA染色は、通常10,000または20,000倍濃縮ストックとして保存されます。 - 電気泳動の90分後、慎重にトレーからゲルを取り出し、染色溶液を入れた容器に入れる。室温でロッキングスピードの速いロッカーに置きます30分間放置する。
- 染色容器からアガロースゲルを取り出し、余分な液体を取り除くためにセルロース組織または濾紙上に注意深く叩いて、トランスイルミネーターの上に直接置きます。 UV光を入れて、tRNAを含むバンドを可視化する。ゲルの写真を撮る。
- タンパク質染色（オプション）。
- 安全にDNA染色液を捨て、50mLのクーマシーブリリアントブルー（CBB）溶液で置換する。トレーを室温でロッカーに置き、一晩（> 12時間）染色する。 CBB染色溶液を捨て、余分な色素を除去するために50mL PBSで置換する。ロッカーで1時間デスティネーションしてください。
- 軽質トランスイルミネーターでタンパク質を含むtRNA複合体を視覚化し、ゲルの写真を撮ってtRNA UVゲル画像と比較します。
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結果
大量のtRNA（UUU）は、強力な誘導性T7プロモーターの制御下で大腸菌でtRNA遺伝子を発現させることによって得ることができる。発現されたtRNA（UUU）は、細胞質に蓄積し、天然に豊富なtRNAのプールに富む。 EMSAグレードのtRNAを得るために、捕獲/抽出工程およびゲル濾過/研磨工程からなる2段階精製プロセスを利用した。捕獲/抽出工程は、タンパク質、細胞破片、DNA、およびtRNA（および他のRNA分子）の抽出の同時沈殿を達成するためにpH 4.3のフェノールを使用する。この段階で、全tRNAプールの量は、2％w / vアガロースゲル上での電気泳動によって評価することができる。第2のステップは、分子種に応じてRNA種を分離するゲルろ過クロマトグラフィーを組み込む。 254 nmでのUVトレースを使用して分離をモニターし、主要な溶出ピークを同定します（ 図1上）。ピーク画分の代表的なアリコートを分析のために2％w / vアガロースゲル上に流した（
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ディスカッション
本明細書に記載のタンパク質-tRNAアガロースゲル遅延アッセイは、多くの方法で変更することができる。第1に、ゲル中のアガロースの割合を減少させて、ここで分析したもの（120kDa）よりも有意に大きいタンパク質-tRNA複合体の分離および可視化を可能にすることができる。第2に、標的タンパク質が熱不安定性である場合、電気泳動装置を冷たい部屋に移動させるか、電気泳動室内の氷パックを使用して生成された熱をすぐに消散させることにより、温度が最大許容温度未満に保たれるように、実行中。他の緩衝液組成物（ 例えば 、0.5X TB、トリスホウ酸塩）およびランニングパラメータ（> 20V / cm）は、必要であればランタイムを短縮するように改変することができ、サンプル11に対して許容可能である。示唆されたMgCl 2濃度は、試料調製工程の間にRNA分解が観察される場合に減少され得る。なぜなら、2価のcati潜在的に核酸の切断を触媒することができる。
この技術の主な制限は、タンパク質-tsRNAのバンドが...
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開示事項
著者は何も開示することはない。
謝辞
MCVはCIB教室プログラム「分子生物学（MACBET）」のメンバーです。これらの成果を導く研究は、スペイン競争力のある経済大臣賞（CTQ2015-66206-C2-2-RおよびSAF2015-72961-MCVへのEXP）であるSalut Carlos IIIスペイン研究所（PI12 / 01667からMCV） ）、マドリード地方政府（S2010 / BD-2316〜MCV）、欧州委員会（フレームワークプログラム7（FP7））プロジェクトComplexINC（MCVへの契約番号279039）資金提供者は、研究デザイン、データの収集と分析、出版の決定、または原稿の作成に何の役割も持たなかった。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 大腸菌 BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogenは、IPTG誘導時にT7ポリメラーゼを含んでいます。 |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23dはアンピシリンに対する耐性を与えます。T7プロモーター。 |
| LBブロス、ローソルト(レノックスLブロス)、粒状 | メルフォード | GL1703 | 従来のLBブロス、ハイソルトも使用できます。 |
| アンピシリン | シグマ アルドリッチ | 10419313 | |
| インキュベーター シェーカー (サーモステート) | NBS | Excella E24 | 温度制御付きのシェーカーインキュベーターであれば、どれでも使用できます。 |
| イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)、>=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| 酢酸ナトリウム、無水、>99% | メルフォード | B4017 | |
| エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、二ナトリウム塩、>99% | Acros Organics | AC327205000 | 吸入すると有害です。 |
| 遠心分離機(冷蔵) | Eppendorf | 5430 | |
| 遠心分離機(冷蔵)ローター | Eppendorf | 5430/5430P | |
| 遠心分離機 | Sorvall | RC5C | |
| 遠心分離機ローター | Sorvall | SLA-3000 | |
| フェノール溶液、0.1 M クエン酸緩衝液、pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | 急性毒性(経口、経皮、吸入)、 |
| 分析用腐食性エタノール絶対、100%v / v | クミリポア | 100983 | |
| リン酸ナトリウム二塩基性二水和物、Na2HPO4、>= 99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| 二水素カリウム、KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| ハイロード 16/60 スーパーデックス 75 | GEヘルスケア | 28989333 | |
| アガロース | メルフォード | MB1200 | |
| トリス [トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸] | メルフォード | T1513 | |
| ホウ酸 | メルフォード | B0503 | |
| マイクロ波 | ハイアール | HDA-2070M | |
| TCEP [トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩] | シグマ・アルドリッチ | C4706 | 金属や皮膚を腐食します。 |
| ATP [アデノシン 5′-三リン酸二ナトリウム塩水和物]、グレード I、>=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 塩化マグネシウム (MgCl2)、無水、>=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 塩化ナトリウム (NaCl)、>99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| 塩化カリウム (KCl)、>99% | メルフォード | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| 電源 | Consort | EV261 | |
| 電気泳動ユニット | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe 核酸染色 | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X ストック |
| UV トランスイルミネーター (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant BlueG | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| ロッカー (ジャイロロッカー) | Stuart | SSL3 | |
| ミキサー ボルテックス | フィッシャーブランド | 13214789 |
参考文献
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606(2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
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- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
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再版と許可
