マウスの膵臓の組織学的解析と代謝プロファイリングに対する郭清

サマリー

このビデオの記事は、組織学的解析と代謝プロファイリングに対する郭清によってマウスの膵臓を正常に削除に必要な手順の詳細なデモを提供します。

要約

膵臓特定のトランスクリプション要因、1 a cre リコンビナーゼ; を調査しています。lox 停止-lox クリステン ラット肉腫、12 のコドンでアスパラギン酸グリシン (Ptf1a^cre/+;LSL-Kras^G12D/+) ヒト膵癌のモデルとしてのマウスのひずみ。私たちの現在の研究の目的は、膵臓癌の進行の新規代謝マーカーを識別するためにです。尿、糞便、血液、膵臓組織の抽出物と癌の進行を舞台に膵臓の組織学的解析のメタボリック ・ プロファイリングを行った。マウスの膵臓人間のような明確に定義された固形臓器ではなく、むしろ簡単にマウス内部解剖学になじみのない個人またはほとんどまたはまったく経験を実施して個人識別はないびまん性分散軟部組織マウス臓器の解剖。この資料の目的は、詳細な測定を提供する郭清によりマウスの膵臓の除去には初心者を誘導する視覚的なデモ。この記事は特にメタボリック ・ プロファイリングまたは組織学的解析のため郭清によってマウスの膵臓の収穫が必要研究に学生や新しい研究者に貴重なする必要があります。

概要

マウスはヒト膵癌^1,2の重要な動物モデルとして登場しました。Ptf1a^cre/+;LSL Kras^G12D/+マウス モデル、クリステンの膵臓、膵上皮内テロメラーゼ (PanINs)、その進歩と呼ばれる、膵臓の病変の開始に終って専らラット肉腫 (K ‐ Ras) 遺伝子が有効膵膵管癌は、一般的には PDACs³と呼ばれます。このマウス モデル システム、ヒト膵癌^4、5生活や頻繁に PDAC に進捗状況の最初の 5 ヶ月以内、PanINs が出てくる追加の利点の最高の動物モデルの 1 つ、単一の年^4、560-70 歳が人間の膵臓癌が最もよく起きるに対し。

Ptf1a から郭清による膵臓抽出^cre/+;LSL Kras^G12D/+パニン ・早期から進行 PDAC^3,4まで様々 な年齢でのマウスは、膵臓癌の開発の詳細縦断的組織学的検討^,5. 5 個から 15 ヶ月に至るまでの年齢層で膵臓の収穫も、準備組織健康から病気にかかったティッシュ^{への移行中に発生する膵4代謝の世界の変化の特徴を抽出する使用ことができます6,7}。

この記事では、マウスの膵臓領域抽出の実行に必要な手順の完全な視覚的なガイドを提示し、膵臓がさらなる分析のための保存のためのガイドラインを提供します。個人を含む、その他の膵疾患の研究を行って I 型糖尿病、特に学生やマウスの膵臓を使っての収穫を含む研究に新しい捜査に役に立つはずのこのガイドは均等に貴重になりますメタボリック ・ プロファイリングまたは組織学的解析の郭清。

プロトコル

ビデオで実施および下記の手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) マイアミ大学によって承認されている

。

1。 準備と刺激テスト

手術、手術台、事後操作テーブルの

1. 確立する 2 つの明瞭な区域。すべての材料と必要な道具と両方のエリアをステージします。 出されたボンネットの下
   1. ステージ オペレーティング テーブル。プロシージャの継続的かつスムーズなパフォーマンスを可能にする方法で装備テーブルを配置します
   。
   2. は、同じ部屋および操作のメイン テーブルの近くで術後テーブルを確立します。プロシージャ全体で生殖不能の環境として、両方のテーブルを保持します
   。
2. 次の場所は、オペレーティング テーブルの上供給: 蓋、1 つ 15 mL チューブ、手術用はさみ、70% エタノール、2 つの発泡ボード、2 つの鉗子、シリンジ 1 mL 21 ゲージ、2 つの 50 mL チューブ、1 つ遠心分離機管の 1 つのスクイズ ボトルの 1 つのペアを 1 つのガラスの瓶、1 つのセラム、4 外科パッド、10 ピン、殺菌ワイプのディスペンサー、シャープス コンテナーします。
3. は、後の操作テーブルの上次の消耗品を配置: 1 つ分析的なバランス、液体窒素、浅いワイド 4 L デュワー口デュワー、フローティング チューブ ラック、外科はさみのペアを 1 つ、2 つの鉗子、4 つのセラム チューブのディスペンサー 1滅菌ワイプします
。
4. ホルマリンで 1 つ 50 mL と 75% のボリュームに 1 つの 15 mL チューブを入力します
。
5. 郭清ボードとしておおよそ 30 cm × 30 cm 発泡ボードに 1 つの外科パッドを貼る各コーナーで pin を使用します。操作中に残りの 4 つのピンを使用します。臓器を手術後テーブルに転送する外科パッドで小さい発泡ボードを準備します
   。 注意: イソフルラン (99.9%) は、有毒化学物質、排出される麻酔ガス ⁸ の清掃から安全性の最大レベルを確保するため口のフードで使用する必要があります。イソフルランを使用してオープン アンド ドロップ メソッドを使用してに関連付けられている研究者へのリスクに関する追加情報がテイラーとムック ⁸ 記事
。
6. はガラスの瓶にイソフルラン (99.9%) を数滴に浸す外科パッドを配置し、マウス、イソフルランとの直接接触を防ぐために、上にペーパー タオルを配置します。同様に、残りの管ライン、イソフルランを数滴で吸収し、マウスと、イソフルランとの直接接触を防ぐために上に追加のパッドを配置する外科パッドを使用します
。
7. 注ぐ液体窒素デュワー最大行を埋めるまでに達する浅い広口にします
。
8. マウスの麻酔に郭清のために選択の場所の部屋の すなわち 〜 1 分のふたで覆われてイソフルラン (99.9%) のいくつかを浸したパッド付きのガラス瓶が値下がりしました
   注: 今回は、マウスから異なります。マウスが意識、商工会議所から削除し、操作盤の上に配置します
。
9. は、科学者から離れて指摘した頭と、腹側が横たわっているようにマウスを合わせます。イソフルラン (99.9%) の数滴を浸した外科パッドとライニング管の頭を置き、マウスの刺激に対して反応されるように足ピンチして刺激テストを実行します。
   1. 場合は、このテストは失敗し、足ピンチ テストに対するマウスの応答、手順 1.8
   。

2。初期の切開、心臓穿刺、安楽死

1. 手術の発泡ボードにマウスの四肢をピンし、70% のエタノールでマウスの腹側をウェットします
。
2. は、ピンセットで尿道口近くの毛皮をピンチし、若干上向きに引き出します。腹腔正中線を尿道口から始まって、あごで終了を手術用はさみで切開を行います。
   1. 鉗子で毛皮の皮の 1 つの側面をつかむ最初の切開部の開始の点の近く、別の切開はさみで下方と斜めに背中足に向かってします
   。
   2. は、反対側に同じ方法でこれを繰り返します
      。 注: 毛皮の皮より広い開口部を作成する可能性がありますにピンを必要はありません
   。
3. 心を確認し、注射針の目詰まりを避けるために、心臓の周りの膜である心膜を取り外します。
   1. は、鉗子で心膜をつかんで、はさみでカットします。慎重に鼓動する心臓に注射針を挿入して心臓穿刺を行い、ゆっくりとピストンを撤回する開始します
   。
   2. 最適な採血、心臓のポンプ作用を模倣し、あまりにもすばやく描画を避けるために針のプランジャーを使用します
      。 注: 通常約 1 mL の血液を収集することができます
   。
   3. 血のコレクションを完了すると、遠心管とシャープス コンテナーにシリンジの処分に血を払拭します
   。 中心部を接続する添付ファイルを削除することによって安楽死実施
   4. 心臓穿刺の実行後です
      。 注: ヘパリン、抗凝固剤は、この特定における血清コレクションの凝固する血を許可する心臓穿刺する前にこの手順で注射器に追加されませんでした。しかし、研究者は、プラズマを収集するために血液凝固を防ぐために場合は、ヘパリンに追加でした心臓穿刺前にシリンジします
   。
4. 研究には、マウスの遺伝子型が含まれている場合耳の部分をハサミでチョキンし、遺伝子型検証用遠心管に配置します

。

3. 膵臓領域抽出

1. マウスの左側にある胃を検索します。優しく (避けるために引き裂く) 開始 2 つの鉗子を使用して胃と十二指腸と膵臓を切り離すします
   。 注: 胃や腸から膵臓をデタッチする際、非常に重要な臓器から膵臓組織をガイドしていない粉砕したり、鉗子で膵臓を引き裂く優しく鉗子を使用は。
   1. 小腸の空腸および回腸のセクションから膵臓を分離し続けると最後に大腸の盲腸から
   。
2. 、盲腸で鉗子を再配置および直腸に向けて残りコロンに沿って膵の分離を続行します
   。 注: この時点ではカットし、胃から結腸、直腸の直前の領域部分を削除すると便利です
。
3. 膵臓と脾臓を添付します。マウスの右側に向かって膵臓をスライドさせます。隣接脾臓と膵臓を完全にデタッチする鉗子で膵臓と胸腔内の残りの関係を区切ります
。
4. は、膵臓を外し、検査のためにそれを広げ。識別目的のため膵臓に接続されている脾臓を残します。
   1. 削除すべて結合組織、膵臓からの脂肪および腸間膜の組織
      。 メモ: この組織は色白く、こうして色でピンカーは、膵臓の組織から簡単に区別することができます。これは、膵臓を全削除する必要がある場合に特に重要です。たとえば、膵臓が圧迫され、体重と動物のグループ間比較する必要があります。Ptf1a ^cre/+;LSL Kras ^G12D/+ マウス モデル古いヶ月で特に硬線維性膵組織が存在する可能性があります。この場合、腫瘍組織で腸がインター レースにすると膵臓を慎重に除去を実施する必要があります。高度な場合は、異常な脾臓と肝臓組織もあるかもしれない
   。
5. 必要に応じて、この時点で他の臓器を削除します

。

4 データの収集とストレージ

1. 臓器の抽出後、サンプルを保全のため術後のエリアに移動します。
。
2. 各器官の重量を量るし、彼らのそれぞれのセラムにそれらを配置します
   。 注: ウィットに沿ってh 質量今後の参考のため、各サンプルの任意の不正を記録すべきです
。
3. 器官の重量を量ったが、一度スナップ凍結用液体窒素にそれらを配置します
。
4. 凍結、スナップ後長期保存用-80 ° C で臓器を格納します
。
5. は一晩、ベンチ上ホルマリン保存サンプルを配置し、次の朝は 70% エタノールにホルマリンからのソリューションを変更します
   。 注意: これらのサンプルは、長期保存のための 4 ° C で保存する必要があります
。
6. 長期保存、凍結-80 ° C で血と耳パンチ。血液から血清コレクション、30 分の凝固し、それを遠心血液を許可します。ピペットを使用して血清部分を削除し、-80 で格納 ° C

5。クリーンアップ

殺菌ワイプ

1. サニタイズすべての解剖ツール。キャップ、イソフルランの管は手術パッドを浸した。新鮮な外科パッドと発泡ボードの外科パッドを交換してください。処分施設ごと採取されなかったマウスの部分 ' s 動物処分ポリシー
。

結果

図 1動作環境領域の概要については、図 2のポスト操作領域を示しています。この設定は、機器の最小限の量を提供します、ステージング、個人はこの個々 のニーズに合わせて変更することができます。プロトコルは実験の特定のニーズに合わせて最適化する必要があります。この手順は、マウスの適切な euthanization⁹を必要とする生活を終了する方法で行われています。研究者は、準備ができて、マウスはイソフルラン浸したパッド (図 3) と麻酔室に配置されます。

マウスが意識、マウスを削除し、基板の背側に配置。つま先ピンチ手順を実行して、マウスが (図 4) の痛みに敏感であることを...

ディスカッション

既存のメソッドの意義
マウス解剖の他の非公式の動画が存在している間このビデオ説明が最初のプロの品質、査読、郭清^{10 でマウスの膵臓の収穫抽出に必要な詳細な手順のすべての視覚的なデモ}.代謝とインスリンの主な器官をされている膵臓に生産、郭清と膵の収穫を生理的特性¹¹の保存のためことができます。膵臓を分離することによって、サンプルの将来の分析を行うことができます。この手順は、比較と同じ時間枠の内で同じ生体内の他の組織からの相互作用の研究。

技術の限界
このプロシージャの最大の制限は、マウスの生命、縦コレクションを防ぐと同じマウスから複数の組織サンプルのサンプリングの終了です。断面人口は年齢、性別、または他の量指定子の動向を分析するためには実装する必要が膵臓癌の代謝性バイオ マーカーの研究を行った。このプロトコルのもう一つの制限は、プロシージャを一時停止することができないことです。Euthanization が開始さ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ガラス瓶	Corning	3140-150	ビデオで使用しているガラス瓶は製造中止になりました。 これはその代替品です。
ガラス瓶の蓋	Corning	9985-150	動画で使用しているガラス瓶の蓋は製造中止になりました。 これはその代替品です。
15 mL ファルコンチューブ	フィッシャーサイエンティフィ	339650
手術用ハサミ	フィッシャーサイエンティフィ	9201
スクイーズボトル	フィッシャーサイエンティフィ	03-409-10DD
100%エタノール	ッシャーサイエンティフィック	22-032-103
マリン	フィッシャーサイエンティフィック	245-684
フォームボードセラ	パック	562908
鉗子	フィッシャーサイエンティフィック	200205SHN
1 mL 21GシリンジBD	バイオサイエンス	309624
50 mL ファルコンチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	339652
2.0 mL 微量遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	02-681-258
サージカルパッド	フィッシャーサイエンティフィック	S67011
Tピンの長さ:  2"	アドバンスストア製品	X32T-05
滅菌ワイププロフェッショナル使い捨て	インターナショナル株式会社	Q85084
シャープスコンテナ	フィッシャーサイエンティフィック	14-827-122
分析天びん	シャルサイエンティフィック	ME-AE200
4Lデュワー	テイラーウォートン	4LD
浅い広口デュ	ワーフィッシャーサイエンティフィック	F3087-V
フローティングマイクロチューブラック	VWR60986-100
極低温バイアル1.2 mL、滅菌済み	フィッシャーサイエンティフィック	10-500-25
イソセシア(イソフルラン)	ヘンリー・シャイン 動物衛生	050033
液体窒素	ライト兄弟	NIT-60-XX
マウス クラス株	ジャクソン研究所	OO8179
マウス Cre 株	MMRRC	OOO435-UNC

ック ック ックフィホルマー