の胚性血管新生の可視化と定量分析ツメガエル

Summary

このプロトコルは、脈管構造を視覚化し、 Xenopus tropicalisにおけるその複雑性を定量化する蛍光ベースの方法を実証する。インビボでの心臓血管発達を研究するために、遺伝的および/または薬理学的操作の後、胚の拍動する心臓に蛍光色素を注入した後、数分後に血管を撮像することができる。

Abstract

血管は酸素と栄養を体全体に供給し、脈管網の形成は緊密な発生制御下にある。血管の効率的なインビボ視覚化およびそれらの複雑さの確実な定量化は、血管ネットワークの生物学および疾患を理解する上で重要である。ここでは、市販の蛍光色素、ヒト血漿アセチル化低密度リポタンパク質DiI複合体（DiI-AcLDL）を用いて血管を可視化し、 アフリカツメガエルのトロピカリスにおける複雑性を定量化する詳細な方法を提供する。血管は、DiI-AcLDLを拍動する胚の心臓に簡単に注入することによって標識することができ、胚全体の血管を生きている胚または固定された胚に画像化することができる。核酸の標的とされたマイクロインジェクションによる遺伝子摂動および/または薬理学的試薬のバス適用と組み合わせて、血管発生における遺伝子またはシグナル伝達経路の役割は、洗練された遺伝子組み換え動物に頼らずに1週間以内に徴候を起こしました。 Xenopusの明確な静脈系およびその定型血管形成、既存の血管の発芽のために、血管の複雑さは、摂動実験後に効率的に定量化することができる。この比較的簡単なプロトコールは、心臓血管研究の様々な分野において容易にアクセス可能なツールとして役立つはずである。

Introduction

脈管形成、新しく生まれた内皮細胞からの新しい血管の形成、および血管新生（既存の血管か​​らの新しい血管の形成）は、胚性血管系を形成する2つの異なるプロセスである。これらのプロセスにおける調節不全は、様々な心疾患および血管の構造異常をもたらす。さらに、腫瘍の増殖は、制御されていない血管の成長と関連している。このように、脈管形成および血管新生の根底にある分子メカニズムは、激しい研究^2の対象である。

アフリカツメガエルおよびゼブラフィッシュは、いくつかの理由から、脈管形成および血管形成研究のための魅力的な脊椎動物モデルである。まず、彼らの胚は小さいです。したがって、脈管構造全体を画像化することは比較的容易である。第二に、胚発生は急速である。脈管構造全体が発達するには数日しかかかりませんが、その間に発達中の血管画像を撮影することができる。第3に、血管形成の前および間における遺伝子および薬理学的介入は、アンチセンスモルホリノヌクレオチド（MO）の発達中の胚へのマイクロインジェクションまたは薬物^3、4,5の浴適用などの実施が容易である。

ゼブラフィッシュに対するXenopusのユニークな利点は、 アフリカツメガエルがステレオタイプの巨胞性切断に続き、胚の運命マップが明確に定義されているため、発生学的操作を行うことができることです。例えば、アンチセンスMOを2細胞段階で1つの細胞に注入することによって、1つの側面のみが遺伝子操作される胚を作製することが可能である。心臓原基をある胚から別の胚へ移植することも可能であり、遺伝子が細胞内因性または胸腺内機構によってその機能を発揮するかどうかを決定することが可能であるass = "xref"> 7。これらの技術は、ほとんどがアロトプラドイドであり、したがって遺伝学的研究には理想的ではないアフリカツメガエル（Xenopus laevis）で開発されてきたが、密接に関連する二倍体種であるアフリカツメガエル熱帯魚に直接適用することができる⁸ 。

生きているアフリカツメガエル胚の脈管構造を可視化する1つの方法は、血管に標識するために蛍光色素を注入することである。 DiIのような蛍光分子で標識したアセチル化低密度リポタンパク質（AcLDL）は非常に有用なプローブである。非アセチル化LDLとは異なり、AcLDLはLDL受容体⁹に結合しないが、マクロファージおよび内皮細胞によってエンドサイトーシスされる。生きている動物の心臓にDiI-AcLDLを注入すると、内皮細胞の特異的な蛍光標識が得られ、脈管構造全体を生きている胚または固定された胚の蛍光顕微鏡で画像化することができる⁴ 。

ここでは、Xenopus tropicalisの DiI-AcLDLを用いた血管の可視化と定量の詳細なプロトコール（ 図1 ）。成功した実験と成功しなかった実験の例を中心に実践的なポイントを提供します。さらに、我々は、血管網の形成に及ぼす遺伝的および環境的要因の影響を評価するのに有用であり得る、血管複雑性の定量分析のための直接的な方法を提供する。

Protocol

すべての実験は、延世大学医学系機関の動物用ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコールを遵守した。

1. ツメガエルトロピカリス胚の調製

注： アフリカツメガエルトロピカリス胚は、わずかに改変して、以前に記載されたようにして産生された。 Xenopus tropicalisの胚は、NieuwkoopおよびFaber ^11の表に従って飼育した。

1. 排卵誘発
   1. プリプライミングを行うには、交配の日の前日に、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）をカエルの対の背側リンパ嚢（男性1名および女性1名）に注射する。雌1匹につき20羽、雄1羽につき10羽を注入する。男性と女性を同じタンクに一晩（18時間以上）収容する。
   2. プライミングするには、翌日に200単位のhCGをプリムプライムドメスに注入し、100単位のhCGをプリプライミングしたものに注入する男性;下塗りされた女性は約3時間で卵を産むようになり、1日を通してそのように続けるでしょう。天然の交配のためにオスとメスペアを一緒に保管し、 体外受精のために別のタンクに保管してください（ステップ1.2）。
2. 受精
   注：卵は自然交配または体外受精によって受精させることができます。自然交配では、卵は飼育されると受精するため、受精のタイミングを制御することはできません。あるいは、下塗りされた雌のカエルを別のタンクに収容することができ、未受精の卵を採取して体外受精を行うことができ、同時に受精された数百個の受精卵を生成する。後者のアプローチは、血管標本作製の前に割球標的化マイクロインジェクションを行う場合に有用である。しかし、このアプローチでは、男性が犠牲になる。
   1. 自然交配
      1. 下塗りされた女性と男性のペアを同じタンクに残す。男性はfをつかむ卵を即座に受精させる。ガラスまたはプラスチックのピペットで卵を集め、ペトリ皿に移します。卵がピペットに付着しないようにするには、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）をピペットの内面に塗布します。
   2. 体外受精（IVF）
      1. プライミングした後、プライミングした雌を雄から分離する。女性は約3時間で自発的に卵を産むようになります。ペトリ皿にBSAコーティングしたピペットを使用していくつかの卵を移し、顕微鏡下でその品質をチェックする。健康な卵（透明な顔料、弾性球形）が敷設されている場合は、準備された男性から精巣を解剖する準備をします。
      2. 0.4％トリカインメタンスルホン酸塩（MS222）を安楽死させ、下塗りされた男性の背部リンパ嚢に300μLを注入する。およそ10分で、男性はバランス感覚を失い、浮き続けるでしょう。後肢を挟むことで男性が安楽死することを確認する鈍的な鉗子のペアと応答を観察する。
      3. 2つの精巣を摘出し、糸くずのない紙ですばやく拭いてきれいにし、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した60％LeibovitzのL-15培地（60％）1mLを含むマイクロチューブに移す。詳しい手順は他の場所で説明されています¹⁰ 。
      4. 優しく精巣を乳棒で軽く切り、精子を抽出する。この濃度（ すなわち、 60％L-15中の10％FBS1mL 中 2検体）において、精液（0.1mL）を数滴ほど約300個の卵を受精させることができる。残りの精子は密封したチューブで4℃で保存し、翌日IVFに使用することができます。
      5. 卵を雌から小さなペトリ皿に絞る。手のひらの上の女性の上部を保持し、その後足の間に人差し指を置く。人差し指で手足を広げ、もう片方の手で広場を広げてください。ペトリ皿にはクロアカに触れてください。コート0.5％BSAを含むペトリ皿でIVFの間に単層として卵を均一に分布させる。
      6. 卵に精液含有L-15培地を数滴（0.1mL）加える。同期受精のために、皿全体にわたって精子溶液を静かに攪拌する。室温で4分後、0.01×Modified Barth's Saline（MBS）でペトリ皿を満たし、10分間インキュベートし、0.1x MBSで溶液を交換する。受精卵は、室温で約1時間で最初の切断を受ける。 1×MBSは、88mM NaCl、1mM KCl、2.5mM NaHCO 3、5mM HEPES、1mM MgSO ₄ 、および0.7mM CaCl ₂ 、pH7.5である。
3. （オプション）アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（MO）および/またはmRNAの注入
   1. 血管形成に関与する遺伝子の効果を調べるために、アンチセンスMOおよび/またはmRNAのマイクロインジェクションを行う。
   2. このような実験のために、1×MBS（pH 7.5-7.8）中の2％L-システインで卵をデゼリー化する。1x MBSに2％L-システインを含む受精胚を含む皿に0.1x MBSを交換する。穏やかに皿を渦巻き、溶液を混合する。
      注：通常、胚がデゼリー化されるのに約5分かかります。このステップでは、卵を頻繁に監視して卵が溶液に暴露されていないことを確認します。卵が過剰に露出すると、弾力が失われて扁平になり、異常な発育や致死を引き起こします。
   3. デゼリー状の卵を0.1倍のMBSで5回洗浄する。 0.1x MBSに溶解した4％Ficollでマイクロインジェクションを行います。典型的には、2細胞段階で、割球あたり4ngのMOおよび600pgのmRNAを注入する。 1つの細胞に注入して、胚の片側のみで遺伝子発現を操作する。同じ胚の非注射側を対照として使用する。
   4. 遺伝子操作の特異性のための別の対照として、同じ量の対照MO（CoMO）または対照mRNA（ 例えば、 β-ガラクトシダーゼmRNA）を注射する。 CoMOは同じmオレキュラー重量を遺伝子特異的MOとして有し、 アフリカツメガエルゲノム中のいかなる遺伝子も標的化してはならない。注入側を容易に視覚化するために、フルオレセイン標識MOを使用するか、またはトレーサー（ 例えば、 EGFP mRNA）を同時注射する。
   5. 注入した胚を4％Ficollで2時間放置し、0.1x MBSで満たした新しい60mmペトリ皿に移す。
4. 育てる
   1. 胚を23℃で培養する。 23℃以下の温度（範囲：16-26℃）を使用することで、開発のスピードを遅くしたり加速したりすることができますが、23℃で温度を上げることを推奨します。
5. （任意）薬理学的試薬による治療
   1. 薬理学的操作のためには、湯を適用することによって発達中の胚に薬物を投与する。

Di-AcLDL注射液の調製

1. 標準的なmicrを使用して先細りのガラスピペットを作るオピペットプーラー。マイクロピペットプーラーにホウケイ酸ガラス管を置き、次の設定を使用します。熱、30;プル、30;速度、120;時間、200。
2. 4℃でDiI-AcLDL保存液を保存する。チューブの底に沈降した粒子は注入しないでください。ガラスピペット内の破片は、溶液の適切な排出を妨げる。
3. 調製されたガラスピペットに、マイクロローダーを用いてDiI-AcLDL溶液（約5μL）の適切な量を充填する。
4. 鉗子の細かいペア（番号55）を使用してガラスピペットの先端を少しずつ切り取ってください。約5 nLの溶液が一度に放出されるように圧力制御注入システムを設定する。 50〜60nLのDiI-AcLDL溶液は、1つの胚の血管を染色するのに十分である。
5. 乾燥を避けるため、DiI-AcLDLを充填したピペットを長時間空気中に放置しないでください。ピペットの先端を0.04％MS222を0.1X MBS溶液に溶解した。それを胚に注入する直前に（ステップ4.2.1）、同じ量の色素が放出されるかどうかを確認する。

3.注射のセットアップ

1. シルガードモールド
   1. 小さなSylgardモールドを準備するには、Sylgardベースと硬化剤を10：1の重量比で混合します。この混合溶液を入れた小さなペトリ皿（35mmまたは60mmディッシュ）の約半分を満たしてから、およそ室温で48時間。
2. 麻酔
   1. 麻酔のために1x MBS（pH7.5〜8.0）中0.04％MS222を使用する。長い麻酔が必要な場合（ 例えば、ライブイメージング中）、0.1x MBS中0.04％MS222を使用して、浸透圧不平衡を減少させる。 pHを調整するために、数滴のNaOH（約20μL）を添加し、pH紙を用いてpHをチェックする。
   2. 移入した胚が動くのを待つ。胚の背鰭に触れて、胚の完全な確認をするかどうかを調べる麻酔
3. 注射用胚の位置決め
   1. 薄くて鋭い刃で硬化したシルガードモールドの表面を押し込みます。胚を置くためのV字型の凹状のくぼみを作る（ 図2D参照）。腹側の麻酔した胚をやや斜めに（約30°）置く（ 図2D ）。
   2. 金型をMS222溶液で満たし、胚を金型に入れる。

4. Di-AcLDL注射

1. 心臓を覆う皮膚切開
   1. 心臓を覆う皮膚を切るために2本のピン（Minutiens、0.10mm）を用意します。各ピンをピンホルダーにしっかりと固定してください。心臓は脈動すると容易に識別可能でなければならない（ 図2A〜2C 、ピンク色）。
   2. 1つのピンで胚の皮膚を突き刺す。心臓と皮膚の間の空間の穴にピンを挿入します（ 図2C 、実線矢印）。心臓を穿刺しないでください。このピンの挿入部分を、切開が行われる領域に配置する。
   3. 挿入されたピンに皮膚の外側に保持されている他のピンを静かに擦って線状の切開を行います。この切開部を静かに2つのピンで広げ、心臓を露出させる（ 図2B 'および2D' 、矢印）。 DiI-AcLDLをロードしたピペットは、心臓に直接近づくことができます（ 図2D ' ）。
2. 注入
   1. ロードされたガラスピペットの先端を心臓に挿入し、DiI-AcLDL溶液を約10回の放出パルスで50〜60nL注入する。過度の量の溶液を注入しないでください。心臓が破裂するためです。注射後に心臓が鼓動し続けているかどうかを確認する。注入のたびに、同じ量のDiI-AcLDLが排出されるかどうかをチェックする。そうでなければ、ピペットの先端が塞がれている可能性があります（ステップ2.5参照）。
4. 回復のために、注入された胚を0.1x MBSで満たされた新しいペトリ皿に移す。 5-10分後、オタクは意識を取り戻し、動き始めます。この時点で、標識された血管を撮像することができる。蛍光顕微鏡下で標識された胚を視覚的にうまくスクリーニングすることが推奨される（ 図3Aおよび3B ）。不十分な量のDiI-AcLDLが胚に注入される場合、それは再び注入され得る（ 図3C ）。
5. 他の臓器のラベルが付いているオタマジャクシを捨てる（ 図3D ）。必要な数の正常に標識された胚が得られるまで続ける。

（オプション）胚の固定

1. 血管のより完全なイメージングのために、共焦点顕微鏡法を使用する;共焦点顕微鏡法のために標識された胚を固定する方が簡単かもしれない。最初に1×MBの0.04％MS222で標識胚を麻酔するS（pH 7.5-8.0）で洗浄し、室温で1時間、1Xリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中の4％パラホルムアルデヒドで固定する。固定胚は4℃で数日間保存することができます。 DiIの光退色を避けるために、注入された試料を光から保護する。

5. DiI-AcLDLのイメージング

1. ステレオスコピックイメージング
   1. 蛍光立体視顕微鏡（ 図3 ）下で写真を撮って、脈管構造の全体的な形態を評価する。
   2. 1x PBSで1％アガロースを溶解して固定胚にするか、1x MBSでライブイメージングします。溶かしたアガロースをペトリ皿に注ぎ、凝固するまで待つ。側面に横たわったときに画像化される胚に適合するアガロースゲルの表面に浅いくぼみを作る。バッファー（麻酔した胚の場合はMS222溶液、固定胚の場合は1×PBS）で皿を満たしてください。
2. 蛍光顕微鏡（ローダミンフィルターセt）
   1. DiIは、緑色励起および赤色発光色素であり、ローダミンまたはスペクトル関連のフルオロフォア（554nmでの最大励起および571nmでの発光）用の標準フィルターセットを使用して画像化する。注入された胚をアガロースモールドのくぼみに置き、写真を撮る（ 図3 ）。
3. 共焦点顕微鏡法
   注：血管構造をより詳細に分析するには、共焦点顕微鏡法を使用します。
   1. 倒立顕微鏡を使用する場合は、ガラス底の皿に胚を配置します。 1x PBSの数滴を加え、上にカバースリップを置いてそれらを固定する。余分なPBSを除去する。生きている胚を画像化する場合、麻酔した胚を使用し、PBSの代わりに0.1x MBS中0.015％MS222を使用する。
   2. 低倍率のイメージングでは、4倍から10倍の対物レンズを使用して関心領域を見つけます。後枢神経静脈（PCV）の吻側部分は、発生の血管新生を調べるのに有用な領域である（図4、破線ボックス）。
      1. 赤色発光フルオロフォア（ローダミンなど）の取得設定を使用します。
      2. 胚の外側半分を画像化することによってz積み重ね画像を作成する。まず、対物レンズの側方のPCVに焦点を合わせ、対物レンズに最も近い焦点が合っている位置に焦点の下限を設定します。撮像されるPCVの中央部分に焦点を合わせることができる位置に上限を設定します。この胚の外側全体をイメージします。船長を計算するのに必要なx、y、zスケールなどの取得設定にメタデータを格納するソフトウェアを使用します。
      3. 必要に応じて、タイルスキャンモードを使用して、胚の脈管構造全体を画像化します。経験的に、水平タイルと垂直タイルの数を決定する。
   3. 高倍率イメージングの場合は、上記の手順に従って、PCVの吻側部分と吻側の大部分の中間静脈（ISV）を画像化する（ 図4 、破線のボックス）。スタック（zスタック）とタイル（タイルスキャン）の数を適切に調整します。

6. DiI標識された血管の定量

注記：DiI標識血管は、手動またはソフトウェアを使用して追跡することができます。私たちは、血管や神経突起などのチューブ状構造の半自動追跡を可能にする無料のImageJ（NIH）プラグイン「Simple neurite tracer」を使用しています¹² 。このフリーソフトウェアを使用して、以下のパラメータを計算することができます。このソフトウェアの詳しい使用手順は、他の場所（https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer）12に記載されています。以下では、Tie2シグナル伝達が阻害または増強された胚の脈管構造の例を使用する（ 図4A〜4C ）。アンチセンスTie2MO注射胚は、血管形成を減少させ、ISVを短くする（ 図4B ）が、構成的に活性なTie2の同時注射変異体mRNA（caTie2 mRNA）はこの表現型を過剰救済し、滲出性ISV分枝を生じる（ 図4C ）。

1. ISVの長さ
   1. シンプルな神経突起トレーサーを使用して、追跡された各血管の長さを計算する。吻側の4つのISVの長さを計算します。
2. ISV支店
   注：野生型の胚では、段階42で、吻側のほとんどのISVからわずかな数の短い枝のみが発芽する。
   1. シンプルな神経突起トレーサーでは、これらの小さな血管を、それらが主な枝を起源とするISVを作製した後に追跡する。 ISVに由来するこれらのブランチの以下のパラメータを計算します。
   2. 総支店数
      1. すべてのISVと関連するブランチがトレースされたら、ブランチの総数を計算します（ 図 5B〜5D）。
   3. 支店の注文
      1. シンプルな神経突起トレーサーが各枝（ 図5A ）の順序を記録するので、計算e各注文の分岐数。野生型胚の血管の大部分は一次分枝（ すなわち、 ISV）でなければならない。
   4. 静脈複雑度指数（VCI）
      1. VCIは血管複雑性にとって有用なパラメータであり、より高次の枝に重みを与えるので、 図5Aの式を使用して各胚についてVCIを計算する。例えば、Tie2MOを注入した胚はコントロール（ 図5Bおよび5C ）に比べてVCIが低く、caTie2 mRNAを注入した胚はVCIが高い（ 図5D ）。

Results

実験のタイムライン（図1および2）

受精直後に、遺伝子発現を調節するために標的化されたマイクロインジェクションを行うことができる。例えば、内在性Tie2 mRNAの開始コドンに特異的に結合するアンチセンスMOを注入することができ、立体障害によるTie2標的mRNAの翻訳を阻害する。 MOは、うまく注入された胚の容易な視覚的スクリーニングのためにフルオレセインにコンジュゲートすることができる。あるいは、トレーサーmRNA（ 例えば、 EGFPをコードするmRNA）をMOと同時注入することができる。さらに、薬剤は、孵化後のバス適用によって処理することができる（早期テールバッドステージ、NFステージ26周辺）。薬物を0.1x MBSに溶解し、それを胚に加える。早期の治療のために、胚を一対の鉗子で膜から解放することができる。 DiI-AcLDLをステージ33/34周辺の心臓に注入して、血管の形態のダイナミクスを調べることができます典型的にはステージ...

Discussion

ここに提示されたプロトコールは、 Xenopus laevis ⁴における血管形成中の発生事象を調査するためにAli H. Brivanlouらによって最初に開発されたが、この原稿に示されているように、他の小動物にも適用できる。心臓への色素注入は実行するのが簡単であり、血管ネットワーク全体を共焦点顕微鏡と同様に蛍光解剖顕微鏡下で画像化することができる。血管の発達中に色素を心臓に注入すると、血管の成長と分枝の動態をリアルタイムで画像化することができます⁴ 。十分に定義された静脈ネットワーク、特にPCVおよび吻側のほとんどのISVを使用して、血管新生に対する遺伝的または環境的摂動の影響を定量的に評価することができる。

このプロトコールにおける最も重要なステップはDiI-AcLDLの注入である（ステップ4）。成功した注射と失敗した注射の例を提供します （ Fi図3）。胚を正常に注入するには、ステップ4.3に記...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm ペトリ皿	SPL	10035	シルガード金型フレーム
60 mm ペトリ皿	SPL	10060	胚発生トレイ
ホウケイ酸ガラス	サッター器具	B100-50-10	注射用針
BSA	Sigma	A3059-10G	コーティング試薬
CaCl2	D.S.P.GR 試薬		0.1x MBSコンポーネント
カバース	リップ スーペリア	HSU-0111520	共焦点イメージング用
DiI-AcLDL	サーモフィッシャーサイエンティフィック	L3484	血管染色液
FBS	Hyclone	SH.30919.02	精巣の保管用
光ファイバーイルミネーター	ワールド精密機器	Z-LITE-Z	ライト
コール	シグマ	F4375	インジェクションバッファー
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー	サッター器具	P-97	インジェクションニードルプーラー
鉗子	ファインサイエンスツール	11255-20	胚の孵化および 針先切断用
ガラスボトムディッシュ	SPL	100350	共焦点イメージング用
hCG	MNS Korea		カエルのプライミング用
HEPES	Sigma	H3375	緩衝剤
インキュベータ	ーラボ コンパニオン	ILP-02	胚育成用
KCl	DAEJUNG	6566-4400	MBS 成分
L15 培地	Gibco	11415-114	精巣保存用
L-システイン	Sigma	168149-100G	デゼリー試薬
MgSO4	Sigma	M7506	MBS 成分
マイクロチューブ	Axygen	MCT-175-C-S	精巣の保管用
MS222	Sigma	E10521	麻酔薬
NaCl	DAEJUNG	7647-14-5	MBS成分
NaOH	Sigma	S-0899	pH調整試薬
パラホルムアルデヒド		Σ P6148	固定剤
PBS	BIOSESANG	P2007	イメージング用緩衝液
pH 紙	Sigma	P4536-100EA	確認用 pH
PICO-LITER インジェクター	Waner instruments	PLI-100A	注射用
ピン	サービス	26002-10	切開用
ピンホルダー	Scitech Korea	26016-12	切開用
精密ステレオズーム双眼顕微鏡	世界精密機器	PZMIII	目視検査用
標準マニュアル制御 マイクロマニピュレーター	Waner instruments	W4 64-0056	マイクロインジェクション用
SYLGARD 184 キット	ダウ コーニング		DiI インジェクション
用 トランスファーピペット	Korea Ace Scientific Co.	YMです。B78-400	卵子および 胚コレクション用