の胚性血管新生の可視化と定量分析ツメガエル

Summary

このプロトコルは、脈管構造を視覚化し、 Xenopus tropicalisにおけるその複雑性を定量化する蛍光ベースの方法を実証する。インビボでの心臓血管発達を研究するために、遺伝的および/または薬理学的操作の後、胚の拍動する心臓に蛍光色素を注入した後、数分後に血管を撮像することができる。

Abstract

血管は酸素と栄養を体全体に供給し、脈管網の形成は緊密な発生制御下にある。血管の効率的なインビボ視覚化およびそれらの複雑さの確実な定量化は、血管ネットワークの生物学および疾患を理解する上で重要である。ここでは、市販の蛍光色素、ヒト血漿アセチル化低密度リポタンパク質DiI複合体（DiI-AcLDL）を用いて血管を可視化し、 アフリカツメガエルのトロピカリスにおける複雑性を定量化する詳細な方法を提供する。血管は、DiI-AcLDLを拍動する胚の心臓に簡単に注入することによって標識することができ、胚全体の血管を生きている胚または固定された胚に画像化することができる。核酸の標的とされたマイクロインジェクションによる遺伝子摂動および/または薬理学的試薬のバス適用と組み合わせて、血管発生における遺伝子またはシグナル伝達経路の役割は、洗練された遺伝子組み換え動物に頼らずに1週間以内に徴候を起こしました。 Xenopusの明確な静脈系およびその定型血管形成、既存の血管の発芽のために、血管の複雑さは、摂動実験後に効率的に定量化することができる。この比較的簡単なプロトコールは、心臓血管研究の様々な分野において容易にアクセス可能なツールとして役立つはずである。

Introduction

脈管形成、新しく生まれた内皮細胞からの新しい血管の形成、および血管新生（既存の血管か​​らの新しい血管の形成）は、胚性血管系を形成する2つの異なるプロセスである。これらのプロセスにおける調節不全は、様々な心疾患および血管の構造異常をもたらす。さらに、腫瘍の増殖は、制御されていない血管の成長と関連している。このように、脈管形成および血管新生の根底にある分子メカニズムは、激しい研究^2の対象である。

アフリカツメガエルおよびゼブラフィッシュは、いくつかの理由から、脈管形成および血管形成研究のための魅力的な脊椎動物モデルである。まず、彼らの胚は小さいです。したがって、脈管構造全体を画像化することは比較的容易である。第二に、胚発生は急速である。脈管構造全体が発達するには数日しかかかりませんが、その間に発達中の血管画像を撮影することができる。第3に、血管形成の前および間における遺伝子および薬理学的介入は、アンチセンスモルホリノヌクレオチド（MO）の発達中の胚へのマイクロインジェクションまたは薬物^3、4,5の浴適用などの実施が容易である。

ゼブラフィッシュに対するXenopusのユニークな利点は、 アフリカツメガエルがステレオタイプの巨胞性切断に続き、胚の運命マップが明確に....

Protocol

すべての実験は、延世大学医学系機関の動物用ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコールを遵守した。

1. ツメガエルトロピカリス胚の調製

注： アフリカツメガエルトロピカリス胚は、わずかに改変して、以前に記載されたようにして産生された。 Xenopus tropicalisの胚は、NieuwkoopおよびFaber ^11の表に従って飼育した。

1. 排卵誘発
   1. プリプライミングを行うには、交配の日の前日に、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）をカエルの対の背側リンパ嚢（男性1名および女性1名）に注射する。雌1匹につき20羽、雄1羽につき10羽を注入する。男性と女性を同じタンクに一晩（18時間以上）収容する。
   2. プライミングするには、翌日に200単位のhCGをプリムプライムドメスに注入し、100単位のhCGをプリプライミングしたものに注入する男性;下塗りされた女性は約3時間で卵を産むようになり、1日を通してそのように続けるでしょう。天然の交配のためにオスとメスペアを一緒に保管し、 体外受精のために別のタンクに保管してください（ステップ1.2）。
2. 受精 <....

Results

実験のタイムライン（図1および2）

受精直後に、遺伝子発現を調節するために標的化されたマイクロインジェクションを行うことができる。例えば、内在性Tie2 mRNAの開始コドンに特異的に結合するアンチセンスMOを注入することができ、立体障害によるTie2標的mRNAの翻訳を阻害する。 MOは、うまく注入された胚の容易な視覚的スクリーニングのためにフルオレセインにコンジュゲートすることができる。あるいは、トレーサーmRNA（ 例えば、 EGFPをコードするmRNA）をMOと同時注入することができる。さらに、薬剤は、孵化後のバス適用によって処理することができる（早期テールバッドステージ、NFステージ26周辺）。薬物を0.1x MBSに溶解し、それを胚に加える。早期の治療のために、胚を一対の鉗子で膜から解放することができる。 DiI-AcLDLをステージ33/34周辺の心臓に注入して、血管の形態のダイナミクスを調べることができます典型的にはステージ.......

Discussion

ここに提示されたプロトコールは、 Xenopus laevis ⁴における血管形成中の発生事象を調査するためにAli H. Brivanlouらによって最初に開発されたが、この原稿に示されているように、他の小動物にも適用できる。心臓への色素注入は実行するのが簡単であり、血管ネットワーク全体を共焦点顕微鏡と同様に蛍光解剖顕微鏡下で画像化することができる。血管の発達中に色素を心臓に注入すると、血管の成長と分枝の動態をリアルタイムで画像化することができます⁴ 。十分に定義された静脈ネットワーク、特にPCVおよび吻側のほとんどのISVを使用して、血管新生に対する遺伝的または環境的摂動の影響を定量的に評価することができる。

このプロトコールにおける最も重要なステップはDiI-AcLDLの注入である（ステップ4）。成功した注射と失敗した注射の例を提供します （ Fi図3）。胚を正常に注入するには、ステップ4.3に記.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm ペトリ皿	SPL	10035	シルガード金型フレーム
60 mm ペトリ皿	SPL	10060	胚発生トレイ
ホウケイ酸ガラス	サッター器具	B100-50-10	注射用針
BSA	Sigma	A3059-10G	コーティング試薬
CaCl2	D.S.P.GR 試薬		0.1x MBSコンポーネント
カバース	リップ スーペリア	HSU-0111520	共焦点イメージング用
DiI-AcLDL	サーモフィッシャーサイエンティフィック	L3484	血管染色液
FBS	Hyclone	SH.30919.02	精巣の保管用
光ファイバーイルミネーター	ワールド精密機器	Z-LITE-Z	ライト
コール	シグマ	F4375	インジェクションバッファー
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー	サッター器具	P-97	インジェクションニードルプーラー
鉗子	ファインサイエンスツール	11255-20	胚の孵化および 針先切断用
ガラスボトムディッシュ	SPL	100350	共焦点イメージング用
hCG	MNS Korea		カエルのプライミング用
HEPES	Sigma	H3375	緩衝剤
インキュベータ	ーラボ コンパニオン	ILP-02	胚育成用
KCl	DAEJUNG	6566-4400	MBS 成分
L15 培地	Gibco	11415-114	精巣保存用
L-システイン	Sigma	168149-100G	デゼリー試薬
MgSO4	Sigma	M7506	MBS 成分
マイクロチューブ	Axygen	MCT-175-C-S	精巣の保管用
MS222	Sigma	E10521	麻酔薬
NaCl	DAEJUNG	7647-14-5	MBS成分
NaOH	Sigma	S-0899	pH調整試薬
パラホルムアルデヒド		Σ P6148	固定剤
PBS	BIOSESANG	P2007	イメージング用緩衝液
pH 紙	Sigma	P4536-100EA	確認用 pH
PICO-LITER インジェクター	Waner instruments	PLI-100A	注射用
ピン	サービス	26002-10	切開用
ピンホルダー	Scitech Korea	26016-12	切開用
精密ステレオズーム双眼顕微鏡	世界精密機器	PZMIII	目視検査用
標準マニュアル制御 マイクロマニピュレーター	Waner instruments	W4 64-0056	マイクロインジェクション用
SYLGARD 184 キット	ダウ コーニング		DiI インジェクション
用 トランスファーピペット	Korea Ace Scientific Co.	YMです。B78-400	卵子および 胚コレクション用