複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

I型IVは、細胞質（ 例えば、上皮および毛ケラチン（K）、筋細胞デスミン、神経フィラメント、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、および他のタイプの細胞質タンパク質である。その他）;タイプVは核ラミンであり;タイプVIはアイレンズ^1の IFである。それらの分子構成に関して、IFタンパク質は、高度に保存されたコイルドコイル「ロッド」ドメインおよび球状の「頭部」および「尾部」ドメインの3つの共通ドメインを有する。 IFタンパク質四量体は、機械的保護² 、ストレス感知^{3,4 、}転写⁵および成長の調節、ならびに他の重要な細胞機能に関与する動的細胞骨格および核骨格構造を形成する成熟フィラメントに最終的に組み込まれる短いフィラメント前駆体を形成するように集合する" ^1,6,7 。

IFシステムの機能的重要性は、ニューロパシー、ミオパチー、皮膚脆弱性障害、代謝機能不全および早期老化症候群を含むIF遺伝子のミスセンス突然変異によって引き起こされる多くのヒト疾患の存在によって強調される⁸ 。いくつかのIF遺伝子突然変異は、肝疾患^9の単純な上皮ケラチンのような疾患の進行を引き起こさないが、そのキャリアを素因とする⁹ 。後者は、上皮におけるIFの重要なストレス保護機能によるものである。 IFは一般に、基底条件下で最も豊富な細胞タンパク質の中に含まれていますが、様々なタイプのストレスの間にさらに強く誘導されます¹⁰ 。例えば、線虫C.elegansのプロテオーム全体の変化を評価した最近の研究では、複数のIFが高度に上方制御され、凝集しやすいことが示された生物老化中に11,12。適切なIF構造の維持は、様々な形態のストレスに対する細胞の抵抗性にとって必須であるため、IF凝集はまた、老化中の機能低下に寄与し得る。しかしながら、ストレスを受けている異なる組織にわたって複数の哺乳動物IFタンパク質を試験する生物学的レベルの研究は欠けている。

IFは、細胞の要求を満たすために適応する高度に動的な構造である。ケラチンは、例えば、可溶性（非糸状）および不溶性（糸状）タンパク質プール¹³間の生合成に依存しないサイクリングを受ける。通常の生理学的条件下では、非イオン性界面活性剤Nonidet P-40に可溶化することができる約20％と比較して、洗浄剤を含まない緩衝液中で全K8 / K18プールの約5％を抽出することができ、 X100 ^{14 、} 15 。有糸分裂の間に、表皮ケラチンではあまり明らかではないが、ビメンチンおよび他のIII型IFタンパク質においてより明白である単純型上皮K8およびK18 ^14の溶解性が顕著に増加する^15,16 。 IFタンパク質の溶解特性は、フィラメント再配列および溶解性のための重要な翻訳後修飾（PTM）であるリン酸化によって厳密に制御されている17,18,19,20。ほとんどのIFは、保存された部位で多数のPTMによって広範な調節を受け、機能的変化をもたらす¹⁷ 。

この方法の目的は、複数のマウス組織にわたるIFタンパク質の研究のための生化学的抽出および分析方法に、IF分野の新しい研究者を紹介することである。特定我々は、高塩抽出法を用いたIFタンパク質の単離と、質量分光法およびPTM標的抗体によるPTMの変化の評価に焦点を当てている。これらの方法は以前に公表された手順²¹に基づいているが、異なるIFタンパク質型を抽出するための改変を含み、IFファミリーにわたる調節のための共通機構を明らかにする。例えば、特定のリジン残基でのK8アセチル化はフィラメントの組織化を制御するが、高アセチル化はK8不溶性および凝集体形成を促進する²² 。最近の世界のプロテオミクスプロファイリング研究は、ほとんどの組織特異的IFタンパク質もまたアセチル化の標的であり、ほとんどのIFアセチル化部位が高度に保存されたロッドドメインに限定されることをさらに明らかにした。これにより、IFシステムのグローバルプロファイリングに適したメソッドの必要性が強調されます。我々はまた、optiでの自動ホモジナイゼーションを用いて複数の組織からIFタンパク質を単離する迅速な方法を紹介する溶解した溶解マトリックス。得られた調製物は、質量分析および他の方法による下流のPTM分析に適している。

このプロトコルは、ノースカロライナ大学の施設内動物管理および使用委員会（IACUC）に従って承認され、実施されます。

1.準備

1. トリトン-X緩衝液（1％トリトンX-100,5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、pH7.4中の容量を出す）を調製する。 500mLにするには：Triton X-100と500mM EDTAをそれぞれ5mL加え、PBS490mL、pH7.4に入れる。 Triton-X緩衝液は4℃で保存してください。
2. 高塩緩衝液（10mM Tris-HCl、pH7.6,140mM NaCl、1.5M KCl、5mM EDTA、0.5％Triton X-100、二倍蒸留（dd）H ₂ O中に容量を持ち出す）を調製する。 500mLを作るため：0.5M Tris-HCl（pH7.6）10mL、5M NaCl 14mL、KCl55.9g、0.5M EDTA5mLおよびTriton X-100 2.5mLを撹拌し、容量を500に調整するmLとなるように希釈した）。ハイソルトバッファー溶液は4℃で保存してください。
3. 使用直前に、適切な量のTriton-XおよびHigh Salt Buffer（
4. 1×PBS、pH 7.4中で5mM EDTAを調製する。 500mLを作るために：0.5M EDTA5mLを1xPBS、495mLに撹拌する。
5. 獣医学のガイドラインと制度上の基準に準拠した承認されたプロトコルを使用して、異なるマウスの器官（脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、結腸、腸、腎臓、脾臓）を分離する。組織収集手順は、プロテアーゼが豊富な組織（ 例えば、膵臓を最初に処理すべきである）のRNAおよびタンパク質の完全性を保存するために、5分を超えてはならない。
6. その後のRNA抽出、cDNA合成、およびIF遺伝子発現の定量的リアルタイムPCR解析のために、少量の組織（約5〜20mg）を切断し、RNA保存液に入れます。組織を含むRNA保存液チューブを4℃で一晩置き、さらにプロトコールに従う貯蔵および隔離ステップ。
7. 組織の残りの部分をより小さな断片（ 例えば 0.5cm）に切断し、冷凍瓶に入れる。長期保管の場合はバイアルを-80℃または液体窒素でスナップフリーズして保管してください。

IF遺伝子発現解析

1. RNA貯蔵溶液試薬中に保存された組織からRNAを抽出する。製造業者のプロトコールに従って、任意の適切な/好ましいRNA抽出方法を使用する。
2. RNA濃度を定量し、2μgのRNAを使用して、製造業者のプロトコールに従って適切な逆転写キットを使用してcDNAを生成する。
3. 生成されたcDNAおよびマウスIF遺伝子特異的プライマーを使用して、各サンプルの3つの技術的複製ならびに製造業者のプロトコルによるブランク対照を含むqPCR反応をセットアップした。
4. IF遺伝子発現を、異なる条件（ 例えば、若い組織と古い組織）を比較した倍率変化として定量化する。

3.Pイムノブロット用の全組織溶解物の修復

1. 1mLの2×非還元SDSサンプルバッファー中で25mgの組織をホモジナイズする。タンパク質濃度を定量するために比色分析を行う場合は、ブロモフェノールブルー染料をサンプルバッファーから除きます。
2. 還元メルカプトエタノール（2-ME）を5％（v / v）添加して還元サンプルを調製する。非還元性サンプル200μLに10μLの2-MEを加える。
3. 界面活性剤および還元剤適合性タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定する。色素が既にサンプルバッファーに含まれている場合、タンパク質量は、クーマシーベースの染色²⁴を含む多くの技術によってゲルを実行した後に推定することができます。
4. すべてのサンプルをボルテックスし、95℃で5分間加熱する。
5. 還元条件と非還元条件の両方でウェスタンブロッティングを行います。膜を短時間露出させてモノマー種を明らかにし、より長い時間（> 1分）で高分子量複合体含有物を明らかにするIFタンパク質。凝集をモニタリングする場合、ゲル/膜全体（ゲルウェルの底を含む）を調べる。
6. 平行ゲルを実行し、ローディングコントロールとしてタンパク質染色で染色する。疾患モデルまたは傷害実験では、ハウスキーピングタンパク質（ 例えば、アクチン、GAPDH）のイムノブロットとは対照的に、ストレス条件の違いによって後者が変化するので、ローディングコントロールとして全タンパク質染色を使用すべきである。

4.組織特異的IFの界面活性剤可溶性および高塩濃度抽出物の調製

1. 氷冷したTriton X-100緩衝液1 mLをガラス管ホモジナイザーに加え、氷上に置きます。
2. 液体窒素保存液から少量の組織（〜25 mg）を取り出し、ガラスホモジナイザーに直接入れる。ホモジナイズ（50ストローク）し、気泡を作るのを避けるために、ポリテトラフルオロエチレン乳棒を使用してください。常にホモジナイザーとライゼートを冷たく保ちます。
3. ライセートを1.5 mLのmicrに移す遠心チューブを氷上に置き、予め冷却した遠心分離機（4℃）で20,000×gで10分間遠心する。
4. 上清画分を別のチューブに集める。これは、トリトンX可溶性画分であり、免疫沈降（Ip）およびIFタンパク質の界面活性剤可溶性プールの分析に使用することができる。脳組織からより清潔なIF抽出物を得るために、ステップ4.1-4.4を繰り返すことができることに留意されたい。
5. 組織ペレットに1 mLのHigh Salt Bufferを加え、清潔なホモジナイザーに移し、100ストロークを飛ばします。ホモジネートをマイクロ遠心チューブに戻して移し、チューブを冷たい部屋の回転シェーカーに1時間置きます。
6. ホモジネートを20,000 xgで4℃で20分間遠心分離する。上清を捨てる。
7. 氷冷PBS / EDTAバッファー1 mLをペレットに加え、クリーンホモジナイザーでペレット（20ストローク）を最終的なクリーンアップステップ*としてホモジナイズします。新しいチューブに移し、4℃で20,000×gで10分間遠心分離して、IFタンパク質 -高濃度高塩抽出物（HSE）である。
   *任意に、この段階でホモジナイズの代わりにボルテックスする。
8. 上清を捨て、予熱した非還元性SDSサンプルバッファー300μLにペレットを溶解する。最初にピペッティングとボルテックスでペレットを壊し、95℃で5分間サンプルを加熱する。
9. ペレットが確実に溶解するように必要に応じてボルテックスおよびピペットをかけます。ペレットを完全に溶解させるのに数分かかることがあります。
10. すべてのサンプルを分析まで-20℃で保存する。

5.大量実験におけるIFタンパク質抽出のための自動化組織溶解

1. RNA抽出のために、溶解マトリックスD（小さなセラミック球を使用する）を入れたチューブに溶解緩衝液（組織25mgあたり600μLの緩衝液）を置き、組織ライザーで25秒間2回パルスする。 20,000 xgでの遠心分離によってマトリックスから溶解液を分離し、次の工程に分離する。
2. タンパク質の抽出には、Trit溶解マトリックスSS（単一のステンレススチールビーズを使用）を含む溶解チューブ中で、X-100（または全溶解物を調製する場合はSDSサンプルバッファー）上に置く。複数のマトリックスを試験した後、これは、伝統的な計量法と同様の品質のIFタンパク質抽出物を生成するため選択された。自動化された方法は、膵臓および脾臓に最適ではなく、これらの組織に標準的なホモジナイゼーションプロトコルを使用する必要があることに注意してください。
3. High Salt Extractの調製を進めるには、磁石を使用してステンレスビーズをチューブから取り出し、チューブを20,000 xgで10分間4℃で遠心します。
4. 手動プロトコルのステップ4.4（上記）に進みます。
5. すべてのサンプルを分析まで-20℃で保存する。

翻訳後修飾IFタンパク質の免疫濃縮

1. PBST緩衝液（PBS中0.02％Tween-20）を調製する。 50mLを調製するために、10mLのTween-20を50mLのPBS（pH7.4）に加える。
2. PTM抗体を調製する（PBST200μL中の抗体1〜10μg）。一般に、3μgの抗体/反応は、必要に応じてさらに最適化できる良好な開始条件である。
3. 各反応について、50μLの磁性ビーズを微量遠心管に分注し、磁石の上に置き、ビーズ保存液を吸引します。
4. ビーズを抗体溶液に再懸濁し、室温で20分間、ローテーター（少量の混合を確実にするためにエンドオーバーエンド）でインキュベートすることにより、ビーズを免疫沈降抗体に結合させる。
5. チューブを磁石の上に置き、抗体溶液を吸引する。
6. 200μLのPBSTで1回抗体結合ビーズをすすぎ、洗浄バッファーを除去する。
7. 0.6-1mLの組織溶解物をビーズに加え、穏やかなピペットで混合し、冷たい部屋の回転器で3時間インキュベートする。
8. チューブを磁石の上に置き、溶解物を除去し、200μLのPBSTでビーズを5回洗浄する。最後の洗浄ステップの後、ビーズを100μlで収集し、6; LのPBS（Tween-20無し）で清潔な新しいチューブに移す。チューブをマグネットの上に置きます。
9. PBSを吸引し、100μLの非還元サンプル緩衝液を加える。 50μLを除去し、2-ME（5％）を加えて還元サンプルを作製する。試料を95℃で5分間加熱する。
10. 磁石上のビーズからip分画を分離し、新しいチューブに集める。
11. 分析まで-20℃でサンプルを保存する。

質量分析のためのIFタンパク質試料の調製

1. 質量分析の分析には時間とコストがかかりますので、研究を開始する前にプロテオミクスの専門家に相談してください。
2. 汚染を避けるために特別な注意を払ってください。きれいな手袋ですべてのゲルを取り扱い、清潔な容器でインキュベートし、ddH ₂ O（石鹸を避ける）のみを用いて洗浄する。
3. 標準条件に従ってSDS-PAGEゲル上で20〜50μLのHSEサンプル（セクション4および5から）を流してください。 タンパク質染色で1時間染色する。複数回すすぎ、ddH ₂ Oで一晩脱脂する。 IFタンパク質バンドは脱染色後に容易に見えるはずである。
4. ゲルをプラスチック製のシートプロテクターの間に置き、分析のために切除して送るバンドをスキャンしてマークします。
5. 新しいきれいなかみそりを使用してIFタンパク質バンドを切り出します。
6. ゲルバンドを清潔なマイクロ遠心チューブに入れ、質量分析装置に移す。

溶解マトリックスを用いた複数のマウス組織からのIFタンパク質の高塩ベース抽出のための新しい高速方法。

上皮組織からの中間フィラメントタンパク質画分の大部分を単離する従来の方法25,26 は、ここでは9つの異なる器官および組織溶解のためのより迅速な手順を含むように改変された。伝統的な方法には3つの手動均質化段階が必要であるが、修正された手順は1つの手動均質化段階のみを有するため、特に6つを超えるサンプルを処理する場合に数時間短縮する。 図1Aは、9匹のマウス組織からのHSEの典型的な結果を示し、組織中の予想されるタンパク質の表および各タンパク質の分子量を図1Bに示す

肝臓K8およびK18は、強くアップレギュレートされ、老齢マウスの肝臓においてリン酸化およびリジンアセチル化の増加を受ける。

図2は、このプロトコルで説明されているいくつかの分析の典型的な結果を示しています。パネルAは、肝臓における2つの主要IF遺伝子、 ケラチン8 （ KRT8 ）およびケラチン18 （ KRT18 ）（IFタンパク質K8およびK18をそれぞれコードする）を含む。上皮ケラチンは、種々のストレス条件下で強くアップレギュレートされる。示された結果において、これは、 KRT8が3 mのマウスと比較して24 mのマウスの肝臓において有意に上方調節されるので、これは老化の間に起こる。タンパク質レベルでの結果は、古い（24m）肝臓におけるK8単量体および高分子量複合体の劇的な増加によって観察されるように、より顕著である。ここでクマシーベースのタンパク質染色は、試料間でのタンパク質の均等なローディングを確実にするローディングコントロールとして機能する。全組織溶解物では、この場合のように、タンパク質をゲルにオーバーロードすることは容易であることに留意されたい。より小さな容量をロードするか、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）バッファーでサンプルをさらに希釈すると、この問題が緩和されます（特に、粘性があり、ピペッティングが困難な場合）。パネルCは、自動プロトコールを用いて得られた肝臓高塩抽出物からの典型的な結果を示しているゲル上のケラチン8および18の強力な富化を評価する。赤色の線は、質量分析分析のために切除され提出された領域を画定する。パネルDにおいて、パネルCの試料の質量分析分析の結果は、古い肝臓のK8およびK18が、若い肝臓に存在しない複数のリン酸化およびアセチル化部位を有することを示す。

GFAPは強くアップレギュレートされ、リジンは古いマウスの脳内でアセチル化される。

図3は、上皮からIFを抽出するために使用される方法が非上皮組織にも使用できることを示している。さらに、結果は、IF遺伝子およびタンパク質の加齢に依存したアップレギュレーションの一般的パターンを明らかにする。 図2Aの qPCRの結果は、3 mのマウスと比較して、24 mのマウスの脳におけるGFAP mRNAの5倍の誘導を示す。 図2BトリトンX-100画分およびIF富化HSE中に存在する全タンパク質を明らかにする。古い脳の矢印（GFAPに対応する）で示された50kDaでのバンド強度の増加に注目されたい。 図2Cのウエスタンブロット分析は、GFAPのアップレギュレーションおよびTriton X-100画分（両方とも矢印で示す）におけるGFAPモノマーおよび潜在的な高分子量複合体の有意な存在をさらに明らかにする。パン - アセチルリジン抗体による同じサンプルのウエスタンブロット分析は、抗体が、古いマウスの脳のHSEにおいて約50kDaのバンドを認識し、Triton X-100画分において〜250kDaでバンドを認識することを示す（ 図2D ）。 Triton X-100画分からのアセチル化タンパク質の免疫濃縮は、古い脳から得た溶解物中のGFAPタンパク質の存在の増加を示す。還元および非還元条件は、GFAPモノマーおよび高分子量複合体を強調するために示される。質量分析分析（ 図1と同様

図1： 複数のマウス組織からのIFタンパク質の自動溶解および抽出。 （ A ）指定されたマウス組織由来のHSEのクマシーベースのゲル染色。示した組織は、同じ成体（3m）の雄CBAマウスから得た。 脳は、NFL、NFM、およびNFHが、それぞれ約70,145、および200kDaで、高度にリン酸化され、予想よりも遅く移動することに注意してください。 心臓 ：デスミンおよびビメンチンに対応する53kDaバンドに加えて）、心臓サンプルは、デスミン28と共精製することが知られているアクチンを示す可能性が最も高い約42kDaのバンドも含む。 L腸小腸：K8 / K18で同時抽出される25kDaを超える顕著なバンドの同定は知られていないが、組織が伝統的なダウンスホモジナイザー法を用いて処理される場合、これらのバンドは存在しない。 膵臓および脾臓 ：自動化されたホモジナイゼーションは、おそらく組織ライザーのパルス中の温度のわずかな上昇に対する溶解物の感受性のために、脾臓からのケラチンおよびビメンチンの単離には適していないことに留意されたい。 （ B ）異なる組織に存在する主要なIFタンパク質型およびそれらの予測分子量をパネルAの参考値として示す表。この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

図2： 分子若年マウスおよび老齢マウスの肝臓ケラチンの生化学的差異を調べた。 （ A ）標準的な手順（プロトコル1）を用いたKRT8およびKRT8 mRNAの分析は、古いマウスからの肝臓におけるKRT8転写物の有意な誘導を明らかにする。各条件についてn = 6（1群あたり3匹の雄CBAマウスおよび3匹の雌CBAマウスを使用した）。 ** p <0.01;一元配置ANOVA。 （ B ）プロトコール2を用いて、3匹の若齢（3齢）および3齢（24ヵ月齢）の雄性CBAマウスから総肝臓溶解物を得、試料を非還元条件下で分析した。 TS1抗体を用いてK8発現をプローブし、クーマシーに基づくタンパク質染色をローディング対照として用いた。 （ C ）パネルBからのマウス＃1およびマウス＃4にそれぞれ対応する、若いおよび古いマウス肝臓からの高塩抽出物.2つの矢印は、ゲル上のK8およびK18を指し、赤色のボックスは、摘出し、質量分析のために提出した。 （ D 。この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

図3： 若年マウスおよび老齢マウスの脳からのGFAPの分子および生化学的相違。 （ A ）標準的な手順（プロトコール1）を用いたGFAP mRNAの分析は、老齢マウスからの脳における有意な誘導を明らかにする。各条件についてn = 6（1群あたり3匹の雄CBAマウスおよび3匹の雌CBAマウスを使用した）。 ** p <0.01;一元配置ANOVA。 （ B ）トリトンX-100のクーマシーに基づくタンパク質染色および若齢（3ヶ月齢）および老齢（24ヶ月齢）マウスの脳組織由来のHSE画分。古い脳からのHSEの〜50kDaのGFAPバンドの増加に注意してください（矢印）。 （ C ）GFパネルBと同じサンプルのアセチル - リジンイムノブロット（ウサギポリクローナル; Abcam ab80178）（ E ）アセチル-CoAで免疫沈降させた後のGFAPブロットを、パネルBと同じサンプルのAPイムノブロット（マウスモノクローナル; GA5クローン）リジン抗体。サンプルを、非還元（NR）および還元（R）条件下で分析し、矢印は、古い脳からの免疫沈降物中のGFAPの存在を増加させることを指し示す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。