複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

サマリー

この方法では、複数のマウス組織から中間体フィラメント（IF）タンパク質を迅速かつ効率的に単離するための生化学的手順を提示する。単離されたIFは、質量分析および他の生化学アッセイによる翻訳後修飾の変化を研究するために使用することができる。

要約

中間フィラメント（IF）は、アクチンフィラメントおよび微小管とともに、細胞骨格 - 各細胞の重要な構造要素 - を形成する。正常に機能するIFは細胞に機械的およびストレス回復性を与え、機能不全のIF細胞骨格は細胞の健康を損ない、多くのヒト疾患と関連している。翻訳後修飾（PTM）は、生理学的変化およびストレス条件下でIF動態を決定的に調節する。したがって、IFのPTMシグネチャーにおける変化をモニターする能力は、細胞傷害の間のストレス応答因子としてのIFシステムのより良好な機能的理解、および最終的な調整に寄与し得る。しかし、70を超える個々の遺伝子によってコードされ、組織依存的に発現される多数のIFタンパク質は、異なるPTMの相対的重要性を分類する際の大きな課題である。この目的のために、IFタンパク質上のPTMのモニタリングを可能にする方法孤立した家族のためではなく、生物全体のレベルで、この分野における研究の進展を加速させる可能性があります。ここでは、9種類のマウス組織（脳、心臓、肺、肝臓、小腸、大腸、膵臓、腎臓、および腎臓）からのIFタンパク質の総、洗浄剤可溶性および界面活性剤耐性画分の単離のための生化学的方法を提示する。脾臓）。我々はさらに、異なるマウス組織の溶解マトリックスおよび自動化されたホモジナイゼーションを用いて、IFタンパク質の迅速な単離のための最適化されたプロトコールを実証する。自動化されたプロトコルは、（複数の動物および実験群を含む疾患モデルにおけるような）高試料量の実験でIFをプロファイリングするのに有用である。得られたサンプルは、質量分析に基づくPTMプロファイリングを含む様々な下流分析に利用することができる。これらの方法を利用して、我々は、異なるマウス組織（脳および肝臓）におけるIFタンパク質がそれらの発現に関して並行して変化することを示すための新しいデータを提供する老化中のシオンレベルおよびPTMを減少させる。

概要

I型IVは、細胞質（ 例えば、上皮および毛ケラチン（K）、筋細胞デスミン、神経フィラメント、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、および他のタイプの細胞質タンパク質である。その他）;タイプVは核ラミンであり;タイプVIはアイレンズ^1の IFである。それらの分子構成に関して、IFタンパク質は、高度に保存されたコイルドコイル「ロッド」ドメインおよび球状の「頭部」および「尾部」ドメインの3つの共通ドメインを有する。 IFタンパク質四量体は、機械的保護² 、ストレス感知^{3,4 、}転写⁵および成長の調節、ならびに他の重要な細胞機能に関与する動的細胞骨格および核骨格構造を形成する成熟フィラメントに最終的に組み込まれる短いフィラメント前駆体を形成するように集合する" ^1,6,7 。

IFシステムの機能的重要性は、ニューロパシー、ミオパチー、皮膚脆弱性障害、代謝機能不全および早期老化症候群を含むIF遺伝子のミスセンス突然変異によって引き起こされる多くのヒト疾患の存在によって強調される⁸ 。いくつかのIF遺伝子突然変異は、肝疾患^9の単純な上皮ケラチンのような疾患の進行を引き起こさないが、そのキャリアを素因とする⁹ 。後者は、上皮におけるIFの重要なストレス保護機能によるものである。 IFは一般に、基底条件下で最も豊富な細胞タンパク質の中に含まれていますが、様々なタイプのストレスの間にさらに強く誘導されます¹⁰ 。例えば、線虫C.elegansのプロテオーム全体の変化を評価した最近の研究では、複数のIFが高度に上方制御され、凝集しやすいことが示された生物老化中に11,12。適切なIF構造の維持は、様々な形態のストレスに対する細胞の抵抗性にとって必須であるため、IF凝集はまた、老化中の機能低下に寄与し得る。しかしながら、ストレスを受けている異なる組織にわたって複数の哺乳動物IFタンパク質を試験する生物学的レベルの研究は欠けている。

IFは、細胞の要求を満たすために適応する高度に動的な構造である。ケラチンは、例えば、可溶性（非糸状）および不溶性（糸状）タンパク質プール¹³間の生合成に依存しないサイクリングを受ける。通常の生理学的条件下では、非イオン性界面活性剤Nonidet P-40に可溶化することができる約20％と比較して、洗浄剤を含まない緩衝液中で全K8 / K18プールの約5％を抽出することができ、 X100 ^{14 、 15} 。有糸分裂の間に、表皮ケラチンではあまり明らかではないが、ビメンチンおよび他のIII型IFタンパク質においてより明白である単純型上皮K8およびK18 ^14の溶解性が顕著に増加する^15,16 。 IFタンパク質の溶解特性は、フィラメント再配列および溶解性のための重要な翻訳後修飾（PTM）であるリン酸化によって厳密に制御されている17,18,19,20。ほとんどのIFは、保存された部位で多数のPTMによって広範な調節を受け、機能的変化をもたらす¹⁷ 。

この方法の目的は、複数のマウス組織にわたるIFタンパク質の研究のための生化学的抽出および分析方法に、IF分野の新しい研究者を紹介することである。特定我々は、高塩抽出法を用いたIFタンパク質の単離と、質量分光法およびPTM標的抗体によるPTMの変化の評価に焦点を当てている。これらの方法は以前に公表された手順²¹に基づいているが、異なるIFタンパク質型を抽出するための改変を含み、IFファミリーにわたる調節のための共通機構を明らかにする。例えば、特定のリジン残基でのK8アセチル化はフィラメントの組織化を制御するが、高アセチル化はK8不溶性および凝集体形成を促進する²² 。最近の世界のプロテオミクスプロファイリング研究は、ほとんどの組織特異的IFタンパク質もまたアセチル化の標的であり、ほとんどのIFアセチル化部位が高度に保存されたロッドドメインに限定されることをさらに明らかにした。これにより、IFシステムのグローバルプロファイリングに適したメソッドの必要性が強調されます。我々はまた、optiでの自動ホモジナイゼーションを用いて複数の組織からIFタンパク質を単離する迅速な方法を紹介する溶解した溶解マトリックス。得られた調製物は、質量分析および他の方法による下流のPTM分析に適している。

プロトコル

このプロトコルは、ノースカロライナ大学の施設内動物管理および使用委員会（IACUC）に従って承認され、実施されます。

1.準備

1. トリトン-X緩衝液（1％トリトンX-100,5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、pH7.4中の容量を出す）を調製する。 500mLにするには：Triton X-100と500mM EDTAをそれぞれ5mL加え、PBS490mL、pH7.4に入れる。 Triton-X緩衝液は4℃で保存してください。
2. 高塩緩衝液（10mM Tris-HCl、pH7.6,140mM NaCl、1.5M KCl、5mM EDTA、0.5％Triton X-100、二倍蒸留（dd）H ₂ O中に容量を持ち出す）を調製する。 500mLを作るため：0.5M Tris-HCl（pH7.6）10mL、5M NaCl 14mL、KCl55.9g、0.5M EDTA5mLおよびTriton X-100 2.5mLを撹拌し、容量を500に調整するmLとなるように希釈した）。ハイソルトバッファー溶液は4℃で保存してください。
3. 使用直前に、適切な量のTriton-XおよびHigh Salt Buffer（
4. 1×PBS、pH 7.4中で5mM EDTAを調製する。 500mLを作るために：0.5M EDTA5mLを1xPBS、495mLに撹拌する。
5. 獣医学のガイドラインと制度上の基準に準拠した承認されたプロトコルを使用して、異なるマウスの器官（脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、結腸、腸、腎臓、脾臓）を分離する。組織収集手順は、プロテアーゼが豊富な組織（ 例えば、膵臓を最初に処理すべきである）のRNAおよびタンパク質の完全性を保存するために、5分を超えてはならない。
6. その後のRNA抽出、cDNA合成、およびIF遺伝子発現の定量的リアルタイムPCR解析のために、少量の組織（約5〜20mg）を切断し、RNA保存液に入れます。組織を含むRNA保存液チューブを4℃で一晩置き、さらにプロトコールに従う貯蔵および隔離ステップ。
7. 組織の残りの部分をより小さな断片（ 例えば 0.5cm）に切断し、冷凍瓶に入れる。長期保管の場合はバイアルを-80℃または液体窒素でスナップフリーズして保管してください。

IF遺伝子発現解析

1. RNA貯蔵溶液試薬中に保存された組織からRNAを抽出する。製造業者のプロトコールに従って、任意の適切な/好ましいRNA抽出方法を使用する。
2. RNA濃度を定量し、2μgのRNAを使用して、製造業者のプロトコールに従って適切な逆転写キットを使用してcDNAを生成する。
3. 生成されたcDNAおよびマウスIF遺伝子特異的プライマーを使用して、各サンプルの3つの技術的複製ならびに製造業者のプロトコルによるブランク対照を含むqPCR反応をセットアップした。
4. IF遺伝子発現を、異なる条件（ 例えば、若い組織と古い組織）を比較した倍率変化として定量化する。

3.Pイムノブロット用の全組織溶解物の修復

1. 1mLの2×非還元SDSサンプルバッファー中で25mgの組織をホモジナイズする。タンパク質濃度を定量するために比色分析を行う場合は、ブロモフェノールブルー染料をサンプルバッファーから除きます。
2. 還元メルカプトエタノール（2-ME）を5％（v / v）添加して還元サンプルを調製する。非還元性サンプル200μLに10μLの2-MEを加える。
3. 界面活性剤および還元剤適合性タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定する。色素が既にサンプルバッファーに含まれている場合、タンパク質量は、クーマシーベースの染色²⁴を含む多くの技術によってゲルを実行した後に推定することができます。
4. すべてのサンプルをボルテックスし、95℃で5分間加熱する。
5. 還元条件と非還元条件の両方でウェスタンブロッティングを行います。膜を短時間露出させてモノマー種を明らかにし、より長い時間（> 1分）で高分子量複合体含有物を明らかにするIFタンパク質。凝集をモニタリングする場合、ゲル/膜全体（ゲルウェルの底を含む）を調べる。
6. 平行ゲルを実行し、ローディングコントロールとしてタンパク質染色で染色する。疾患モデルまたは傷害実験では、ハウスキーピングタンパク質（ 例えば、アクチン、GAPDH）のイムノブロットとは対照的に、ストレス条件の違いによって後者が変化するので、ローディングコントロールとして全タンパク質染色を使用すべきである。

4.組織特異的IFの界面活性剤可溶性および高塩濃度抽出物の調製

1. 氷冷したTriton X-100緩衝液1 mLをガラス管ホモジナイザーに加え、氷上に置きます。
2. 液体窒素保存液から少量の組織（〜25 mg）を取り出し、ガラスホモジナイザーに直接入れる。ホモジナイズ（50ストローク）し、気泡を作るのを避けるために、ポリテトラフルオロエチレン乳棒を使用してください。常にホモジナイザーとライゼートを冷たく保ちます。
3. ライセートを1.5 mLのmicrに移す遠心チューブを氷上に置き、予め冷却した遠心分離機（4℃）で20,000×gで10分間遠心する。
4. 上清画分を別のチューブに集める。これは、トリトンX可溶性画分であり、免疫沈降（Ip）およびIFタンパク質の界面活性剤可溶性プールの分析に使用することができる。脳組織からより清潔なIF抽出物を得るために、ステップ4.1-4.4を繰り返すことができることに留意されたい。
5. 組織ペレットに1 mLのHigh Salt Bufferを加え、清潔なホモジナイザーに移し、100ストロークを飛ばします。ホモジネートをマイクロ遠心チューブに戻して移し、チューブを冷たい部屋の回転シェーカーに1時間置きます。
6. ホモジネートを20,000 xgで4℃で20分間遠心分離する。上清を捨てる。
7. 氷冷PBS / EDTAバッファー1 mLをペレットに加え、クリーンホモジナイザーでペレット（20ストローク）を最終的なクリーンアップステップ*としてホモジナイズします。新しいチューブに移し、4℃で20,000×gで10分間遠心分離して、IFタンパク質 -高濃度高塩抽出物（HSE）である。
   *任意に、この段階でホモジナイズの代わりにボルテックスする。
8. 上清を捨て、予熱した非還元性SDSサンプルバッファー300μLにペレットを溶解する。最初にピペッティングとボルテックスでペレットを壊し、95℃で5分間サンプルを加熱する。
9. ペレットが確実に溶解するように必要に応じてボルテックスおよびピペットをかけます。ペレットを完全に溶解させるのに数分かかることがあります。
10. すべてのサンプルを分析まで-20℃で保存する。

5.大量実験におけるIFタンパク質抽出のための自動化組織溶解

1. RNA抽出のために、溶解マトリックスD（小さなセラミック球を使用する）を入れたチューブに溶解緩衝液（組織25mgあたり600μLの緩衝液）を置き、組織ライザーで25秒間2回パルスする。 20,000 xgでの遠心分離によってマトリックスから溶解液を分離し、次の工程に分離する。
2. タンパク質の抽出には、Trit溶解マトリックスSS（単一のステンレススチールビーズを使用）を含む溶解チューブ中で、X-100（または全溶解物を調製する場合はSDSサンプルバッファー）上に置く。複数のマトリックスを試験した後、これは、伝統的な計量法と同様の品質のIFタンパク質抽出物を生成するため選択された。自動化された方法は、膵臓および脾臓に最適ではなく、これらの組織に標準的なホモジナイゼーションプロトコルを使用する必要があることに注意してください。
3. High Salt Extractの調製を進めるには、磁石を使用してステンレスビーズをチューブから取り出し、チューブを20,000 xgで10分間4℃で遠心します。
4. 手動プロトコルのステップ4.4（上記）に進みます。
5. すべてのサンプルを分析まで-20℃で保存する。

翻訳後修飾IFタンパク質の免疫濃縮

1. PBST緩衝液（PBS中0.02％Tween-20）を調製する。 50mLを調製するために、10mLのTween-20を50mLのPBS（pH7.4）に加える。
2. PTM抗体を調製する（PBST200μL中の抗体1〜10μg）。一般に、3μgの抗体/反応は、必要に応じてさらに最適化できる良好な開始条件である。
3. 各反応について、50μLの磁性ビーズを微量遠心管に分注し、磁石の上に置き、ビーズ保存液を吸引します。
4. ビーズを抗体溶液に再懸濁し、室温で20分間、ローテーター（少量の混合を確実にするためにエンドオーバーエンド）でインキュベートすることにより、ビーズを免疫沈降抗体に結合させる。
5. チューブを磁石の上に置き、抗体溶液を吸引する。
6. 200μLのPBSTで1回抗体結合ビーズをすすぎ、洗浄バッファーを除去する。
7. 0.6-1mLの組織溶解物をビーズに加え、穏やかなピペットで混合し、冷たい部屋の回転器で3時間インキュベートする。
8. チューブを磁石の上に置き、溶解物を除去し、200μLのPBSTでビーズを5回洗浄する。最後の洗浄ステップの後、ビーズを100μlで収集し、6; LのPBS（Tween-20無し）で清潔な新しいチューブに移す。チューブをマグネットの上に置きます。
9. PBSを吸引し、100μLの非還元サンプル緩衝液を加える。 50μLを除去し、2-ME（5％）を加えて還元サンプルを作製する。試料を95℃で5分間加熱する。
10. 磁石上のビーズからip分画を分離し、新しいチューブに集める。
11. 分析まで-20℃でサンプルを保存する。

質量分析のためのIFタンパク質試料の調製

1. 質量分析の分析には時間とコストがかかりますので、研究を開始する前にプロテオミクスの専門家に相談してください。
2. 汚染を避けるために特別な注意を払ってください。きれいな手袋ですべてのゲルを取り扱い、清潔な容器でインキュベートし、ddH ₂ O（石鹸を避ける）のみを用いて洗浄する。
3. 標準条件に従ってSDS-PAGEゲル上で20〜50μLのHSEサンプル（セクション4および5から）を流してください。
4. タンパク質染色で1時間染色する。複数回すすぎ、ddH ₂ Oで一晩脱脂する。 IFタンパク質バンドは脱染色後に容易に見えるはずである。
5. ゲルをプラスチック製のシートプロテクターの間に置き、分析のために切除して送るバンドをスキャンしてマークします。
6. 新しいきれいなかみそりを使用してIFタンパク質バンドを切り出します。
7. ゲルバンドを清潔なマイクロ遠心チューブに入れ、質量分析装置に移す。

結果

溶解マトリックスを用いた複数のマウス組織からのIFタンパク質の高塩ベース抽出のための新しい高速方法。

上皮組織からの中間フィラメントタンパク質画分の大部分を単離する従来の方法^{25,26 は、}ここでは9つの異なる器官および組織溶解のためのより迅速な手順を含むように改変された。伝統的な方法には3つの手動均質化段階が必要であるが、修正された手順は1つの手動均質化段階のみを有するため、特に6つを超えるサンプルを処理する場合に数時間短縮する。 図1Aは、9匹のマウス組織からのHSEの典型的な結果を示し、組織中の予想されるタンパク質の表および各タンパク質の分子量を図1Bに示す

ディスカッション

IFタンパク質が細胞および組織ストレスのマーカーおよびモジュレーターの両方であるため、IFタンパク質の生化学的特徴付けを可能にする方法は、哺乳類系における多数の病態生理学的現象を理解するのに有用であり得る。現在の方法の背後にある原則は、一般に低塩類溶液および高塩溶液を使用する細胞および組織からIFタンパク質を単離し、分離し、再構成するための1970年代および1980年代に開発された初期手順に基づいており、Triton-X100界面活性剤25,30,31,32 ^{、 33,34,35} 。 IFタンパク質の生化学的分離を支持する研究への歴史的な洞察のために、最近のレビュー^36,37を見てください。現在の方法シンプルな上皮ケラチンの研究のために開発されたより最近のプロトコルに基づいている²⁶ 。この方法の利点は、IF分野に初めての研究者がほとんどの哺乳動物組織からIFタンパク質を効果的に単離できるようにするための初期段階として役立つことである。これは、IFタンパク質規制21,38...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Dynabeads Protein G	ThermoFisher Scientific	10009	免疫沈降ビーズ
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	バッファー用
Purelink RNA ミニキット	ThermoFisher Scientific	12183018	組織からの RNA 抽出
Purelink DNAse カラム	DNA 消化
Dynamag-2	ThermoFisher Scientific	12321D	磁石 ダイナビーズ用
GelCode Blue Stain 試薬	ThermoFisher Scientific	24592	質量分析対応ゲル染色
Pierce ECL ウェスタンブロッティング基質	ThermoFisher Scientific	32106	ウェスタンブロット用
大容量 cDNA 逆転写キット	ThermoFisher Scientific		遺伝子発現解析に使用する
Proflex 3 x 32-well PCR System	ThermoFisher Scientific	4484073	PCR System
PVDF transfer membrane	ウェスタンブロット用	ThermoFisher Scientific	88520
Power Up SYBRマスターミックス	qPCR分析用	ThermoFisher Scientific	A25778
RNAlater	単離前の組織保存用	ThermoFisher Scientific	AM7020
Novex 4-20% Tris Glycine Gel	ThermoFisher Scientific	XP04205BOX	Precast protein gel
Anti-Keratin 8抗体 (TS1)	ThermoFisher Scientific	MA514428	K8 のウェスタンブロット検出用
抗ビメンチン	ThermoFisher Scientific	MA511883	ビメンチン
トリス グリシン転写バッファー (25x)	ThermoFisher Scientific	LC3675	タンパク質ゲルのウェットトランスファー用
2x SDS Sample Buffer ThermoFisher	Scientific	LC2676	用タンパク質ゲルサンプル
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)	ThermoFisher Scientific	LC26755	ランニングタンパク質ゲル用
Lysing ビーズ - Matrix D	MP Biomedicals	116913100	組織破壊およびRNA抽出用のLysisビーズおよびマトリックスチューブ
溶解ビーズ - Matrix SS	MP Biomedicals	116921100	組織破壊およびタンパク質抽出用のLysisビーズおよびマトリックスチューブ
NanoDrop Lite 分光光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ND-LITE	タンパク質と核酸の測定
Precellys 24 ホモジナイザー	Bertin Instruments	EQ03119	自動組織ホモジナイザー