この研究では、血小板の接着、広がり、および分泌の流れを調べるための蛍光顕微鏡検査に基づく方法を説明しています。この多目的プラットフォームは、血栓症および止血に関する機械的研究のための血小板機能の調査を可能にする。
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方法論記事
流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
血小板は、止血における重要な役割を果たし、血管侵害を封鎖するための血栓の形成である。それらは血栓症、脈管構造を閉塞させ、器官を傷つける血栓の形成にも関わり、生命を脅かす結果となる。これは、血小板機能に関する科学的研究と、フロー条件下で起こる細胞生物学的プロセスを追跡する方法の開発を促す。
血小板の生物学における2つの重要な現象である血小板の接着と凝集の研究には、さまざまなフローモデルが利用できます。この研究は、活性化の間の流れの下でのリアルタイム血小板脱顆粒を研究する方法を記載している。この方法は、広視野の逆LEDベースの蛍光顕微鏡の下に置かれたシリンジポンプ装置に連結されたフローチャンバを利用する。ここで説明する設定は、蛍光標識された抗体またはフルオレセインによって送達される複数のフルオロフォアの同時励起を可能にする染料。生細胞イメージング実験後、カバーガラスは、静的顕微鏡法（ すなわち、共焦点顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を用いて、さらに処理および分析することができる。
概要
血小板は、血流中を循環する無核細胞である。彼らの主な機能は、損傷の部位での血管侵害を封鎖し、失血を防ぐことである。損傷のこれらの部位では、内皮下コラーゲン繊維が露出され、続いて多量体タンパク質、フォンビルブラント因子（VWF）によって覆われる。 VWFは、細胞表面1上の糖タンパク質Ibα-IX-V複合体に依存し、血小板の速度を減速させる機構において血小板と循環して相互作用する。これは、高剪断速度において特に重要である。その後、血小板は、コラーゲンから活性化インパルスを受けながら形態学的変化を受ける。これは不可逆的な広がりをもたらし、最終的には血小板の凝集をもたらす。両方のプロセスは、血小板 - 血小板のクロストークを促進するために顆粒内容物の分泌に依存する。とりわけ、血小板α顆粒は、血小板接着を助け、橋渡しするためにフィブリノゲンおよびVWFを含むインテグリン依存的に血小板を結合する。血小板高密度顆粒は、カルシウムおよびアデノシン二リン酸（ADP）を含む無機化合物2を含み、血小板活性化を強化するのに役立つ。さらに、血小板は、（アレルギー性）炎症3 、補体制御タンパク質4および血管新生因子5,6のメディエーターを含有し、これらの内容物が様々な条件下でどのように差異的に放出されるかおよびどのように放....
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プロトコル
この研究のものを含む、 生体外での研究目的のために、血液の採取を承認した大学医療センターユトレヒトの地方医療倫理委員会。
1.ソリューションの準備
- 10mMのHEPES、0.5mMのNa 2 HPO 4、145mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgSO 4 、および5.55mMのD-グルクロン酸を溶解することによって4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）タイロード緩衝液を調製する。蒸留水中のグルコース。
- 緩衝液の2つの変異体を作製する：pHレベルをそれぞれ6.5および7.4に設定する。実験の毎日のために新鮮な緩衝液を作る。 10 ng / mLのプロスタサイクリンを補充する。
- 50mM Trisと150mM NaClを蒸留水に溶解し、pHを9.0に調整してTRIS緩衝食塩水（TBS）を調製します。
- 85 mMクエン酸三ナトリウム、71 mMクエン酸、111 mM D-グルコースを溶解して酸クエン酸デキストロース（ACD）を調製する。澄んだ水。
- HEPESタイロード緩衝液（pH 7.4）に2％（v / v）パラホルムアルデヒド（PFA）を加えて固定液を調製する。溶解させるために加熱し（50〜70℃）、pHを7.4に設定する。等....
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結果
図1は、フローチャンバおよび実験装置の画像を示す。シリコンシートの位置および寸法;チュービング接続。 図2は、フローチャンバーの寸法の詳細を示しています。 図3およびムービー1は、固定化されたVWF上の血小板接着および広がりの画像の時系列を示す。 CD63は、休止血小板15の細胞内高密度顆粒膜に挿入される膜貫通タンパク質である。血小板表面へのその時間依存的動員は緑色で示されている。同様に、P-セレクチン（Psel）は、休止血小板の細胞内α-顆粒の膜に挿入された膜貫通タンパク質である。血小板表面へのその時間依存的動員はオレンジ色で示されている。 図3Bは、45°の角度での代表的な画像を示すフロー実験後に共焦点蛍光顕微鏡によって取得した。 映.......
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ディスカッション
世界中で、血栓症は死亡および罹患率の主要な原因であり、血小板はその発症の中心的役割を果たす。この研究は、血小板脱顆粒の生細胞イメージングのための方法を記載している。一般に、血小板が活性化されると、全ての顆粒状の内容物が直接溶液中に放出されると想定される。付随する結果は、これが必ずしも当てはまらないことを示唆している。接着および脱顆粒の間、血小板はかなりの量のポリリン酸を保持する（ 図4 ）。さらに、多量体タンパク質VWFは、脱顆粒後の血小板表面と関連している（ 図5 ）。これは、血小板顆粒脱顆粒を制御する分子機構が、一般的に想定されているよりも微妙であることを示している。
流れの下での血小板脱顆粒の生細胞イメージングを可能にするために、実験条件を選択して血小板凝集を最小限に抑えた。血小板カウンター150,000血小板/μLのtsが使用された。これは正常範囲の下限にある（150,000〜450,000血小板/μL）。さらに、固定化されたVWFまたはフィブリノーゲンについて、血小板接着および広がりを調べたところ、軽度の.......
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開示事項
著者は何も開示することはない。
謝辞
CMは、C1-インヒビター欠損症（HAEi）、Viralen van Het UMC Utrecht、およびLandsteiner for Blood Transfusion Research（LSBR）の国際患者医療機関からの資金援助を認めています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| プロスタサイクリン | ケイマンケミカル | 18220 | |
| エン酸三ナトリウム | メルクKGaA | 1.06448 | |
| クエン酸 | メルクKGaA | 1.00244カバー | |
| メガネ | Menzel-GLäser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm、No.1 = 0.13 - 0.16 mmの厚さ。 |
| クロム硫酸(2%CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]。 |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | ||
| 採血管、9 mL、9NC 凝固クエン酸ナトリウム 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell Analyser | アボット・ダイアグノスティック | CELL-DYN 血液分析装置 | |
| パラホルムアルデヒド | Sigma | 30525-89-4 | |
| シリンジポンプ | ハーバード装置、マサチューセッツ州ホリストン | ハーバード装置22 | |
| 10 mLシリンジ、直径14.5 mmの | BD biosciences | 305959 | Luer-Lokシリンジ |
| 抗CD63-ビオチン | アブカム | ||
| 抗CD62P-ビオチン | R&D Systems | Dy137 | |
| 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| ストレプトアビジン、Alexa Fluor 488コンジュゲート | Thermo Scientific | S11223 | |
| 浸漬油 | ツァイス | 444963-0000-000 | |
| 洗剤溶液 | ユニリーバ、バイオテックス | ||
| グリシン | シグマ | 56-40-6 | |
| ポリビニルアルコール | シグマ | 9002-89-5 | ビオール40-88。 |
| トリス塩酸塩 | シグマ | 1185-53-1 | |
| 1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン価 (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa Fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| グリセロール | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn フィルム | Bemis | PM-996 | 4 インチ x 125 フィート ロール。 |
| シリコンシート、非強化 | 、Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm。 |
| 灌流と真空チャンネルを備えたカスタマイズされたカットシリコーンシート | 製 | シリコーンシート製 非強化 (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL チューブ | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| 蛍光顕微鏡 | ツァイスオブザーバー Z1 | LED励磁灯を装備。 | |
| 顕微鏡ソフトウェア | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic Pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL 非滅菌、最大 3 mL まで目盛り付き。 |
| シリコンチューブ | VWR | 228-0656 | 内径 x 外径 x 肉厚 = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm。 |
| 顕微鏡スライド | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm、接地端 45 °deg;、つや消し端。 |
参考文献
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013). <....
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