四バイオセンサープラットフォームを用いた高親和性抗体の抗原結合速度の決意

Summary

私たちは4つの一般的に使用されるバイオセンサープラットフォームを使用して、抗体 - 抗原結合親和性および動態の測定のために、ここでのプロトコルを記述します。

Abstract

ラベルフリー光学バイオセンサは、生体分子の相互作用の特徴付けのため、創薬における強力なツールです。本研究では、人間のプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9型（PCSK9）に対する10高親和性モノクローナル抗体（mAb）の結合親和性と動態を評価するために私たちの研究室で4つの日常的に使用バイオセンサープラットフォームの使用を記載しています。ビアコアT100とのProteon XPR36双方が十分に確立された表面プラズモン共鳴（SPR）技術から派生しているが、後者は即興6×6十字を介して並列に36個の反応スポットを呈するのに対し、前者は、直列流れ構成で接続された4つのフローセルを有しますマイクロ流体チャネル構成。 IBIS MX96は、空間方向で検出を提供する付加的な撮像機能と、SPRセンサ技術に基づいて動作します。連続流Microspotter（CFM）と結合され、この検出技術は、電子によって著しくスループットを拡張します同時に96反応スポーツの多重配列印刷および検出をnabling。対照的に、オクテットRED384は、光ファイバプローブは、先端面での結合相互作用に干渉パターンの変化を検出するバイオセンサーとして作用して、生物層干渉法（BLI）の光学原理に基づいています。 SPRベースのプラットフォームとは異なり、BLIシステムは、連続流動流体に依存していません。彼らは軌道攪拌中384ウェルマイクロプレートの検体溶液中に浸漬している間代わりに、センサチップは、測定値を収集します。

これらのバイオセンサープラットフォームは、それぞれ独自の長所と短所があります。 1分子間相互作用モデル：品質動態データを提供するために、これらの機器の能力の直接比較を提供するために、記載されているプロトコルは、単純な1に適合し、抗体 - 抗原動態を特徴づけるために、同じアッセイフォーマットを使用した実験と同じ高品質の試薬を示して。

Introduction

抗体-抗原相互作用を特徴付けるための信頼性の高い速度論的パラメータの取得は、創薬および開発プロセスの重要な要素です¹。これらの相互作用をリアルタイムで検出するための「ゴールドスタンダード」である光学表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサーは、約20年間、基準を満たす治療用抗体候補の早期選択を可能にするために使用されてきました^2,3。粗上清の迅速な結合スクリーニングによる抗体候補の親和性ランキングの提供に加えて⁴、精製された製剤の厳密な動態定数測定⁵、バイオセンサーは、エピトープビニング研究を通じてリード候補の機能活性をさらに区別することができます6^,7。

さまざまな治療適応><症に対する抗体ベースの製品の需要の高まりに対応するため、近年、候補の同定と特性評価の効率を向上させる革新的なバイオセンサー機器が数多く開発されています^9,10.これらの機器は、マイクロ流体チャネル構成の設計や、生体分子相互作用の検出に関与する光学原理が異なります。具体的には、Octet RED384¹¹、ProteOn XPR36¹²、IBIS MX96^{7 では、}1 回の結合サイクルで測定されるインタラクションの数がそれぞれ 16、36、96 に拡大され、従来の Biacore プラットフォームよりもスループットが大幅に向上しています。これらのさまざまなバイオセンサープラットフォームはすべて、抗体-抗原相互作用の特性評価に不可欠な速度論的データを提供しますが、機器構成が異なるため、実験のセットアップと操作手順が異なります。例えば、IBIS MX96のSPRイメージングアレイプラットフォームでは、マルチプレックスリガンド固定化ステップは、検出器とは別の外部印刷装置でオフラインモードで実行されます^7,13;対照的に、他の3つのバイオセンサープラットフォームは、活性化試薬、リガンド、分析物のいずれであっても、センサー表面への成分の添加がリアルタイムで、事前にプログラムされたコマンドを通じて順番に記録される「オールインワン」セットアップを採用しています。Octet RED384では、このBioLayer Interferometry(BLI)ベースのプラットフォームのユニークな特徴は、即時の「ディップアンドリード」使用^{14のためのプレコート光ファイバーバイオセンサーの利用可能性であり}、SPRベースのプラットフォームのセンサーチップにしばしば必要とされるリガンド表面調製および開始/コンディショニングステップの必要性を排除します。また、この装置の流体を使用しない設計により、メカニズムが簡素化され、粗サンプルを扱う際の目詰まりや汚染の懸念が回避されます。ProteOn XPR36 の斬新な 6 x 6 交差流体設計により、流路を水平方向と垂直方向の間で切り替えて 36 個のインタラクションスポットを作成することにより、「ワンショット」キネティクスアプローチを実装できます¹⁵。従来のシリアルフローBiacore T100プラットフォームのように、一度に1つのリガンドまたは分析物濃度の結合速度を評価する代わりに、このアプローチでは、1回の結合サイクルで最大36の異なる相互作用を同時にモニタリングすることができます。

違いにもかかわらず、これら4つのバイオセンサープラットフォームは、世界中の多くの研究所で広く使用されています。バイオセンサーの実地体験がほとんどない新規ユーザーにとって、装置設計の違いを考えると、どの装置を使用するかを決定するのは難しい作業になる可能性があります。彼らの研究目的に最も適した装置を決定するには、データ品質、性能の一貫性、スループット、操作の容易さ、材料消費などの要素をまとめて考慮する必要があります。いくつかのベンチマーク研究では、複数の研究所やバイオセンサーから得られた運動速度定数の変動性が調査されています^5,16、最近発表された直接比較研究では、機器性能の観点からデータの信頼性に影響を与える系統的な要因にさらに対処しています^17,18.このビデオで提供されているプロトコルは、実験のセットアップと手順に詳細に焦点を当てており、研究論文「高親和性抗体抗原結合速度の評価におけるバイオセンサープラットフォームの比較」¹⁷が付属しています。これらのプロトコルは、新しいバイオセンサーユーザーがこれらの機器を研究目的で実装するのを支援するだけでなく、現在のバイオセンサーユーザーに、高親和性抗体-抗原相互作用を評価するための実験デザインにおける技術的な課題と考慮事項に関する追加の洞察を提供することを目的としています。

Protocol

1.タンパク質および抗体

1. 以前に^17を説明したようにタイプ9（PCSK9）ケキシンヒトプロタンパク質転換酵素サブチリシン及び10のマウス由来抗PCSK9モノクローナル抗体を産生し、精製。
2. 順次UPLCシステム^19を使用して、分析用サイズ排除（SEC）カラムに各試料の10μgのを注入することにより精製された産物の純度を評価します。

ビアコアT100 2.動的測定

1. インストゥルメントおよび試薬の調製
   1. 15分間室温でCM5センサーチップを平衡化。
   2. 200mMの1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）、室温で50mMのN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）の2つの200μLアリコート二200μLのアリコートを解凍。
   3. 1×HBS-EP（10mMのHEPES [pHを7.4]、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005％v / vのポリソルベートP20）ジによるランニング緩衝液の1リットルのボトルを製造水で10倍HBS-EP +原液を合着。
   4. HBS-EPランニング緩衝液中0.063μgの/ mLで10mM酢酸ナトリウム（pH4.5）中で30μgの/ mLでプロテインA / Gの1ミリリットルを用意し、各mAbサンプルの500μL。氷の上のヒトPCSK9の凍結バイアルを解凍します。
   5. 制御ソフトウェアでは、クリックして「ツール|イジェクトチップ」は、シースと密接にセンサチップを配置します。 、室内温度としてC°分析温度などのC°「25」を入力し、「10」|「設定温度ツール」をクリックしてください。
2. 表面固定化
   1. 「|新しいウィザードテンプレート/ファイルを開く」と左側のパネルのリストから、「固定化」を選択する制御ソフトウェアでは、クリックしてください。
   2. 固定設定ウィンドウを入力して、「新規作成」をクリックします。チップタイプとして「CM5」を選択し、サイクル当たり「1」のフローセルを選択。
   3. 次の各ACTIVAに「フローセル1/2/3/4を固定する」のチェックボックスをオンにしオプションをしte。すべてのフロー・セルのための方法として、また「アミン」「固定化レベルを目指す」を選択します。
   4. リガンドとして「を30μg/ ムル・プロア / G」を入力し、目標レベルは、フローセルの全ては、「10000」応答単位（RU）に設定されていることを保証します。
   5. 「実行前首相」を確認し、「次へ」をクリックしてください。 「2ラック試薬」を選択し、それに応じて個々の試料バイアルに試薬ピペットの場所を定義します。バック機器をラックに挿入し、「スタート」をクリックして、実行を開始するために保存する実験名を入力します。
3. 検体は、バインディングと再生サイクル
   1. 「|新規メソッド/ファイルを開く」、「HU PCSK9に結合する20140812 HU抗PCSK9 IgGを」を選択し、メソッドを開く]をクリックします。メソッドのパラメータを確認します。
   2. 「アッセイ手順」において、パープ」で選択された「サンプル」との名称である「HU PCSK9」は、10サイクルがあることを確認OSEは 『1」。複製番号がに設定されています』。
   3. 「サイクルタイプ」で、「2」、流路にわたってキャプチャ1のために、「220」秒の接触時間を設定し、「110」のキャプチャ2の流路にわたって「3」、流路にわたってキャプチャ3は、「55」の"4"。流量は、キャプチャサイクルのすべてのための「10」μL/分です。
   4. 「サンプル1」を選択し、変数として「サンプル・ソリューション」をご確認ください。 「600」の解離時間を「1、2、3、4」の流路上「2700」Sに接触時間を設定します。流量は「30」μL/分に設定されています。
   5. 溶液フィールドに「グリシン-HCl pHが1.5」を入力し、「20」の流路上の「1、2、3、4」との接触時間を設定し、「再生1」を選択します。
   6. "変数の設定" で、 "100 nMの - 6.25 nMで" の2倍滴定濃度を入力サイクル1-3のために、 "50 nMの - 3.12 nMの" サイクル4-8のために、 "5 nMの - 0.323 nMで" Fまたはサイクル9-10。
   7. 「セットアップファイル名を指定して実行」、検出流路を選択し、「2-1、3-1、4-1」では、「次へ」をクリックし、「実行前総理」をチェックし、「次へ」をクリックしてください。
   8. 「1ラック検体と試薬」を選択し、それに応じて個々の試料バイアルに試薬ピペットの場所を定義します。機器をラックに挿入し、「スタート」をクリックして、実行を開始するために保存する実験名を入力します。
4. BIA評価を使用したデータの分析
   1. 「速度論/親和性|表面がバインド」をクリックし、Fcと選択し、「2-1」、「3-1」、または「4-1」別に、様々な分析物濃度から表示された曲線と同様に「ゼロ」のすべてをチェック濃度のブランク。
   2. バッファのブランクを差し引い曲線を得るために、「次へ」をクリックしてください。フィット運動parameを得るために：「1バインディング1」モデル、および「フィット」をクリックし、「動態は、」選択しクリックしてくださいTERS。
   3. 複数のmAbの表面のグローバルフィッティングについては、下にある「複数のR _最大 」 _をクリックし、リストに同じモノクローナル抗体のために他からFcsからの結合曲線を追加します。
   4. 結合曲線を差し引いバッファブランクの全てを取得するために、「次へ」をクリックしてください。 「：1バインディング1」モデルを、グローバルに装着動態パラメータを取得するためのパラメータで各R _maxの「ローカルフィット」を選択すると選択「カイネティックス」をクリックしてください。

ProteonのXPR36 3.反応速度測定

1. インストゥルメントおよび試薬の調製
   1. GLMセンサチップとPBS-T-EDTAの2-Lボトル（PBS [pH7.4の]、0.005％のTween-20、および3mMのEDTA）を室温で15分間ランニング緩衝液を平衡化。
   2. 制御ソフトウェアでは、「取り出し」して、GLMチップを挿入します。チップ温度℃〜「25」とオートサンプラー温度℃〜「10」に設定。「グリセロールの初期化」をクリックして、チップを初期化するように要求指示に従ってください。
   3. 「ファイル|開く」をクリックし、リストから前処理プロトコルを、96ウェルプレートに溶液を調製します。次に、「ファイル名を指定して実行」をクリックし、プロトコルを選択し、「開始」をクリックします。
   4. 400mMのEDCの1 mLのアリコートを、室温で100mMのN-ヒドロキシ（スルホ-NHS）の1mLのアリコートを解凍。
   5. PBS-Tで0.25 / mlの、0.125 / mlの、および0.063μgの/ mLで10mM酢酸ナトリウム（pH4.5）中で60μgの/ mLでプロテインA / Gの2ミリリットルを用意し、各mAbサンプルの500μLバッファを実行している-EDTA。氷の上のヒトPCSK9の凍結バイアルを解凍します。
2. 固定化、分析物は、バインディングと再生
   1. 「|新|新しいプロトコルファイル」をクリックしてください。 「設定」で、実験名を入力し、「GLM」チップを選択し、「マイクロプレート」を選択し、「2.2」mL容量を入力します。
   2. 選択"プロトコル|サンプル"、F1-F6における "不活性化剤" として、G1-G6において "リガンド" とウェルH1-H6、 "プロテインA / G" の "活性化剤" として "エタノールアミン" "EDC /スルホ-NHS" を定義"C1-C6であり、 "リガンド検体" として "ヒトPCSK9 "として" ブランク" として "E1-E6で "再生器"、PBS-T-EDTAとして、 "グリシン"" D1-D6において、" モノクローナル抗体Xのサンプル第二の96ウェルプレート中のウェルH1-H6です。
   3. 「手順」、「プロトコル・エディタ」でダブルクリックし、「固定化」を選択し、手順は「30」μLの流速で3次の水平EDC /スルホ-NHSの注射、プロテインA / G、および1 Mエタノールアミンをそれぞれ含みます/分であり、「300」秒の接触時間。
   4. 「再生成」をクリックし、PBS-T-EDTAの二つの「60」-sパルスに続いて水平方向と垂直方向の両方に「100」μL/分のグリシンの三つの「18」-sパルス液（pH 1.5）、注入"25" μL/分また、両方向インチ
   5. 「リガンド」をクリックし、「25」μL/ minの流速及び「160」秒の接触時間を用いて、垂直方向におけるmAb 2のmAb 1を注入します。
   6. その後会合時の「600」のための「40」μL/ minで、ヒトPCSK9（2倍連続希釈で6.25 nmの100 nm）を同時に6つの水平チャネル上ブランク緩衝液の5つの濃度を注入し、「分析物」をクリック解離時間の「2700」のことで。
   7. 「再生成」をクリックし、水平方向と垂直方向の両方に「100」μL/分のグリシンの二つの「18」-sパルス液（pH 1.5）を注入します。
   8. 残りのmAb各結合サイクルの後、上記の手順を繰り返します。
      注：100 nMのに加えて - 6.25 nMでヒトPCSK9濃度シリーズ、25 nMの - 1.56 nmおよび5nMの - 0.313 nMの濃度系列が使用されます。
   9. 試薬の位置に応じて2枚の96ウェルプレートにサンプルおよび試薬を準備ステップ3.2.2で定義され、その後、「ファイル名を指定して実行」タブをクリックし、プロトコル/実験を選択し、「開始」をクリックします。
3. Proteonのマネージャを使用したデータ分析
   1. 「パネルタイプ」をクリックし、「分析物」を選択します。そして、「プロトコルのステップ」をクリックして、リスト内のすべての結合曲線を選択します。
   2. 「|チャンネルリファレンス| Interspotプロセス」「自動プロセス」をクリックして、[OK]をクリックします。そして、「|ダブルリファレンス|行| A6プロセス」をクリックしてください。
   3. 動態解析のための3つのすべての面で各mAbのための個別のデータセットを保存するために、「データセットを作成」をクリックします。
   4. 「分析データセット」をクリックして、各mAbのデータセットを強調表示し、「分析|キネティック」をクリックしてください。 「ラングミュア」モデルと「同時KA / KD」を選択し、「次へ」をクリックしてください。
   5. 会合及び解離フィット範囲の両方を強調表示し、「ローカル」R _最大を選択し、取得するためにフィットを実行するために、「次へ」をクリックフィット動力学的パラメーター。
   6. 上記の手順を繰り返すが、リガンド表面活性を計算するための実験的なR _max値を得るために、フィッティングのために、「グループ化」R _maxを選択します。

オクテットRED384 4.動的測定

1. 試薬と試料プレートの準備
   1. 1X KB 50mLのPBSで10倍ストック溶液を希釈し（PBS pHを[7.4]、0.02％Tween-20を、0.1％のアルブミン、および0.05％アジ化ナトリウムを含むキネティック緩衝液）を調製。
   2. ウェル当たり200μLで96ウェルプレートに1×KBを分配します。少なくとも10分間、これらの個々のウェルに水和物48抗ヒト捕捉（AHC）バイオセンサーチップ。
   3. 2倍連続希釈において1.56 nmの各mAbの1×KB中に20μg/ mLで、10 / mlの、および5μg/ mLのサンプル、ならびに100 nMの7つの滴定濃度でヒトPCSK9を準備します。
   4. 384ウェル傾斜底マイクロプレートへのmAbサンプルをロード（REFE試薬プレートとRRED）とウェル当たり90μLでサンプルプレートと呼ばれる別の384ウェルマイクロプレート（）へのヒトPCSK9溶液。
   5. 1X KBとサンプルプレート内のウェル中のグリシン（pHは1.5）溶液の負荷一連。
      注：これらの1x KBウェルはチップの前処理、ベースラインの安定化、および分析物の解離のために使用されています。グリシン溶液を再生するために使用されています。
2. 実験方法の設定
   1. データ収集ソフトウェアでは、「|新しい実験ウィザード|新しい動態実験|基本動態実験」をクリックします。
   2. 「プレートの定義」では、サンプルの種類と位置を定義するには、以下の手順に従ってください。
      1. 「16」チャンネルと「384ウェル」形式を選択します。
      2. 一度に16個のウェルを強調するために十分で左クリックしながらShiftキーを押しながらプレートディスプレイ内のサンプルと試薬の位置を定義します。
      3. 上の右クリックウェルは、mAbサンプルを含むとAHCセンサにmAbがロード（又は捕捉）されるステップを示すために「ロード」を選択します。右側のテーブルでのmAb名と濃度を入力します。
      4. 右ヒトPCSK9を含有するウェルをクリックして、mAbを捕捉センサが浸漬され、結合相互作用が測定されるステップを示すために、「サンプル」を選択します。右側の表に相当するモル濃度を入力します。
      5. 「緩衝液」または「中和」、および「再生」としてグリシンを含有するウェルとして1X KBを含むウェルを画定します。
   3. 「アッセイの定義」では、実験を定義するには、以下の手順に従います。
      1. クリック3」、「30」の時間でリストに「ベースライン」、「再生」、「平衡」、「ロード」、「協会」、および「解離」の手順を「追加」を選択0" 、 "18" 秒、 "200" 秒、 "500" 秒、及び "1800" の、それぞれ振れ速度が "1000" RPM。
      2. 「アッセイ手順リスト」にステップを追加するには、ステップの最初のクリック、その後、サンプルや試薬プレートのいずれかに位置井戸をクリックしてください。手順は次のとおりです。
         1. 平衡回生：グリシンに「15」-sディップ液（pH 1.5）、1×KB中の「15」-sディップと交互に3サイクルによってプレコンディションAHCセンサ。
         2. ロード：「200」秒間AHCセンサへのmAbサンプルをキャプチャします。
         3. ベースライン：関連のステップの前に「60」sのBLI信号を確立します。
         4. 関連：「500」-s関連期間のヒトPCSK9の様々な濃度を含有するウェルにセンサを浸し。
         5. 解離：「1800」-s解離期間の1×KBの新しいウェルにPCSK9結合センサーを浸し。
         6. 再生：モノクローナル抗体-PCSK9坊を浸しndは各結合サイクルの間に2つの「18」-sパルスグリシン（pHは1.5）のウェルにセンサ。
   4. 「レビュー実験」では、手順をスライドさせて、前のタブに戻って行くことによって、必要に応じて変更を行います。
   5. 「ファイル名を指定して実行実験」では、「60」秒の遅延時間を入力し、待っている間にサンプルプレートを振ります。 Cキーを押し°プレート温度を「25」に設定し、「GO」を
3. ForteBioのデータ解析ソフトウェアを使用したデータの分析
   1. クリックして「データ選択|ロードされたデータ|動態| PCSK9抗体は、PCSK9 7.23.14への結合します」
   2. 「処理」では、プロセスデータは、次のように：
      1. ステップ1では：H1-H6でセンサーを強調するために、「センサ選択」をクリックし、右それらをクリックし、クリックして「変更センサータイプ|リファレンスセンサを。」
      2. ステップ2では、「減算」をチェックして選択し、「平均基準センサー」; 6つのブランクの緩衝センサの平均値からの各アクティブサンプルセンサを減算します。
      3. ステップ3で、「整列Y軸」をクリックして、関連する前のベースラインステップに全て結合曲線を整列させるために「ベースライン」を選択します。
      4. ステップ5において、信号対雑音比を増加させることによって結合曲線を滑らかにし、クリックし、「のSavitsky-Golayのフィルタリングを」チェック「プロセスデータを！」。
      5. ステップ6では、処理された結合曲線を表示するには、「処理結果」をクリックしてください。
      6. ステップ7では、各処理工程の後に結合曲線を表示し、右側に4枚のパネルを確認し、「保存データの加工」をクリックします。
   3. 「分析」では、「会合および解離」をチェックして選択し、「1：1」モデルを。
   4. 「グローバル（フル）」「色」によってフィット感とグループにそれらをのための結合曲線を強調表示します。同じMで被覆されたセンサーに嵌合群を実行するように「連結さR _maxを 」使用ABの濃度は、多数のmAb濃度でコーティングされたセンサーにグローバルフィッティングを実行するために実験的リガンド表面活性を計算するためのR _max値 、及び「R _maxのセンサによってリンク解除」を得ることができます。
   5. 装着動態パラメータを取得するために、「フィットカーブ」をクリックしてください。各フィッティング解析の終了時に結果を保存します。

IBIS MX96 5.動的測定

1. インストゥルメントおよび試薬の調製
   1. 室温で15分間COOH-Gチップを平衡化。
   2. システムのランニングバッファ（PBS [pH7.4の]、0.01％のTween-20）および固定化緩衝液（10mM酢酸ナトリウム[pH5.0の]、0.01％のTween-20）の1-Lボトルを準備します。
   3. 緩衝液および酢酸ナトリウム（pH5.0）固定化バッファーを実行しているシステムの両方において2倍連続希釈することにより0.16μgの/ mLに20μgの/ mLの各mAbを調製します。
   4. 2 9月にのmAbサンプルを分配各mAbを、ウェル当たり200μLで滴定濃度で縦8つのウェルを占有するarate 96ウェルプレート。
   5. 室温で400mMのEDC及び100mMのスルホ-NHSのアリコートを解凍。
   6. 酢酸ナトリウム（pH5.0）固定化緩衝液中の50μg/ mLでプロテインA / Gの300μLを調製し、バイアルに、それをピペット。
   7. バッファを実行しているシステムの2倍連続希釈することにより0.39 nmの100nm以上のヒトPCSK9の200μLを準備します。別々のバイアルにそれらをピペット。
2. アミン結合抗体アレイを有するマルチサイクル動態
   1. EDC /スルホ-NHS（400ミリモル/ 100 mM）のアリコートを混合し、ウェル当たり200μLで新しい96ウェルプレートの上部48ウェルに混合物を分配します。
   2. 位置2におけるmAbソースプレート（酢酸ナトリウムで希釈した[pHは5.0]）とプリンタ内部の位置1におけるEDC /スルホ-NHS試薬プレートを置きます。
   3. CFMにセンサチップをインストールします。 "CFM 2.0" softwarを開きますE、その後、「読み込み設定| 96アミンカップル」をクリックします。次のように10×8抗体アレイが作成されます。
      1. 「5」48分間マイクロチャネルを使用してセンサーに試薬プレートの上半分にEDC /スルホ-NHSを提供し、センサ表面上サイクルそれらを。
      2. 「10」分間活性化された表面を横切るセンサとサイクルそれらをソースプレートの上半分におけるmAbサンプルを届けます。
      3. 「5」分間抗体表面上に50 mLコニカルチューブから固定化バッファを提供します。
      4. ソースプレートの下半分で、残りのmAbサンプルについて上記の手順を繰り返します。
   4. 機器に印刷されたセンサチップをドッキング。そして「2014年8月15日」を選択し「既存の測定|接続| |オープン計測ファイルを」制御ソフトウェアでは、クリックしてください。
   5. 「フルシステムスクリプト」の下に - 「全般」で、「システムプライムG」を選択します。そして、「Gを選択 - Quencを150μLの1Mエタノールアミンを注入したmAb表面を不活性化するための時間」。
   6. モノクローナル抗体アレイを視覚化し、必要に応じてコントラストを調整する「カメラ」をクリックしてください。 mAbのスポットを囲むように赤い正方形のボックスを配置し、参照用の活性mAbのスポットの間に位置interspotsにある緑色の四角形ボックスを移動させます。
   7. 「IBISスクリプト」の下に - 「分析サイクル」では、「AP標準ランA」を選択します。ベースラインの1.0分間、関連10.0分、及び8μL/ sの速度で解離するための90個のステップを設定します。
   8. 「サイクル」の中で、5回のバッファ注射後の時間のヒトPCSK9 1つの濃度を注入。各結合サイクルの間にグリシンpHを2.0とのmAb表面を再生。
3. Fcを捕捉抗体アレイを有する単一サイクル動態
   1. CFMに新たなセンサチップをインストールします。反復は、プロテインA / GでのmAbサンプルを置換することによって、上記5.2.5と5.2.3ステップ。
   2. 取り除きますMX96からセンサチップとCFMのプリンタにそれをバックに挿入します。
   3. 10分間の双方向フローを使用して48マイクロチャネルを用いてプロテインA / Gセンサ表面に板の上半分にモノクローナル抗体を提供し、表面を横切るサイクルそれらを。
   4. プレートの下半分で、残りのmAbサンプルについて上記の手順を繰り返し。
   5. MX96装置に印刷センサーチップをドッキング。データ集録ソフトウェアで、クリックして「ファイルを|接続|オープン計測|既存の測定|次」と「プロテインA + G結合kinetic7.30.14」を選択します。
   6. モノクローナル抗体アレイを視覚化し、必要に応じてコントラストを調整する「カメラ」をクリックしてください。 mAbのスポットを囲むように赤い正方形のボックスを配置し、参照用の活性mAbのスポットの間に位置interspotsにある緑色の四角形ボックスを移動させます。
   7. 「IBISスクリプト」の下に - 「分析サイクル」では、「AP標準ランA」を選択します。 「ベースラインのための「1.0分」に設定します10.0「会合のため、および 『分8μL/秒の『速度10』で解離する工程』。
   8. 「サイクル」の中で、5回のバッファ注射後の時間のヒトPCSK9 1つの濃度を注入。何の再生は、各分析物注入の間に実行されません。
4. Sprintとスクラバーを使用したデータの分析
   1. 、|「オープントライアングルファイルファイルを」リスト内のすべてのサンプル注入を選択し、そして分析「をクリックする前に」「保存SprintXファイルを、」「キャリブレーション」、および「RLLの決意を確認し、」SprintXのsofwareで、クリックしてください。
      注：RLL値は、センサー表面上に固定化された/捕捉されたmAbレベルを指します。
   2. 「参照」をチェックし、隣接参照スポットを使用するために、「ローカル」を選択します。また、最初の注射の「合わせ」をチェックし、クリックして「スタートオートメーションを。」
   3. シリアル]タブでは、それらを調整する「ツールバーの表示ルーラー」を選択最初の試料注入の直前に、ベースラインの小領域を選択し、そして選択する「ゼロ」を
   4. 「ファイルをIBMXへエクスポート」を選択することで、スクラバーでの分析のための.IBMXファイルを生成し、クリックして「スタートオートメーションを。」
   5. スクラバーを起動し、.IBMXファイルをロードします。 「希釈率」として、「株価の濃」と「2」と「100N」を入力します。
   6. 作物データは、注入の開始に先立って、すべてのベースラインを削除し、関連の開始時の結合曲線を整列させます。
      注：シングル・サイクルの動力学実験のために、曲線を合わせていません。
   7. 、「動態」タブに移動し、射出終了時間のための定規を調整し、「K _dを 」とフィットを選択し、「K _dを固定します。」 「K _dを K」と再びそれをフィット]を選択します。
   8. K _dの列をフロートし、さらにフィット感を調整するために再びフィット。
      注：シングル・サイクル結合曲線のフィッティングのために、「OPTS」をクリックして選択を解除し、「引いて、」その後、「別」を選択し、バック理論的なベースラインの原点に関連プロファイルに合わせて、「インジェクションを開始」欄をフロート。
   9. [結果]タブでフィット動態パラメータを確認します。

Results

図1は、2つの固定化方法によってCFMとスポットのmAbレベルから抗体配列画像を示し、 図2は、マルチサイクル運動からMX96で生成対応する結合センサーグラム及びこれらのmAbアレイ上の単一サイクル動態測定を示します。 6 - 4つのバイオセンサプラットフォームで生成された複数の抗体でコーティングされた表面からのリアルタイム結合および動力学的近似曲線は、 図3に示されています。 図7は、これらの結合曲線のグローバル分析から得られた最終的な反応速度および平衡結合定数の比較を示します。個々のアソシエーション（k）は 、解離（K _d）は 、平衡（K _D）の結合定数を表1に示します。同じ楽器内で生成されたデータセットの変動性を実証するために、 k個の_{A、K d}およびK _Dのプロットを示し、 図9は、さらに、バイオセンサプラットフォーム間のmAb表面の計算結合活性を比較します。

IBIS MX96でCFM印刷から図1アミン結合（A）の多重リガンド配列およびFc捕捉（B）抗体表面。印刷されたアレイの画像は赤四角で囲まれた灰色領域は抗体の存在を示し、左のパネルに示されています。活性抗体スポットの間に位置する暗いinterspots基準減算のために使用されます。各列は、以下で特定滴定濃度で、画像の左側に印刷された抗体を含有します。ジを計算することによって定量印刷抗体の量アクティブと参照位置との間のバルクシフトのfferenceは右パネルに示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

IBIS MX96におけるマルチサイクル（A）とシングルサイクル（B）速度論的実験からのリアルタイム結合センサーグラムを図2の比較。 10×8抗体アレイを横切って濃度を増加でヒトPCSK9の連続注射は、それぞれ対応するセンサーグラムセグメント上述されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

上部パネル）、中（ 中央パネル）、及び低（ 下のパネル）密度面にわたって評価されます。 1相互作用モデル：重ね滑らかな黒い線は、1とは異なるヒトPCSK9濃度（色付きの線）での結合応答信号の動的フィットを表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ProteonのXPR36 1つの動力学モデルに合わせるオーバーレイ：図4のヒトPCSK9と1との対話キャプチャ抗体のセンサーグラムの結合。相互作用は、高（ 上部パネル）、MEDIにわたって評価されていますum-（ 中央パネル）、及び低（ 下のパネル）密度面。 1相互作用モデル：重ね滑らかな黒い線は、1とは異なるヒトPCSK9濃度（色付きの線）での結合応答信号の動的フィットを表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

オクテットRED384 1つの動力学モデルに合わせるオーバーレイ：図5.ヒトPCSK9と1との対話キャプチャ抗体のセンサーグラムの結合。相互作用は、高（ 上部パネル）、中（ 中央パネル）、及び低（ 下のパネル）密度面にわたって評価されます。重ね赤い線は1に異なるヒトPCSK9濃度（色付きの線）での結合応答信号の動的フィットを表します。 1つの相互作用モデル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

IBIS MX96 1つの動力学モデルに合わせるオーバーレイ：図6.ヒトPCSK9と1との対話アミン結合（A）およびFc捕捉（B）抗体のセンサーグラムの結合。結合プロファイルは図1のアレイプレートマップに従って10×8パネルとして編成されます。黒線は、異なるヒトPCSK9濃度で記録された結合応答信号を表し、重ね赤線が近似曲線を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

グレ7" SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg" />
アソシエーション・K（A）の図7の比較、解離_の K _d（B）、および4つのバイオセンサープラットフォームによって生成平衡K _D（C）結合定数。 6 -速度論的パラメータは、 図3における結合曲線のグローバル分析に由来します。バイアコアT100（青）のProteon XPR36（緑）、オクテットRED384（赤）、IBIS MX96、アミン結合（紫）、およびIBIS MX96は、Fc捕捉（オレンジ）を次のように器具が示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

BIACの複数の抗体表面密度以上の反応速度定数の一貫性の図8の比較鉱石T100（A）のProteon XPR36（B）、オクテットRED384（C）、IBIS MX96、アミン結合（D）、及び捕捉のFc IBIS MX96、（E）。速度論的パラメータ（ トップサブパネル）をK、 _の K _d（ 中間サブパネル）、及びK _D（ 底サブパネル）は個々の抗体の面密度で基分析に由来します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図 四バイオセンサープラットフォームにおける抗体表面とその標準偏差（エラーバー）の 9 結合活性。値は、研究論文¹⁷で説明した式を用いて計算されます。large.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

	kは	K D	K D
	（M -1 S -1）	（S -1）	（NM）
モノクローナル抗体1	11.7（7.8）10 5 xは	4.89（4.18）10 -5 xは	0.052（0.05）
モノクローナル抗体2	1.53（0.28）10×5	1.30（1.54）10 -5 xは	0.092（0.12）
モノクローナル抗体3	11.4（8.3）10 5 xは	27.6（11.0）10 -5 xは	0.333（0.20）
モノクローナル抗体4	3.61（1.6）10 5 xは	20.1（12.3）10 -5 xは	0.659（0.54）
モノクローナル抗体5	0.59（0.21）10×5	3.46（2.50）10 -5 xは	0.663（0.46）
モノクローナル抗体6	1.19（0.78）10×5	7.21（3.83）10 -5 xは	0.894（0.64）
モノクローナル抗体7	1.29（0.53）10×5	16.4（5.63）10 -5 xは	1.57（1.02）
モノクローナル抗体8	4.02（2.23）10×5	22.8（10.7）10 -5 xは	0.768（0.68）
モノクローナル抗体9	4.20（2.13）10×5	6.67（4.3）10 -5 xは	0.197（0.16）
モノクローナル抗体10	1.20（0.49）×10 5	12.5（7.64）10 -5 xは	1.27（0.80）

表1：1 相互作用モデル：反応速度と平衡は1〜フォーバイオセンサーインスツルメンツから結合曲線のグローバルフィッティングにより得られた10のmAbの結合定数。

Discussion

私たちの頭に頭の比較研究では、各バイオセンサープラットフォームは、独自の長所と短所を持っていることを示しています。抗体の結合プロフィールは、視覚的な比較（ 図3から6）により類似しているにもかかわらず、取得した速度論的速度定数の順位（ 図7）機器を横切って非常に一貫している、我々の結果はとそのSPRベースの器具を示します連続流動流体工学）遅い解離速度を有する高親和性相互作用を解決するに優れています。解離相中上方ドリフトがデータセットで観察される（ 例えば 、モノクローナル抗体2、モノクローナル抗体5、およびmAb 9; 図5）BLIの流体フリー機器によって生成されました。この知見は、システムの主要な制限であるマイクロプレートに時間をかけて蒸発をサンプリングするために大部分起因すると考えることができます。この固有の制限で、実験時間はまた、12未満の時間に制限されます。実験は、そのためのshでプログラムされました他のプラットフォーム（10分間会合および45分間解離）のものと比較しorter時間（500秒会合および30分間解離）。 BLIベースの機器によって生成された速度定数は、オフレートのいくつかの変動の結果（ 図8Cのように少ない直線性を示ししかし、実験時間を短縮することは、データ品質/一貫性に蒸発の影響を緩和するようには見えませんでした）。サンプルの蒸発に加えて、使用される捕捉試薬の違いはまた、得られた結果の違いに寄与したかもしれません。プロテインA / Gは、全ての3つの流体ベースのSPRプラットフォームで使用されたが、AHCセンサは、非流体のBLIのプラットフォームで使用しました。プロテインA / GはAHC、抗体に基づくバイオセンサー表面、プロテインA / G表面からのmAb、抗原複合体のオフ速度が人工のものよりも速く表示されることよりも、モノクローナル抗体のために弱い親和性を有する可能性があるのでAHC表面から得られました。この可能性は、BがサポートされていますY BLIプラットフォームによって生成されたオフ速度値は、他の機器（ 図7、 赤線 ）から得られたものよりも一貫して低かったことを示す実験データ。それにも関わらず、BLIプラットフォームは、他のプラットフォームの上に別の利点があります。例えば、それが原因すぐに使用するための種々のプレコートセンサにセンサ選択およびアッセイ形態に関して非常に柔軟です。我々の実験では、AHCセンサの使用は、準備時間を短縮、リガンド固定化工程の必要性を排除しました。さらに、BLIプラットフォームは、複雑なチューブと値スイッチ構成を備え、他の流体工学SPRプラットフォームに比べてはるかに少ないメンテナンスを必要とします。この機能は、目詰まりや汚染の問題を引き起こす可能性があり、粗サンプルを伴う実験のために有利です。

治療の候補者が増加し、効率的、迅速、かつ正確な識別のための需要が、双方向の必要性として、osensorスループットも高まっています。 4つのバイオセンサプラットフォームのうち、96リガンドアレイ印刷が可能なバイオセンサーからのスループット、最終的に増加縦横に36リガンドフォーマットと16チャンネル同時読み出しとBLIベースのバイオセンサーに結合されたバイオセンサー、続いて、最高であります相互作用の数は、それぞれ96、36および16に単一の結合サイクルで測定します。これらスループット能力は、単一のシリアルフローによって接続のみ4つのフローセルを有することによって制限されている伝統的なSPRプラットフォームのそれよりも有意に高いです。我々の実験は、長い解離時間を持つ複数の面密度で評価した10のmAbの比較的小さなサンプルセットを関与するので、楽器のスループットは、実験の効率を決定する際に、適度な役割を果たしました。そこ3つの高スループットプラットフォームの実験回数に有意差はなかった、とすべてのケースでの実験は、一日で完成しました。一方、従来のシリアルフローSPR実験は、セットアップ後のデータ収集のウォークアウェイ自動化にもかかわらず、完了するまでに3日を要しました。オフ率ランキング/動態スクリーニングまたはエピトープビニングの目的のために、（数百または数千でIE）多数のサンプルを必要とする他の研究では、スループットが重要な要因となります。

IBIS MX96でのスループットは他のバイオセンサーに比べて桁違いに高くなっているため、これらの目的のために最適な選択ですが、それはいくつかの欠点があります。具体的には、CFMによってアレイ印刷は、大きな表面の不整合（ 図1）と低減されたデータの再現性（ 図8D及び8E）を示します。正確な速度論的測定のために、バイオセンサー表面上のリガンドの量は、結合応答が等の二次的要因によって妨害されないように制御される必要がある重要なパラメータであります物質移動や立体障害。ビアコアT100とのProteon XPR36ため、最適なRの_Lレベルは、研究第¹⁷条に記載されるように設定されたR _max値の標準的な計算に基づいて決定しました。一方、オクテットRED384とIBIS MX96プラットフォームのため、モノクローナル抗体の捕捉レベルは一定の時間で2倍連続希釈した抗体の系列を用いて実験的に達成されました。捕捉工程の知識又は制御の欠如は、動力学的速度定数の精度を妥協している場合があり、高密度表面と高い結合応答信号（ 図2）が得られました。再生のに関与する複数の結合サイクル測定を行う場合、さらに、SPR検出器からプリンタの分離はまた、課題を提示します。固定化されたプロテインA / GでのmAbのFcを通じてキャプチャとは対照的に、マルチサイクル速度設定を実行する唯一の方法は、mAbの直接アミン結合を介しました他の三つのバイオセンサープラットフォームで表面。結果として、追加の再生スカウト実験は、最適な再生条件を決定するために必要でした。この設定の結果は、より長い実験時間に加えたFc捕捉方法（ 図9）と比較して〜90％低い観察表面活性に連結しました。 Fc捕捉方法を実行するために、別の単一サイクル運動アプローチを採用しました。このアプローチは、各注射（ 図2）との間で再生することなく、漸増濃度での分析物の連続注入を含みます。この利便性の高い、あまり一般的に適用されるアプローチでは、実験時間を短縮し、試薬の消費量を低減するだけでなく、他のバイオセンサー（ 図7）からのものと非常に類似した動力学的速度定数を生じました。したがって、このシングルサイクルの動力学アプローチを適用することは、器具の固有の構成の制限を克服し、提示しますハイスループットな方法で高解像度の反応速度定数を得るための機会。

スループットはビアコアT100の主要な制約にもかかわらず、我々の結果をまとめ、それが最高の品質で最も一貫性のあるデータを生成することを示しています。これは〜10倍高いスループットを持っているのProteon XPR36、続きました。器具検出限界に達したときに技術的に困難であることができる高親和性の抗体 - 抗原相互作用を特徴づける場合、高品質のデータを生成する能力が利点となります。オクテットRED384の計測における体系的な制限は、解離速度定数の正確な測定を妨げている間（ すなわち 、オフ速度が遅いために十分な信号減衰を解決するための感度の短い落下）、ビアコアT100とのProteon XPR36の両方を高感度かつ信頼性の高い提供することができます分化の検出。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biacore T100 System	GE Healthcare	28975001	T100 システムが T200
CM5 Sensor Chipにアップグレードされました	GEヘルスケア	BR100012
BIA評価	GEヘルスケア		バージョン4.1
Biacore T100制御ソフトウェア	GEヘルスケア		T100制御ソフトウェアはT200
アミンカップリングキット	GEヘルスケア	BR100050	含まれるもの:750 mg 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)、115 mg N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、10.5 mL 1.0 Mエタノールアミン-HCl pH 8.5
HBS-EP+ バッファー 10回;	GEヘルスケア	BR100669	濃縮ストックソリューション
プラスチックバイアル、外径7 mm	GE Healthcare	BR100212
ラバーキャップ、タイプ3	GE Healthcare	BR100502
プラスチックバイアルおよびキャップ、外径11 mm	GE Healthcare	BR100214
ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System	Bio-Rad	1760100
ProteOn Manager ソフトウェア	Bio-Rad	1760200	バージョン 3.1.0.6
GLM センサーチップ	Bio-Rad	1765012
アミンカップリングキット	Bio-Rad	1762410	EDAC (EDC)、スルホ NHS、エタノールアミン HCl
Regeneration and Conditioning Kit and Buffer	Bio-Rad	1762210	グリシンバッファー (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0) 各 1 個、NaOH、SDS、HCl、リン酸、NaCl; 各溶液 50 mL が含まれています。
2 L PBS/Tween/EDTA バッファー	バイオ・ラッド	1762730	ホスファート緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4、0.005% Tween 20、3 mM EDTA
オクテット RED384 システム	フォートé
データ解析ソフトウェア	Forté		バージョン9.0.0.4
ディップアンドリード抗hIgGfcキャプチャ(AHC)バイオセンサーFort	éBio	18-5060	96個のバイオセンサーの1つのトレイ
384ウェル傾斜底板	フォートéバイオ	18-5080
バイオセンサーディスペンサー	フォートéBio	18-5016
Kinetics Buffer 10x	Fortéバイオ	18-1092	10倍濃度。ProClin 300が含まれています。
IBIS MX96 SPRi System	Wasatch Microfluidics Microfluidics
Continuous Flow Microspotter (CFM) プリンター	Wasatch Microfluidics		Version 2.0
SensEye COOH-G チップ	Wasatch Microfluidics		1-09-04-004
データ分析ソフトウェア	Wasatch Microfluidics		Version 6.19.3.17
SPRint データ分析ソフトウェア	ワサッチマイクロフルイディクス		バージョン6.15.2.1
ラバー2	ロジックソフトウェア		バージョン2
ス組換えタンパク質A / G	ThermoFisher Scientific	21186