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方法論記事

糖尿病モデルラットにおける神経伝導の超音波ツール ブロックします。

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DOI:

10.3791/55675

⸱

2017年10月20日

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, 2Department of Neurology, National Cheng Kung University Hospital

この記事について

サマリー

この作業は、糖尿病性神経因性神経の活動電位をブロックする高強度集束超音波の適用の方法論を示します。

要約

高強度集束超音波 (HIFU) トランスデューサー神経伝導ブロックが正常及び糖尿病の動物モデルで実行されています。HIFU は超音波パラメーターの適切なを使用している間、神経を損傷することがなく可逆的に末梢神経の伝導をブロックできます。神経の活動電位の一時的、部分的なブロックは、HIFU が苦痛救助のための有用な臨床治療になる可能性を示しています。この作品は、糖尿病ラットの生体内でHIFU トランスデューサーを使用した神経因性神経の活動電位を抑制するための手順を示します。最初のステップは、ストレプトゾトシン (STZ) 注射による男性糖尿病神経因性ラットを生成することです。2 番目のステップは電子の von Frey プローブとホット プレートで STZ 誘発糖尿病ラットにおける糖尿病性ニューロパチーを評価する.最後のステップは、HIFU 超音波にさらされた神経の細胞外活動電位記録生体内ですることです。ここで示した方法は超音波鎮痛アプリケーションの研究に恩恵を受けます。

概要

鍼治療の経口薬1、および神経電気刺激2は、痛みを伴う糖尿病性多発ニューロパチーの治療のために使用されています。ただし、経口薬、鍼灸、電気神経刺激による手術の副作用は、治療効果と患者の遵守を妨げます。何十年も3,4、5の動物モデルにおける末梢神経の超音波ブロックについて調べた。大規模な緑のカエルの坐骨神経の in vitroの伝導は 0.4 - 超音波照射の 10-20 パルス治療後可逆的に抑制された 1.0 秒6。神経の伝導をブロックする 1 つの要因7超音波による温度上昇であります。性多発ニューロパチー患者、2 分8の低強度超音波にさらされる腓骨神経の複合筋活動電位 (概念地図) の抑制を行った。完全復旧時間は 5 分以内だった。

最近では、アメリカ合衆国の食品医薬品局は、子宮筋腫の腫瘍9、骨転移10、および前立腺癌11の痛み palliations の非侵襲的治療として HIFU を承認しました。HIFU トランスデューサーは、体の外の音響ビームを発するとフォーカスのターゲット腫瘍に収束ビーム様々 な組織媒体で送信。焦点のゾーンは、周囲の組織を傷つけることがなく腫瘍を標的にローカライズされたエフェクトを生成するすぐに形成されます。HIFU は、神経伝導を抑制または通常 Sprague-dawley (SD) ラット12の生体内の実験で神経叢を原因にも適用されています。さらに、神経因性の神経に HIFU の短期的および長期的な効果は、調査13をされています。前述の結果は、適切なパラメーターと HIFU による感覚神経伝導のリバーシブル的、または恒久的なブロックを達成できることを示した。鎮痛剤のアプリケーションに加えて HIFU される可能性がありますツールとして末梢および中枢神経の基礎的研究と鎮痛薬の開発のための神経伝導遮断コンポーネントの相対的な貢献を調査します。したがって、動物モデルにおける末梢神経の特定、HIFU ブロッキング技術プラットフォームが必要です。この資料の目的は、部分的または完全に HIFU による糖尿病神経因性ラット末梢神経の活動電位をブロックするための手順をデモンストレーションすることです。糖尿病ラットのモデルと末梢神経障害症状の評価を設立HIFU プラットフォームとラット坐骨神経の治療のために特定の実験的プロセスが掲載されています。

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プロトコル

機関動物ケアおよび使用委員会台湾国家衛生研究院の承認すべての動物のプロトコル

。

1 です男性大人スプレイグ - SD ラットの糖尿病モデルの誘導

  1. 高速雄 SD ラット (300-350 g) STZ 誘発前に 6 時間にラットの餌ペレットをケージから取り外します。
    2. 。
  2. 準備ナトリウム クエン酸バッファー (0.1 M、pH 4.5)。
    1. 溶解 1.05 g クエン酸一水和物 (C 6 H 8 O 7 · H 2 O; 分子重量 210.14) 0.1 M クエン酸溶液に蒸留水 50 mL にします
      2. 。
    2. 溶解 1.47 g クエン酸ナトリウム二水和物 (C 8 H 5 O 7 Na 3 · 2 H 2 O; 分子重量 294.12) 50 mL の蒸留水に 0.1 M クエン酸ナトリウム溶液を作成します
      3. 。
    3. 追加 25 mL クエン酸溶液 25 mL のクエン酸ナトリウム溶液に。ナトリウム クエン酸バッファー pH (ペーハー 4.5) を監視 pH メーターを使用しています
      。 注: バッファーは製張 0.1 M クエン酸ナトリウム溶液の適切な量を追加します
      4. 。
  3. 50 mg/mL STZ ソリューションを生成するために 0.1 M クエン酸ナトリウム緩衝溶解 STZ
    。 注: STZ のソリューションは、光に敏感、したがって、アルミ箔で STZ ソリューションを蓋をして 15-20 分以内使用
  4. は、クリーン エタノール パッドで注射部位 26-28 ゲージ針で 1 mL インスリンやツベルクリン注射器に 50 mg/kg の STZ ソリューションを描画し、損傷を防ぐために腹部の右下の象限に STZ 溶液を注入して腹腔内腹部の臓器。
  5. 低血糖を防ぐために STZ 投与後 48 h の唯一の水源として 10% ショ糖水ラットを提供します
。

2。 STZ 誘発ラットの糖尿病の確認

  1. モニターすべての空腹時血漿グルコース濃度ラット STZ によって挿入された血糖値計で 72 h の記事。
    1. 高速空腹時を計測する前に 15 h の STZ 誘発糖尿病ラットは血糖
      2. 。
    2. 拘束袋のネズミを抑制し、血液グルコース測定中に採血のツインテールを公開します
      3. 。
    3. は、血液ランセットを使用して小さい血のしたたりを取得するのに尻尾の先端を刺します。グルコース テスト ストリップの血の滴を配置します。空腹時血漿グルコース レベルを記録します
      。 注: 血糖値計を検出し、mg の/dL の単位で血糖値が表示されます。STZ 誘導の 2 週間後の空腹時血糖値 150 Mg/dl 以下とラットを除外します
      4. 。

3。糖尿病ラットにおける糖尿病性ニューロパチーの評価

  1. 電子・ フォン ・ フレイと機械的アロディニア査定。
    1. 長続き STZ 誘発糖尿病ラット後肢を評価する前に 30 分間 1 cm 径金網床のケージに足撤退応答します
      2. 。
    2. 剛体のヒント (直径 0.8 mm) と電子 von Frey プローブを使用して、手動で、ラットの後肢の足底の表面に圧力を適用して、前足撤退応答が見られるまで徐々 に圧力を増加します
      3. 。
    3. ラット各測定間 30 秒間隔で 5 回計測を繰り返し、システムに表示圧力を記録します
      4. 。
  2. ホット プレートで熱痛覚過敏を評価します。
    1. 痛みの反応を評価する前に 10 分間ホット プレート (24 ± 0.5 ° C) に STZ 誘発糖尿病ラットを慣らす
      2. 。
    2. 削除し馴化後ケージに戻ってラットを置いて、ホット プレートを加熱、ホット プレートを維持 ' s の温度を 55 ± 0.5 ° C で
    3. 加熱ホット プレート上同時にタイマーをスタートしながらラットを配置します
      4. 。
    4. ラットは個別の動作を展示、後肢の足舐めなどまたは異常に素早く動かす後肢足、タイマーを停止、回収の遅延時間を記録します
      。 注: ラット 20 後個別の動作を表現していない場合 s (20 s カットオフ時間)、ホット プレート テストを終了し、ホット プレートからラットを削除します
      5. 。

4。生体内で神経の伝導妨害 HIFU トランスデューサー

注: 生体内で 実験開始 5 週目 50 mg/kg 投与後

。
  1. HIFU 超音波処理と概念地図のブロックの前に動物の手続きを実行します。
    1. 手術器具 (メス、はさみ、ピンセット、ガラス フック) 手術前にオートクレーブで滅菌します
      2. 。
    2. の麻酔ラット チレタミン/チレタミン混合物 (40 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg の腹腔内注入または吸入 を介して イソフルラン気化器を介してイソフルランの 1.75%。体温を維持するために加熱パッドのラットを配置します
      3. 。
    3. は、腹側の臥床で手術のラットを配置します。眼軟膏を適用します。ラットの足を拡張し、麻酔深度を確認するために爪のフィートの足底の表面をピンチします。ラットは、撤退の反応を示す、追加の麻酔を適用します
      4. 。
    4. を上下電気クリッパーをラット背部、太ももから毛を取除きます。手術部位を清潔なガーゼで液体ヨウ素を適用し、円ガーゼを手術部位の外側に移動します。同じ円運動で液体ヨウ素を拭くためには、アルコール パッドを使用します。この実験は、左と右の手術のサイトで実行されます。他の手術のサイトで手順を繰り返すときの手順の次の手順を実行します
      5. 。
    5. は、背側の太ももの皮膚の切開をするのに滅菌手術用ハサミやメスを使用します。鈍外科はさみを使用して、慎重に皮膚の下に組織を分離し、皮膚のフック大腿骨は筋肉内で見ることができると皮膚を保護します。
      6. 。
    6. は、筋肉に埋め込まれている半ば太もも坐骨神経線維が表示されるまで慎重に大腿骨に平行の筋肉を分離するのにはさみを使用します。慎重に半ば太もも坐骨神経周囲の結合組織や筋肉を分離するガラスのフックを使用します
      7. 。
  2. ( 図 1 および 図 3) カスタムメイド神経創固定器を用いた HIFU 焦点ゾーンで坐骨神経を配置します
    。 注: 創カスタムメイド神経固定器は、3 つのコンポーネント ( 図 3) で構成されています。すべてのコンポーネントは、透明なポリメタクリル酸メチル (PMMA) から成っています。外部スレッド コンポーネントの上部構造は 2.5 mm 背が高いと M10XP0.7 ( 図 4 a)。中央の井戸は、4.0 mm 径が穴コンポーネントを使用は。井戸の底の開口部は、テープのシートに密封されます。スロットの直径は 1.2 mm とスロットの中央平面とコンポーネントの上面との距離私は 3.1 mm。 コンポーネント II 本体、4 本の脚と下部構造 ( 図 4 b) から成っています。下部構造の内部スレッドは 2.5 mm 背が高い、コンポーネントの外部スレッドに合わせて M10XP0.7 私。中央の穴の直径はコンポーネントの中心の井戸と同じ私。本体の寸法は、直径 32 mm 厚さ 5.4 mm です。4 本の脚が対称的に配置されます。2 つの同一の短い足は、配置用に設計された、2 つの同一の長い脚動作コンポーネント III にフックします。外径と III のコンポーネントの高さは、41 ミリメートルと 9.2 mm。M36XP1.0 であり、貫通孔は直径 27.5 mm 内部スレッド (< 強いクラス =「xfig」> 図 4)。コーンは、直径 84 mm の上部開口直径 27.5 mm の下部開口部と中空テーパです。高さは 57.5 mm ( 図 5 a) です。
    1. 、実験前に創カスタムメイド アクリル神経固定器を滅菌水に浸漬後 30-60 分の漂白液漬します。
      2. 。
    2. ガラス フックを使用して神経を慎重に持ち上げ、コンポーネント I. のスロットにそれを置く
    3. コンポーネント I. 塗り、中央にネジ コンポーネント II は替え玉と私をコンポーネントのよく ' 超音波伝搬と神経保存のためのソリューションです
      4. 。
    4. スクリューのコンポーネント III HIFU 住宅コーン。ドック コンポーネント III コンポーネント II の 4 本の脚を使用してコンポーネント II と
      。 注: 3 つのコンポーネントの幾何学的中心と探触子を配置します。神経は、探触子の間隔が均等により神経が HIFU の焦点ゾーン内の焦点距離にします
      5. 。
  3. 坐骨神経・腓腹筋に他のペアの起源に鍼治療の針の 1 つのペアを挿入します。電気の同軸ケーブル ( 図 1) を電気生理学取得システムに針の各ペアを接続します
    。 メモ: ケーブルの一方の端には、個別に、ケーブルのもう一方の端に 2 本の針をクリップする二つのワニ口クリップ システムをリンクする BNC コネクタです。鍼治療の針のペアは、坐骨神経に刺激電極と記録電極腓腹筋でとして働きます。
    1. サンプリング レートおよび電気生理学の集録システムの帯域幅に 50 kHz と 70 Hz から 3 kHz、それぞれ設定します。坐骨神経の起源に刺激電極に 0.1 ms のパルス幅を持つ超最大刺激を適用します
      2. 。
    2. 記録電極から概念地図を記録し、電気生理学集録システムでアンプ内蔵で、概念地図の増幅します
      。 メモ: は、神経信号を増幅し、電気生理学データ取得方式記録電極から概念地図を記録する電気生理学集録システムで内蔵アンプを使用します
      3. 。
  4. 糖尿病神経因性ラットにおける概念地図を抑制する商業 2.68 MHz HIFU トランスデューサーを使用します
    。 メモ: 探触子の仕様は、次のように表現されます: 6 cm と 5 cm の焦点距離の口径を持つ単一要素球状ボウルと 4 mm 深さ、無料のフィールドの幅 0.8 mm の楕円の焦点ゾーン。
    1. 浸球状円錐、HIFU トランスデューサーおよび円錐形はタンクのカバーは、脱水で満たされました。HIFU トランスデューサーを球状のコーンに入れて、6 頭ネジ ( 図 5 b) によって球状円錐の上部開口する円錐カバーを修正します。球状円錐の泡は泡水と比較しての低密度のために当然のことながら追放され後、透明 0.03 mm 厚テープで円錐形のフロント エンド開口部はシールします。球状のコーンの上にネジ コンポーネント III.
      2. ガスを抜かれた水タンクから球形のコーンとコンポーネント III HIFU トランスデューサーを取り出す
    2. .
      注: 研究で使用される逆浸透膜水は逆浸透のプロセスによって精製水です。ガスを排出する逆浸透水を沸騰します。個々 の密閉タンクで冷却した後、ガスを抜かれた水が得られる
      3. 。
  5. コンポーネントを配置、神経と筋肉の間のスペースに私、慎重にコンポーネント I. 実行手順 4.2.3 と神経が、HIFU の焦点のゾーン内に存在することを確認する 4.2.4 のギャップで神経の位置、( 図 3 a ) です
    6. 。
  6. は、関数発生器と高周波電力増幅器をリンクします。HIFU ビームの生成のための HIFU トランスデューサーに電力増幅器を接続します。手動で設定関数発生器の電圧出力、HIFU トランスデューサー を介して 電力増幅器。HIFU 照射時間が、手動で関数発生器の電源を切ります。タイマーを使用して時間を監視します
    。 注: 強度と本研究で用いた HIFU ビームのエネルギーは、2,810 W/cm 2 84 J/mm 2、それぞれと
    7. 。
  7. は、同時に、概念地図を記録しながら坐骨神経に、電気生理学・ アクイジション ・ システム (ステップ 4.3) を介して刺激と HIFU システム (ステップ 4.6) を介して HIFU ビームを提供します。徐々 に 3 から坐骨神経に HIFU 露出 s、5 秒 ~ 8 s 概念地図の振幅の抑制または減少が観察されるまで。
    1. レコード、HIFU の配信中に 1 秒あたり一度概念地図のビーム。概念地図の振幅の変化を観察し、HIFU システムをオフにして、手動でレコード概念地図初期 10 分、連続 30 分の 5 分ごとに 2 分毎に電気生理学取得ソフトウェアのレコードのアイコンをクリックして、すべて 10 分、最後の段階まで、録音時間は 2 h.
  8. 別のコンポーネント切開部位から HIFU トランスデューサーを削除するには、II と III 神経創固定器 ( 図 3)。独立したコンポーネント II と私はセキュリティで保護された坐骨神経を解放します。4-0 クロム腸線縫合糸によって、概念地図を記録した後糖尿病ラットの手術部位を縫合します。手術部位感染を防ぐために液体ヨウ素を適用されます。
    1. 加熱パッドにケージを置くし、動物施設に返す前に檻の中で回復するラットを許可します。飲料水のイブプロフェンと 3 日間またはブプレノルフィン (0.05 - 0.1 mg/kg) の腹腔内投与のラットを提供します
      2. 。
  9. で初期 HIFU 超音波処理後の手順に従って 4.1.2 項及び 7、14、28 日 4.3 坐骨神経と麻酔糖尿病神経因性ラットの腓腹筋の起源の刺激および記録の電極を挿入します。4.3.1 に 4.3.2 の手順を繰り返します。
    1. 加熱パッドにケージを置き、動物施設へケージを移動する前に檻の中で回復するラットを許可します
      2. 。
  10. 実験後ラットを安楽死させます。炭酸ガス室にネズミを配置します。呼吸停止するラットの約 5 分を待ちます。心臓の鼓動が停止していることを確認します
    11. 。

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結果

生体内で調査は示した、2,810 W/cm2の強度で 3 s の超音波照射の HIFU 線量、基準の 20% によって鎮圧されて、概念地図が、彼ら (図 2 a、ダイヤモンド) 30 分後に完全に回復した、ほぼ28 日 (図 2 b, ダイヤモンド) の期間の定数です。同じ強度で 5 s の HIFU の露出のため、概念地図は 4 分でベースラインの 65.4% (9.5%)、減少し、120 分 (図 2 a、正方形) によるベースラインの 73.7% (12.6%) に回復しました。概念地図は、(図 2 b、正方形) を 14 日目までのベースライン レベルに返されませんでした。8 に HIFU 超音波処理時間が増加したときの同じ強度の下で、概念地図が 4 分で (

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ディスカッション

糖尿病ラット生体内神経因性神経の action potentials とブロック効果の両方が認めた HIFU 治療後の発生インスタントの部分的、一時的な抑制。概念地図の 28 日のフォロー アップ調査を示した適切な HIFU 露出で神経伝導の安全な封鎖が実施されます。その結果、HIFU 治療上のプロトコルは、糖尿病ラットの坐骨神経の可逆的な伝導ブロックの代替ソリューションを提供できます。

この方法では神経変性がないと感覚神経は軽度の神経傷害14で数日間に時間の期間にわたって完全に回復できます。重度の負傷について感覚回復の時間コースをとります数ヶ月それがすべてで発生した場合。さらに、末梢神経線維を再生成より完全に endoneurial チューブとシュワン細胞の基底膜がそのまま次の粉砕傷害15。したがって、我々 は、HIFU を引き起こしたケースがマイルドで、可逆的神経損傷 HIFU 治療後抑制された概念地図は時間の経過とともにベースラインに返されるために推論します。重度...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

研究は、科学省技術 (プロジェクト最も 105-2221-E-400-001) と国立健康研究所 (プロジェクト BN-105-PP-10)、台湾によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ストレプトゾトシンSigma85882
クエン酸一水和物 SigmaC1909
クエン酸三ナトリウム二水和物SigmaW302600
血糖値計Roche Accu-Check ActiveGC
電子フォンフレイ装置IITC ライフサイエンス2390
ホットプレートIITC ライフサイエンス
Biopac MP36 取得システムBiopac Systems, Inc.
HIFUトランスデューサーSonicH108
関数発生器Agilent33250A
パワーアンプエレクトロニクス&イノベーション1040L
ラット BiolascoSprague-DawleyPuralube
獣医軟膏Dechra
イソフルラン気化器パークランドサイエンティフィック
イソフルランスアタン
拘束バッグ(デカピコーン)ブレインツリーサイエンティフィックDC 200
コンセプト台湾V3000PS

参考文献

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