クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

サマリー

DNA-タンパク質相互作用は、複数の生物学的プロセスにとって必須である。細胞機能の評価の間、DNA-タンパク質相互作用の分析は、遺伝子調節を理解するために不可欠である。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、 インビボでそのような相互作用を分析するための強力なツールである。

要約

DNA複製および修復、DNA組換えおよび遺伝子発現を含む複数の細胞プロセスは、タンパク質とDNAとの相互作用を必要とする。したがって、DNA-タンパク質相互作用は、細胞分化、細胞増殖、細胞周期制御、染色体安定性、エピジェネティックな遺伝子調節、および細胞形質転換などの複数の生理学的、病態生理学的および生物学的機能を調節する。真核細胞では、DNAはヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質と相互作用し、クロマチンに凝縮する。電気泳動（ゲル）移動度シフトアッセイ（EMSA）およびDNase Iフットプリントなど、いくつかの技術的ツールを用いてDNA-タンパク質相互作用を分析することができる。しかし、これらの技術は、細胞内ではなく、インビトロでタンパク質-DNA相互作用を分析する。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、特定のDNA結合部位でタンパク質を捕捉し、それによってDNA-タンパク質相互作用の同定を可能にする技術であるそれらのクロマチンの文脈内にある。これは、DNA-タンパク質相互作用の固定化、続いて目的のタンパク質の免疫沈降によって行われる。続いて、タンパク質が結合したゲノム部位が特徴付けられる。ここで、我々はChIPを記載し、議論し、チロシンキナーゼのプロモーター領域内のSMAD結合要素（SBE）への転写因子SMAD2の形質転換成長因子-β（TGF-β）誘導結合の同定のための分析値を示す。プロテインキナーゼキット（c-KIT）受容体リガンド幹細胞因子（SCF）。

概要

真核生物の核において、DNAはヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質と相互作用し、クロマチンに凝縮する。生理学的、病態生理学的および細胞生物学的状況において、細胞機能は、クロマチン配位遺伝子発現によって空間的および一時的に制御される。 DNA-タンパク質相互作用は、DNA複製、組換え、および修復、ならびにタンパク質発現などの細胞プロセスの調節において必須の役割を果たす。したがって、DNA-タンパク質相互作用の分析は、遺伝子発現および細胞機能の評価において不可欠なツールである。

電気泳動（ゲル）移動度シフトアッセイ（EMSA）およびDNase Iフットプリンティング^1,2など、インビトロでのDNA-タンパク質相互作用を評価するいくつかの技術が存在する。しかしながら、これらの技術は、クロマチンおよび細胞の状況におけるタンパク質-DNA相互作用を分析しない。チップI特定のDNA結合部位に結合したタンパク質を捕捉し、それによってクロマチンの状況におけるDNA-タンパク質相互作用の同定を容易にする技術である。この技術は、もともとGimourとLisによって、 Escherichia coliおよびDrosophila melanogaster ^3,4 における特定の遺伝子へのRNAポリメラーゼII結合の評価のために開発されました。これは、DNA-タンパク質複合体の固定化、その後のクロマチン抽出および約200塩基対（bp）断片へのDNAの切断によって行われる。続いて、目的のDNA結合タンパク質を免疫沈降によって単離する。 DNA-タンパク質架橋の逆転後、DNAを精製し、分析する。タンパク質結合部位の分析にはいくつかの方法を用いることができ、標的遺伝子⁵内のタンパク質結合部位の核酸配列に依存する⁵ 。 DNA配列が既知である場合、標準的なPol既知の結合部位に隣接する特定のプライマー対を用いて、イメラーゼ連鎖反応（PCR）を適用することができる。定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）も使用できます⁶ 。配列が未知である場合、ChIPはDNAマイクロアレイ（ChIP-on-chip）、DNA配列決定（ChIP-seq）、またはクローニング技術7,8,9と組み合わせることができる。

TGF-β経路は強力な腫瘍抑制機能を有し、細胞分化の鍵となる経路である。それはTGF-β1リガンドの同族受容体複合体への結合によって活性化され、SMAD2 / 3転写因子のセリンリン酸化をもたらす。共通のメディエーターであるSMAD4との会合後、SMAD複合体は核に移行し、標的遺伝子のプロモーター領域内のSBEに結合し、細胞周期、アポトーシスおよび細胞の区別を制御する遺伝子を制御するに。 TGF-β刺激に対する転写応答は、細胞型および状況特異的である¹⁰ 。最近、我々は、TGF-βとc-KIT経路¹¹との間の正のフィードバックループを記載した。このモデルでは、TGF-β1活性化SMAD2はc-KITリガンドプロモーターに結合し、その発現および分泌を誘導する。続いて、c-KITリガンドは、c-KIT受容体を自己および準クリニック様式で活性化する。 c-KIT受容体活性化は、JAK1 / 2を介したSTAT3 Tyr705リン酸化をもたらす。 STAT3活性化および核移行後、STAT3はTGF-β1リガンド遺伝子に結合し、その発現を調節する。

ここでは、我々は、c-KIT受容体リガンドプロモーターへのSMAD2結合の同定、およびシグナルトランスデューサー（および）転写3（TGF-β1-遺伝子）。

プロトコル

1.ソリューションの準備

1. 実験ごとに以下の解決策を用意してください。
   1. 固定溶液は37％ホルムアルデヒドを調製し、室温で保存します。 1.42％の最終濃度になるように1倍リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈する。
      注意：ホルムアルデヒドは刺激性、腐食性、突然変異誘発性、催奇性、発癌性に分類されます。摂取しないでください。ガス/フューム/蒸気/スプレーを吸入してはならない。換気が不十分な場合は、適切な呼吸器を着用する。皮膚や眼との接触を避ける。酸化剤、還元剤、酸、アルカリ、水分などの不適合物を避けてください。
   2. グリシン停止 - 固定溶液については、1×PBS溶液中に0.125Mグリシンを調製し、室温で保存する。
   3. 細胞掻爬溶液のために、dH ₂ O中の1 _× PBS溶液を調製し、氷上に保存する。使用直前に、プロテイナーゼ阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）t0.5mMの最終濃度。
      注意：PMSFは腐食性および有毒性に分類されています。保護服を着用し、換気の良い場所で使用すること。
   4. 細胞溶解バッファー（20 mM Tris-HCl; pH 8.0,85 mM KClおよび0.5％NP40）を使用する直前に、1Xプロテアーゼインヒビターカクテル（PIC;ジメチルスルホキシド（DMSO）中100Xストック溶液：104 mM 4- （AEBSF）、80μMアプロチニン、4mMベスタチン、1.4mM E-64,2mMロイペプチン、および1.5mMペプスタチンA）および0.5mM PMSFを添加した。
   5. 核溶解緩衝液（50mM Tris-Cl; pH8.0,10mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、および1％SDS）を使用する直前に、1X PICおよび0.5mM PMSFを加える。

2.細胞固定およびせん断

1. 10cmの組織培養プレート上で細胞を70〜80％のコンフルエンスまで増殖させる。実験目的ごとに細胞を刺激する。
2. 組織培養培地を除去し、固定液5mLを添加し、インキュベートする細胞を振盪プラットフォーム上で室温で10分間インキュベートした。
3. 固定溶液を除去し、10mLの氷冷1×PBSで細胞を2回洗浄する。
4. 1x PBSを除去し、5mLのグリシン停止固定溶液を添加し、振盪プラットフォーム上でRTで5分間細胞をインキュベートする。
5. グリシン停止固定溶液を除去し、10mLの氷冷1×PBSで細胞を2回洗浄する。
6. 1×PBSを除去し、2mLの細胞掻き取り溶液を加え、細胞スクレーパーを用いて細胞を回収する。採取した細胞を氷上のコニカルチューブに移す。
7. 600 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離する。
8. 上清を除去し、ペレットを1×細胞溶解緩衝液1mLに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。あるいは、液体窒素中でペレットをスナップフリーズし、-80℃で保存します。
9. ペレットを細胞溶解バッファーに再懸濁したら、細胞懸濁液を氷冷ダウンスホモジナイザーに移し、タイプBのペストル細胞破壊のためのe。
10. 細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移し、2,400 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離します。
11. 上清を捨て、ペレットを350μLの核消化バッファーに再懸濁し、37℃で5分間サンプルをインキュベートする。
12. マイクロコッカルヌクレアーゼ（1U /μL）を添加し、ボルテックスで混合する。サンプルを37℃で5〜20分間インキュベートする。 2分ごとにサンプルを反転させる。
    注：時間と酵素濃度は細胞株間で異なり、最適以下の酵素的剪断の場合に最適化が必要な場合があります。
13. あるいは、市販の超音波処理器を用いた超音波処理によるクロマチン剪断を達成する。
    注：超音波条件は最適化が必要です。 300μLのサンプル容量と25％のサンプル処理能力を用いて最適化の例のプロトコルを以下に示す。
    1. ステップ2.10の後、上清を捨て、nを再懸濁する1.0mLの商業的剪断緩衝液中に溶解した。
    2. 300μLの再懸濁した核ペレットを3つの1.7mLマイクロ遠心チューブに分注する。それらを氷上に置きます。
    3. 最適な超音波処理条件を決定するために、3つの異なる条件を使用して25％出力で固定クロマチンの3つのアリコートをせん断する：
       それぞれ20秒の5パルス、各パルスの間に氷上に30秒の休止時間があります。
       それぞれ20秒の10パルス、各パルスの間に氷上に30秒の休止時間があります。
       それぞれ20秒の20回のパルス、各パルスの間の氷上での30秒の休息。
    4. 以下に説明するように、ステップ2.15に進みます。
14. マイクロコッカルヌクレアーゼでインキュベートした後、反応を停止させるために7μLの氷冷0.5M EDTAを加える。
15. 剪断したDNAで16,200 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離する。
16. 剪断したDNA含有上清を新鮮な微量遠心管に移す。 50μLを別のマイクロ遠心チューブに分注してsuを確認する。DNAの厳しい剪断（セクション3）。免疫沈降（セクション4）のために残りの容量をすぐに使用するか、-80°Cで保存してください。

3.せん断効率の確認

1. ステップ2.16のせん断された染色質の50μLアリコートに150μLのヌクレアーゼフリーdH ₂ Oおよび10μLの5M NaClを加える。
2. サンプルを65℃で4時間インキュベートし、クロスリンクを逆にする。
3. 2μLのRNase A（10μg/μL）を添加し、サンプルを37℃で15分間インキュベートする。
4. プロテイナーゼK（0.5μg/μL）10μLを添加し、サンプルを42℃で90分間インキュベートする。
5. DNAの精製のために、フェノール/クロロホルム抽出を行う¹² 。
   1. ヌクレアーゼフリーの水を200μLの最終容量に加えます。 200μLのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）を試料に添加し、20秒間ボルテックスする。
   2. 室温で遠心する16000×gで5分間の穿孔。慎重に上部の水相を取り出し、新しいチューブに移す。ピペッティング中にフェノールを持ち込まないように注意してください。
   3. 0.1M容の3M酢酸ナトリウム（NH ₄ OAc）（pH4.2）を加え、チューブを指で数回フリックすることによって混合する。 2.5容量の氷冷した100％エタノールを加え、ボルテックスで5秒間混合する。サンプルO / Nを-20℃でインキュベートするか、-80℃で少なくとも1時間インキュベートする。
   4. 4℃、16,000 xgで30分間サンプルを遠心分離し、cDNAをペレットにします。
   5. ペレットを破壊することなく上清を注意深く除去する。 1mLのRT、70％エタノールを添加し、チューブを数回反転させる。
   6. 4℃、16,000×gで2分間サンプルを遠心分離する。慎重に上清を除去する。
   7. ペレットを室温で5〜10分間乾燥する。ペレットを30μLのdH ₂ Oに再懸濁する。
6. 1％TAEを用いたゲル電気泳動のために、精製されたDNAの5および10μLアリコートを使用するアガロースゲル。
   注：成功したクロマチン剪断は、200-1,500 bpのDNAパターンをもたらす。せん断がうまくいかない場合、せん断工程（ステップ2.12）のインキュベーション時間を5分、10分および15分に変更することによって、特定の細胞の最適なせん断条件を決定する。
7. 残りのサンプルを使用して、サンプルのDNA濃度を分析します。剪断したクロマチンサンプル中のDNA濃度を逆算する（ステップ2.16）。免疫沈降のための各処置群について同じDNA量を用いる（セクション4）。

免疫沈降

1. 25μLのChIPグレードプロテインG磁気ビーズ、10μLの免疫沈降希釈緩衝液（ストック溶液：0.01％SDS、1.1％Triton X-100,16.7mM）と10-25μgの剪断架橋クロマチン（ステップ2.16）トリス-HCl; pH8.0,1.2mM EDTA、および167mM NaCl）、および1μLのPICを含む。
2. 4時間のインキュベーションの後、1〜10μgの抗体（抗体濃縮物抗体の親和性に基づいて変化する;製造業者の推奨に従って最初に使用し、必要に応じて実験的に最適化する）を1.5mLマイクロ遠心チューブに加え、dH ₂ Oを最終容量100μLに加える。
   注：上記の直接免疫沈降法の代わりに、間接免疫沈降法を、最初にクロマチンを抗体と組み合わせ、続いてプロテインG磁気ビーズを添加することにより使用することができる。
3. サンプルを4〜12時間4℃でエンドツーエンド回転子にインキュベートする。

溶出

1. 磁気スタンドにチューブを置きます。磁性ビーズがチューブの側面に集まったら、慎重に上清を除去して捨てる。
2. 洗浄緩衝液1（0.1％SDS、1％Triton X-100,2mM EDTA pH8,20mM Tris-HCl; pH8,150mM NaCl）800μLでビーズを3回洗浄する。チューブを数回反転させて混ぜる。チューブを磁気スタンドに磁気ビーズがチューブの側面で凝集すると、注意深く洗浄バッファーを取り出して廃棄します。
3. 800μLの洗浄緩衝液2（0.1％SDS、1％Triton X-100,2mM EDTA; pH8,20mM Tris-HCl pH8および500mM NaCl）でビーズを1回洗浄する。チューブを数回反転させて混ぜる。チューブを磁気スタンドの上に置き、磁気ビーズがチューブの側面に集まったら、注意深く洗浄バッファーを取り出して廃棄します。
4. ビーズを50μLの溶出バッファー（1％SDSおよび100mM NaHCO ₃ ）に再懸濁し、サンプルをRTで15分間エンドツーエンド回転子にインキュベートする。
5. チューブを磁気スタンドに置き、磁気ビーズがチューブの側面に集まると、上清を新しいチューブに移す。
6. 6μLの5M NaClを添加して架橋を逆転させ、2μLのプロテイナーゼK（0.5μg/μL）を加える。サンプルを混合した後、サンプルを65℃で2時間インキュベートする。
7. DNAの精製のために、phenol /クロロホルム抽出¹² （ステップ3.5）、続いてペレットを30μLのdH ₂ Oに再懸濁する。
   注：サンプルはタンパク質結合部位（セクション5）について直接解析することも、-20℃で保存することもできます。

6.結合部位分析

1. PCRまたはqRT-PCRを使用して、既知の核酸配列内の特異的結合部位の分析を行います。プライマー設計については、従来のPCRまたはqRT-PCRプロトコールに従う。目的のタンパク質結合部位を架橋する150〜400 bpのアンプリコンを合成するためのプライマーを設計します （ 図1 ）。
2. 目的の抗体で免疫沈降したChIP由来のDNA、非特異的なIgG抗体で免疫沈降させたChIP由来のDNA、iii）入力DNA、およびiv）H ₂ Oとしての特異性を保証するために、4つの異なるDNA鋳型を用いてPCRをセットアップする。汚染を排除するためのPCRの陰性対照。経路刺激の場合免疫沈降したタンパク質の既知の結合部位に特異的な異なるプライマーセットを用いて第5の鋳型を選択する。
   注：c-KITリガンドプロモーター分析の場合、従来のPCRを使用して、c-KITリガンドプロモーター領域内のSBEでのTGF-β誘導SMAD結合を実証する。陽性対照として、TGF-β誘導性SMAD結合の既知の標的としてプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1（PAI-1）でPCRを行う。

結果

TGF-β1リガンドのその同族受容体複合体への結合は、SMAD2 / 3転写因子のセリンリン酸化をもたらし、次いで共通メディエーター、SMAD4とのそれらの会合をもたらす。 SMAD複合体は核に移行する。 TGF-βは、標的遺伝子の調節領域内のSBEへのSMAD結合を介して、または関心対象の遺伝子の発現を引き続き制御する転写活性化因子またはリプレッサーのSMAD調節発現を介して間接的に、遺伝子転写を調節することができる。 c-KITリガンドSCFがSMAD2のそのプロモーターへの直接的なTGF-β1誘発結合によって転写的に調節されるかどうかを試験するために、本発明者らは、SCF遺伝子のSCFプロモーターを含む2.4kb、5'-フランキング領域をSMAD2結合モチーフ、5'-AGAC-3 '（SBE） ^13,14 。我々は、7つの推定SBEsアップSCF開始コドンのトリム（ 図1A ）。 SCFプロモーターへのSMAD2のTGF-β1誘発結合を確認するために、本明細...

ディスカッション

この報告では、我々は、c-KITリガンドプロモーター内のSBEへのSMAD2のTGF-β1誘導性結合およびTGF-β1リガンド遺伝子内のその認識配列へのSTAT3のTGF-β1誘導結合を実証する。本発明者らは、クロマチン免疫沈降を用いて、両方の転写因子のサイトカイン誘導性結合を実証する。

クロマチン免疫沈降は、目的のタンパク質がDNAに直接結合することを実証し、タンパク質のDNA結合を誘導する刺激を特徴づけ、タンパク質が結合するDNA配列を特徴付ける強力なツールである。後者の情報は、目的の特定のタンパク質によって調節される遺伝子の同定を助けることができ、ChIP-on-chip、ChIP-seq、またはクローニング戦略7,8,9の使用によって達成される。 ChIPとDNA-タンパク質結合を実証する他の方法との大きな利点の1つ例えばEMSAまたはDNase Iのフットプリントは、ChIP技術において、結合がインビボで捕捉され 、他のものではインビトロで行われるということである 。したがって、ChIPは、細胞の状況...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HepG2細胞	ATCC	HB-8065
Hep3B細胞	ATCC	HB-8064
TGF-&β;1	R&D Systems	101-B1	10 ng/mL の濃度で使用
抗 SMAD2 抗体	Cell Signalling Technology	5339	使用量/IP: 3 & micro;g
抗STAT3抗体	Cell Signalling Technology	4904	使用量/IP: 3 & micro;g
ChIP-IT Protein G Magnetic Beads	Active Motif	53033
Protease Inhibitor Cocktail	Active Motif	37490
Micrococcal Nuclease	Cell Signalling Technology	10011
PCR Forward Primer: PAI-1			Sequence: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'
PCRリバースプライマー:PAI-1			配列:5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
PCRフォワードプライマー:SCF			Sequence: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'
PCRリバースプライマー:SCF			配列:5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
PCRフォワードプライマー:TGF-&β;1 (STB-1)			配列: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3'
PCRリバースプライマー:TGF-&β;1 (STB-1)			配列: 5'-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCCCC-3'
PCRフォワードプライマー:TGF-&β;1 (STB-2)			配列: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'
PCRリバースプライマー:TGF-&β;1 (STB-2)			配列: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGGGTGTGTC-3'