ニューロン回路の再学習：速い神経突起伸長と機能的ニューロン結合の新しい方法

サマリー

この手順は、神経突起の伸長を誘導するマイクロピペットに固定されたポリ-D-リシン被覆ビーズを使用して、マイクロ流体チャンバーに組織化された神経突起を迅速に開始、伸長および連結する方法を記載する。

要約

脳および脊髄損傷は、長距離にわたってニューロンを再生し、それらを適切な標的に正確に再接続することが依然として不可能であるため、永久的な障害および死につながる可能性がある。ここでは、新しい機能的なニューロン回路を長距離にわたって迅速に開始、伸長、および正確に接続する手順が記載されている。達成された伸長速度は、末梢神経系からの最も速く成長する軸索のインビボ速度（0.02〜0.04mm / h）よりも30〜60倍速く1.2mm / hを超え、以前に報告されたものよりも10倍速い開発の初期段階でのニューロン型⁴ 。第1に、ラット海馬ニューロンの単離された集団を、微小流体装置において2〜3週間増殖させ、細胞を正確に配置し、容易なマイクロマニピュレーションおよび実験的再現性を可能にする。次に、ポリ-D-リシン（PDL）で被覆されたビーズを神経突起上に置き、接着性contビーズ - 神経突起複合体を移動させるためにピペットマイクロマニピュレーションを使用する。ビーズを動かすと、数百マイクロメートルを超えて機能し、標的細胞と機能的に1時間未満で結合することができる新しい神経突起が引き出される。このプロセスは、実験的な再現性および操作の容易さを可能にし、より遅い化学的戦略をバイパスして神経突起成長を誘導する。ここで提示された予備測定は、生理学的なものをはるかに超えるニューロンの成長速度を実証する。これらの技術革新を組み合わせることで、これまでにないほどの制御力で、文化におけるニューロンネットワークの正確な確立が可能になります。それはニューロンの成長の限界を探索する遊び場であるだけでなく、ニューロンネットワーク内の信号伝達および伝達についての過度の情報および洞察の扉を開く新規な方法である。潜在的な適用および実験は、ニューロンの再接続を目的とした治療法に直接的な影響が広がっている外傷後または神経変性疾患においてl回路を阻害する。

概要

成人の中枢神経系（CNS）への損傷は、軸索の再増殖を制限する複数の機構のために恒久的な障害を引き起こす可能性があります¹ 。傷害後、多くのCNS軸索は新たな成長円錐を形成せず、効果的な再生応答^{2を達成しない} 。さらに、CNS病変を取り囲む損傷および瘢痕組織^は、軸索成長を有意に阻害する^1,2,3 。損傷後のCNS再生を促進するための現在の治療法は、傷害ニューロンの内因性増殖能の増強およびミエリン屑およびグリア瘢痕に関連する軸索伸長の阻害剤をマスキングすることに集中している1,3。それにもかかわらず、遠くの標的に長い軸索を再生し、適切な機能的シナプスを形成する能力は、依然として厳しく制限されている^{4 、}

現在の研究では、マイクロビーズ、ピペットマイクロマニピュレーション、およびマイクロ流体デバイスを使用して、長距離にわたって新しい機能的なニューロン回路を迅速に開始、伸長および正確に接続する。以前の研究は、ポリ-D-リシン被覆ビーズ（PDL-ビーズ）が膜接着を誘導し、続いてシナプス小胞複合体のクラスター化および機能的シナプス前隆起の形成を示した⁸ 。シナプス分化後にPDLビーズを機械的に引き離すと、シナプスタンパク質クラスターがビーズに追従し、新しい神経突起^9が始まることも示されています。以下の手順は、この事実を、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体装置を用いてカバースリップ上の組織化された領域にラットの胚海馬ニューロンを培養してニューロンを正確に再配線する能力回路。

これらのPDMSマイクロ流体デバイスは、毒性がなく、光学的に透明であり、マイクロチャネルのシステムによって接続された2つのチャンバからなる。一旦カバースリップ上に組み立てられると、各デバイスは、ニューロンの成長を誘導し、正確なパターンで健康なニューロン培養を維持し、インビトロで 4週間より長く維持するための型として役立つ。

ここでは、新しい神経突起の拡張および機能の限界を調べるための枠組みが提示されている。新しく機能的な神経突起が作製され、ニューロンネットワークを制御可能に（再）配線するように配置される。達成される伸長速度は、ミリメートルスケールの距離にわたって20μm/分より速く、機能的接続が確立される。これらの結果は予想外に、これらの神経突起の伸長に対する固有の能力が以前考えられていたよりもはるかに速いことを示している。この提案された機械的アプローチは、遅い化学戦略をバイパスし、特定の標的への制御された接続を可能にする。 Th技術は、傷害後のニューロンの接続性を回復するための新規療法のインビトロ研究のための新しい道を開く。それはまた、ニューロンネットワークの操作および再配線を可能にして、 インビトロでのニューロンのシグナルプロセッシングおよびニューロン機能の基本的な側面を調べる。

プロトコル

以下に詳述するすべての手順は、McGill Universityの動物管理委員会によって承認され、カナダ動物衛生審議会のガイドラインに準拠しています。

1.マイクロ流体デバイスを用いたニューロン培養の標準化：デバイスアセンブリ

1. 目的の実験に適したマイクロ流体デバイスを選択します。同じ集団内のニューロンに接続するには、Neuro Devices（ 図1 ）を使用し、異なる集団のニューロンを接続するには、Co-Culture Devices（ 図6 ）を使用します。
2. 所望の数の滅菌カバースリップまたはガラス底の皿を洗浄し、調製する。プラスチック表面の最良の結果を得るには、35 mmの皿、ガラス使用の25 mmのカバーガラス、または35 mmのガラス底面の皿を使用します。イメージングシステムに基づいて、例えば0.15mmのガラス厚さを選択する。
3. 100μg/ mL PDL 0.5〜1mLで2時間または一晩室温または室温で皿またはカバーガラスを被覆する。ature。
   注：ここでプロトコルを一時停止し、必要に応じて翌日に再開することができます。さらに、ディッシュはホウ酸塩緩衝液希釈PDL、ポリ-L-リジン（PLL）、ラミニンまたは他の細胞接着分子でコーティングすることができます。
4. 水晶を水で2回洗浄する（塩結晶がチャネルをブロックする可能性があるためリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を使用しない）、すべての液体を除去し、バイオセーフティーキャビネットなどの無菌環境で5〜10分間または表面は完全に乾燥している。
   注意：カバースリップが完全に乾燥していることを確認してください。残っている液体はマイクロ流体システムの接着を妨害します。
5. 滅菌環境（biosafety cabinet）でUV光の下でパターンを上にしてマイクロ流体デバイスを10分間置く。バイオセーフティキャビネット^10で作業する場合は、必ず滅菌手順に従ってください。
6. ピンセットを使用して、パターンが下を向いているマイクロ流体デバイスを、きれいなカバーと接触させて配置するip / dish。ピンセットを使用して、ガラスに接着するようにデバイスを柔らかく押してください。
   注：光を照らして見ると、付着した領域の透明度が表示されます。すべての角がガラスに接触していることを確認してください。すべてのマイクロ流体デバイスにこれを行います。 図1aを参照してください。
7. 単一の集団デバイスに培地を充填するために、ピペットをチャンネルに向け、無血清B-27（容量比1:50）および500μg/ mLのペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミンを補充した50μLの完全細胞培地を加える右上の井戸にNBMと呼ばれる）を入れ、次にそれに斜めに横たわる井戸にさらに50μLを加えます。すべてのデバイスでこれを行い、培地がウェル間を流れるようにします。次に、50μLの培地を残りの2ウェルに加える。 図2aを参照してください。
   1. 複数の集団デバイスを培地で満たすには、ピペットをチャンネルに向け、30μL右側の井戸への完全なNBMの詳細については、 図6aを参照してください。すべてのデバイスでこれを行い、培地がウェル間を流れるようにします。次に、残りの4つのウェルに50μLの培地を加える。
8. オートクレーブした水（湿ったチャンバー）を入れた開いた皿を用いてデバイスをより大きなプレートに置き、インキュベーター（37℃、5％CO ₂および95％湿度）中に1〜2時間置く。 図2bを参照してください。

2.マイクロ流体システムにおけるニューロンのメッキ

1. Ref。 ⁸ 、Sprague Dawleyラット胚（どちらの性別でも）から解離した海馬または皮質ニューロンを得る。
2. 1〜200万ニューロン/ mLの濃度でNBM中の胚性ニューロンを再懸濁する。血球計数器を使用して参照番号⁸に従って顕微鏡の細胞濃度を確認する。細胞濃度の調整gを所望の細胞密度にする。チャネルあたりの単一の海馬軸索を得る機会を増やすために、デバイスあたり10,000ニューロンをプレートする。同じチャンネルに複数の軸索を持つためには、1台の装置につき60,000ニューロンが必要です。
   注：これらの数字は、使用したニューロンのタイプによって異なります。
3. ウェルを空にすることなく、マイクロ流体デバイスから培地を除去する。それぞれ約5μLのままにしておきます。
4. 単一集団装置に細胞をプレートするために、50μLのNBMを右下のウェルに添加する。この時点で、媒体はそれ自体で流れて、他の下部ウェルに充填される。 図1bに示すように、濃縮液細胞溶液20μLをマイクロ流体デバイスの右上のウェルに添加する。
   1. 複数の集団装置に細胞をプレートするために、 図6aの右ウェルのそれぞれに20μLの濃縮細胞溶液を加える。
5. 細胞があれば顕微鏡でチェックするチャンバーの内部にあり、15分間〜30分間インキュベーター内にデバイスを置き、基板への細胞の付着を促進する。
6. チャンバーに十分な細胞があるかどうか顕微鏡でチェックします。さらに必要な場合は、手順2.4と2.5を繰り返します。
7. 単一の集団デバイスの2つのトップウェルに50μLのNBMを、同じウェルに20μLのNBMを添加し、細胞を複数の集団デバイスに注入した。培地はわずかに突出して、メニスカスを形成し、ウェルにマフィンのトップを与える。ここでも、 図2aを参照してください。
8. 37℃、5％CO ₂および95％湿度で細胞を維持する。

ニューロン培養物の維持

1. 細胞からNBM（ピペットで約30μL）を取り出し、デバイスに導入した翌日（ステップ2の1日後）に新しい予熱NBMを適用します。
2. 各チャンネルに十分な量の媒体があれば、2日ごとに確認してください。マフィンtopは低く、トップウェルに培地を追加するだけです。
3. マイクロ流体装置を除去する前に少なくとも7日間培養細胞に移す。細胞は、これらの装置で数週間生き残ることができる。サンプルを実験してから1~2日後にデバイスを取り外します。

4.マイクロ流体デバイスの除去

1. マイクロ流体装置を取り除く前に1〜2日間インキュベートし、各サンプル皿に37℃に予熱したNBM 2 mLを加え、チャンバーを溢れさせ、装置をインキュベーター内に維持する。
2. 無菌ピンセットとチップを使用して、カバースリップからマイクロフルイディクスデバイスを取り除き、ニューロンのパターン化された構成を残します。先端を使用してカバーガラスを所定の位置に保持し、ピンセットを使用してウェルの左下隅にあるデバイスの端をつかみます。微妙にねじりをかけ、デバイスをピンセットで持ち上げて、カバーガラスをはがすようにします。 図2c - 2dを参照してください。
3. 2〜3日おきに、試料が実験に使用されるまでのNBM。
4. サンプルの再配線実験を行う前に、単一母集団デバイスのチャネルの神経突起と複数の母集団デバイスの神経細胞集団が、顕微鏡でそれらの間のギャップを調べて、神経細胞集団をつなぐフィラメントが存在しないことを確認することによって分離されることを確認する。

5. PDL被覆ビーズの調製

1. 水（1：500）で希釈した4,10または20μmポリスチレンビーズの2×50μL滴をPDL（100μg/ mL）1mLに添加する。室温で少なくとも2時間放置する。
   注：ここでプロトコルを一時停止して翌日に再開することができます。
2. 溶液を8,820 xgで1分間遠心する。容器の底に溜まったビーズを邪魔することなく上清を注意深く除去する。
3. ビーズを1 mLの滅菌10 mM HEPES pH 8.4溶液で2回洗浄する。
4. PDLでコートしたビーズを200mLの10mM HEPES pH 8.4中に再懸濁する。溶液。

6.マイクロピペットの準備

1. 水平電極プラーを使用して、ガラス毛細管（内径1mm、外径1.5mm）からピペットを調製する。プルされたマイクロピペットの外側の先端が〜2-5μmになるように設定を調整します。引っ張る前に、ガラス管がきれいであることを確認してください。
2. ピペットをガラススライドに固定して保管し、チップが壊れやすいためにチップがスライドの表面に接触しないようにします。ほこりから保護するために、屋内の容器に入れて保管する。ピペットを引っ張った日にピペットを使用してください。

7.ニューロンへのPDLビーズ接着

1. ステップ4で調製した細胞培養液に、ステップ5で調製したPDLコートビーズ40〜60μLを加えます。ピペットチップをカバースリップ上にかすかに見えるニューロンの上に置き、ビーズを添加します（ 図3参照）。
2. インキュベーターに試料を1時間戻して、syの形成を促進するナプキンコンタクト^8,9 。
3. インキュベーション後、予め温めたNBMで培養物を穏やかに洗浄することにより、付着していないビーズを除去する。

8.生理食塩水の調製（室温実験用）

1. 参考文献7,8に記載されている成分を組み合わせて生理食塩水を調製する。これはインキュベーターの外の細胞環境を調節するためです。
2. 参考文献7,8に示されているように、浸透圧およびpHレベルを確認する。
3. 実験中にpH変動を最小限にするために溶液にO ₂を連続的に注入する。
4. 室温まで加熱する。
5. プラスチックチューブの一端（オプションの寸法）をO _2を注入した生理溶液に入れ、もう一方を固定して灌流システムをセットアップする。試料ホルダーに挿入された針に送ってください。チューブと溶液をサンプルより高くします （ 図4参照）。
   1. チューブをニードルから外し、シリンジに接続します。シリンジを使用して圧力をかけ、液体を吸引してチューブを満たします。ローラークランプでシールし、ニードルを再び接続します。

ビーズマイクロマニュピュレーション

1. 倒立光学顕微鏡の40倍位相対物レンズ（開口数0.6）を用いて、マイクロマニピュレーターに取り付けられた2つのマイクロピペットによって上方から細胞にアクセスし、光学的に下方にアクセスするような実験装置に試料を設置する。この構成では、顕微鏡の側面にイメージキャプチャ用のCCDカメラを取り付けます。プラスチック管を介して各ピペットを1 mLシリンジに接続します。この段階で、NBMを生理食塩水（1〜2 mL）に交換します（ 図4参照）。
2. 実験中ステップ8で調製した生理食塩水で細胞を0.5〜1mL /分の速度で連続的に灌流する。
3. 視野内のニューロンに結合されていないPDLビーズを選択します。ビーズの上にマイクロピペットを合わせてビーズをマイクロピペットの先端に合わせます。ビーズにできるだけ近づけて、顕微鏡で観察してください。
4. ビーズをピックアップするピペットに接続された1 mLシリンジで負圧を適用します。実験を通して負圧を維持する。

10.神経突起を引く

1. 視野内のニューロンに付着したPDLビーズを選択し、ステップ9.3-9.4に記載されているように吸引を用いて2番目のマイクロピペットに付着させる。
2. マイクロマニピュレーターまたはサンプルステージのいずれかを1μm移動させてゆっくり（約0.5μm/分）PDLビーズ - ニューロン複合体を引っ張り、神​​経突起の開始を可能にするために5分間停止する。
3. 手順10.2を2回繰り返します。
   注：最初の3＆実験的な成功を保証するためには、時間の95％以上が経過するまで、非常にゆっくりと引っ張らなければならない。
4. マイクロマニピュレーターまたはサンプルステージを2μm移動させてゆっくり（〜0.5μm/ min）PDLビーズニューロン複合体を引っ張り、神​​経突起伸長を可能にするために5分間停止する。
5. 最初の5μmの開始および神経突起の伸長が成功した後、ミリメートルスケールの距離にわたって20μm/分で神経突起を引っ張る。
   注：引っ張りは、連続的にまたは段階的に、および様々な速度で行うことができる。 図5b -5cを参照してください。

11.ニューロンの接続

1. 神経突起に富む領域を選択し、物理的に接触するようにPDL-ビーズ - 神経突起複合体を下げる。他のビーズを使用して、カバースリップ表面上の先端の高さを測定する。 図5dを参照してください。
2. PDL-ビーズ - 神経突起複合体を標的神経突起と接触させたままにし、第2のマイクロピペットペッテ新しく形成された神経突起の上に第2のPDLビーズを有する第2のピペットを下げて、約20μmのビーズを形成する。 2番目のPDLビーズを使用して、新しい神経突起フィラメントを標的細胞に向かって押します。
3. 両方のビーズを少なくとも1時間定位置に保持する。顕微鏡^16で 、ビーズに接触する神経突起の肥厚である、局所的な腫脹がないことを確認する。
4. この間、灌流を使用して、サンプルの培地を生理食塩水から予熱したCO ₂平衡NBMまでゆっくりと変化させる。
5. 吸引を解除して、第2のピペットからビーズを解放する。新しい神経突起が付着したままになっている場合は、最初のビーズもリリースします。 図5eを参照してください。
6. 静かに生理食塩水を取り除き、NBM（約2 mL）と交換する。
7. 将来の実験のためにニューロンの接続を強化するために、慎重にサンプルをインキュベーターに戻してください。この接続は24時間以上安定です。

12.全セルペアパッチクランプ記録による新しい接続の機能の確認

1. 文献7,18,19に従ってください。電気生理学のセットアップを組み立てる。
2. 参考文献^7に従ってください。シナプス前およびシナプス後の電極を準備する。
3. パッチクランプデータを収集する。これも参考文献18,19に従う。
4. その結果を自然発生信号⁷と比較して接続タイプを決定します。

結果

胚性ラット海馬ニューロンは、細胞、PDL-ビーズおよびマイクロマニピュレーターの正確な配置を可能にするために、マイクロ流体デバイス内で培養される。最初のステップは、ガラスのカバースリップまたはディッシュ上にマイクロ流体デバイスを適切に組み立てることである。チャンバーを出て、封止されるべきデバイスの部分の下を移動する細胞を避けるために、マイクロ流体デバイスを基板に良好に取り付けることが重要である（ 図1a ）。健康な培養を数週間維持するためには、2〜3日おきに細胞培地を確認し、培地の陽性メニスカスを維持して培地の蒸発を防ぐことが重要です（ 図2a ）。中程度の蒸発も避けます。より大きなプレート（ 図2b ）の中に水と細胞の両方を入れておきます。マイクロ流体装置は、いつでも取り外すことができる。最適な結果を得るには、NBMをcell-deに追加する必要がありますデバイスを取り外す前に少なくとも1日以...

ディスカッション

標準的なマイクロマニピュレーションおよび革新的なマイクロ流体デバイスを使用して、新しい機能的なニューロン回路を遠距離に迅速に開始、伸長および正確に接続するための新しい技術が開発された。ピペットマイクロマニュピュレーションは、ほとんどの神経科学ラボ4,13で一般的なツールです。再現性と信頼性の高い結果を達成するための真の課題は、マイクロメーターの精度で細胞培養を構成するマイクロ流体デバイスの開発を通じて、実験期間（数週間であり得る）の間、健康な、正確に配置された神経細胞培養の標準化であった。高品質の細胞培養はデータ検証の基礎です。これは、より簡単で迅速な顕微鏡画像および培養および結果の標準化に寄与する。マイクロ流体デバイスは、生体内と同様の構成でインビトロで細胞を培養するように設計された。単一の母集団装置により、長い神経突起の成長および軸索、神経突起および細胞体の容易な同定。マイクロ流体チャンバに播種された細胞の数は、ニューロン密度を決定する。したがって、デバイスあたりの細胞数をより少なくすることによって、チャネルに近い単一のニューロンを同定することは容易である。 1つのニューロンの軸索および複数の樹状...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
共培養デバイス	アナンダデバイス		http://www.anandadevices.com
ニューロデバイスで	アナンダデバイス		http://www.anandadevices.com
No. 1で市販 ガラスカバースリップ 25 mm 丸型	ワーナーインスツルメンツ	64-0705
35 mm ガラス底皿 #0、コーティングなし、ガンマ線照射	MatTex Incorporation	P35G-0-20-C
35 mm 細胞培養皿、非発熱性、	Sterile Corning Inc	430165
95 mm x 15 mm シャーレ、滑り式蓋、滅菌ポリスチレン	フィッシャーブランド	FB0875714G
50 mL 遠心分離チューブ、目盛りとフラットキャップが印刷されています	VWR	89039-656
15 mL ポリプロピレン円錐形チューブ、17 x 120 mm スタイル、非発熱性、滅菌	ファルコン
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103-049	細胞外液
B-27 サプリメント (50X), 無血清	B-27 サプリメント (50X), 無血清	17504044	細胞外溶液
ペニシリン、ストレプトミオシン、グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11995-065	細胞外液
200 μL ピペッターズ	VWR	89079-458
2 - 20 μL Pipettors	エアロゾル耐性チップ	2149P
BD Falcon 3mL トランスファーピペット [非滅菌]	BD Falcon	357524
Glucose	Gibco	15023-021	細胞外溶液
HEPES	Sigma	7365-45-9	細胞外溶液/ビーズ
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5	細胞外溶液
KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7	細胞外溶液
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	細胞外溶液
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3	細胞外溶液
#5 デュモン デュモスター ピンセット 11 cm	World Precision Instruments	500233
Dissection tools	ブラウン、Aesculap
Poly-D-lysine 臭化水素	Sigma-Aldrich	P6407
ポリスチレンをベースにしたマイクロ粒子、10 &μ;m	Sigma-Aldrich	72986
ホウケイ酸チューブ	King Precision Glass, Inc.	14696-2
ホリゾンタルピペットプーラー	サッター装置	ブラウンフレーミング P-97
マイクロマニピュレーター、PCS-5000 シリーズ	SD MC7600R
1 mL シリンジ	BD ルアーロック	309628
倒立顕微鏡	オリンパス	IX71
対物レンズオ	リンパス	UIS2、LUCPLFLN 40X
CCDカメラ	測光	カスケードII:512
Leibovitzの(1x)L-15中	期生活技術	11415-064	ラット解剖
Typsin-EDTA(0.05%)、フェノールレッド	ライフテクノロジー	ズ25300054	ラット解剖
DMEM (1x) ダルベッコ修正イーグル培地 [+4.5 g/L D-グルコース、+ L-グルタミン、+ 110 mg/L ピルビン酸ナトリウム]	Life Technologies	11995-065	ラット解剖
HBSS (1x) ハンクの平衡塩溶液 [- 塩化カルシウム、 - 塩化マグネシウム、 - 硫酸マグネシウム]	Life Technologies	14170-112	ラット解剖