このプロトコルは、マウス胚からのmetanephric基盤を単離および培養するための方法を記載する。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
このプロトコールの目的は、マウスのメタネフリカの基礎の解剖、単離および培養のための方法を記述することである。
哺乳動物の腎臓発達中、2つの前駆組織、尿管芽および間葉間葉は、最終的に腎臓の収集系およびネフロンを形成するために、細胞機構を伝達し相互に誘導する。哺乳動物の胚が子宮内で増殖し、したがって観察者が接近できないので、器官培養が開発されている。この方法により、腎臓器官形成の間に上皮間葉相互作用および細胞の挙動を研究することが可能である。さらに、先天性腎臓および泌尿生殖路奇形の起源を調べることができる。慎重な解剖の後、metanephricの手先は、培地上に浮遊するフィルター上に移され、数日間細胞培養インキュベーターに保持することができます。しかし、条件が人工的であり、組織内の代謝に影響を及ぼす可能性がある。また、外植片に存在する細胞外基質および基底膜のために、試験物質の浸透が制限される可能性がある。
器官培養の1つの主な利点は、実験者が器官に直接アクセスできることである。この技術は安価で簡単であり、生物学的に活性な物質の添加、遺伝子変異の研究、高度なイメージング技術の適用など、多数の改変が可能である。
概要
哺乳類の腎臓は、中胚葉起源の2つの原始構造、すなわち管状上皮尿管芽と後腎間葉に由来します。腎形成中、尿管芽は後腎間葉に侵入して枝分かれし、収集システムを形成します。後腎間葉は、ネフロンの上皮要素を生じさせます。これらのプロセスは、正確なタイミングで空間的に調整された方法で発生し、相互の誘導メカニズムによって開始されます。両方の組織成分が通信し、他方の細胞形態形成に影響を与えます。
1920年代に、ニワトリの中腎管の生体内閉塞を行ったのはボイデンであり、分離した腎芽球が分化に失敗するため、誘導性相互作用の最初の兆候を提供しました1。ほぼ同時期に、ニワトリのネフリック原始を吊り下げて培養する最初の成功した試みが発表されました。その後、哺乳類の器官形成における組織相互作用を研究するために、臓器培養が開発されました。1950年代、グロブスタインは、中腎の原始物をフィルターで培養できる技術を開発しました。この技術はSaxénによって修正され、彼は培養皿1のTrowell型スクリーンにフィルターを配置しました。長年にわたり、臓器培養のための多くの改良と応用が生まれてきました。ここで説明する方法は、Saxénの技術に基づいていますが、フィルターが培地上に自由に浮遊し、培養の直径がフィルターの直径をわずかに超えるだけで、フィルターの不要な動きが制限されるため、簡略化されています。....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
マウスは、スウェーデンの規制およびEU法（2010/63 / EU）に従って維持された。すべての手続きはスウェーデン倫理委員会のガイドライン（C79 / 9、C248 / 11、C135 / 14の許可）に従って実施された。ハイデルベルク大学での動物被験者の手順は、ハイデルベルク大学のRegierungspräsidiumKarlsruheとAnimal Welfare Officersによって承認されています。
1.培養用試薬および材料の調製
注：汚染を最小限に抑えるために、層流フードを使用してください。
- 解剖の日に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の1：5のモル比で抗ヒトFcヤギ抗体と混合することにより、ヒトFcに融合されたヒトFcのみまたはヒトFcに融合された組換えキメラエフリンタンパク質を前もってクラスター化する。 37℃で1時間インキュベートする。5 。
- ダルベッコ改変イーグル培地：栄養素を補充して培地を調製する1％ペニシリン/ストレプトマイシン（v / v）、1％グルタミン（v / v）、1％インシュリン - トランスフェリン - セレン（v / v）、50μg/ mlのヒトホロ - トランスフェリン、および1.5μg/ mLのアンホテリシンを含む。
注：16胚には培地10 mLで十分です。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
Metanephric kidney anlagenは、E11.5で妊娠したBlack-6近交系マウスに由来し、培養した。 3日後、尿管芽は5回まで分岐し、最初はT字型の尿管芽が分岐した。各外植片を撮影し、分節世代を決定し、分枝あたりのエンドポイントの数を計算するために、セグメントおよびエンドポイントの数を定量化した（ 図1 ）。 ImageJ（ rd世代;第4世代は、移植外植片のわずか8％で到達したが、対照外植片の35％（ 図1b ）と比較して、分岐あたりのエンドポイント数およびmm 2あたりのエンドポイント数は、さらに、外植片の3分の1が尿管芽の先端に異常な形態を有していた（ 図1 ）ことから、EphrinB2には拘束効果がある可能性が示唆されたEphA4およびEphB2の順方向シグナル伝達を活性化することにより、尿管芽分岐プロセスにおいて、
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
この写本は、発達中のメタネフリカのanlagenをマウスの胚から単離し、器官を培養する方法を記述しています。この方法は、Grobstein 8とSaxén9,10によって開発された標準的な手法であり、多くの他者11,12によって適応され、変更されています。この方法の成功は、主に、外植片の生存および誘導電位の低下が切開時間の延長に伴う切開の持続時間に依存する。腎臓基底組織を周囲の組織から浄化する場合、間葉系を損傷しないように注意しなければならない。間葉間葉の損傷は、しばしば外植片の乏しい成長の理由である。しかし、解剖速度および精巧な運動能力は、実践によって大きく改善する。
提示されたプロトコールにおける化学的に規定された培地は、一次細胞およびインビトロ器官培養物中の血清含有培地中で培養し、外植片の成長および生存を支持するためにインスリントランスフェリンセレンを補充したDMEMおよびHam's F-12の1：1（v / v）混合物を含有する。グルコースおよびアミノ酸.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は何も開示することはない。
謝辞
筆者はLeif OxburghとDerek Adamsの知識共有、Leif Oxburghの原稿への有用なコメント、StefanWölflとUlrikeMüllerのテクニカルサポート、Saskia Schmitteckert、Julia Gobbert、Sascha Weyer、Viola Mayerに感謝します。ラボこの研究は、Development、The Biology of Company （CPへ）によって支持された。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM/F-12 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 21331020 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 15140148 | |
| GlutaMAX サプリメント | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 35050061 | |
| DPBS、カルシウム、マグネシウム | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 14040117 | 解剖に使用 |
| Sigma-Aldrich | T0665 | ||
| インスリン-トランスフェリン-セレン (ITS -G) (100x) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 41400045 | |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| アムホテリシンB溶液 | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| アジ化ナトリウム | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| チメロサール | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| 没食子酸プロピル | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| グリセロール | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| ビオチン化 Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488コンジュゲートストレプトアビジン | ジャクソン免疫研究 | 016-540-084 | |
| 組換えマウスエフリン-B2 FC キメラタンパク質、CF | R&D Systems | 496-EB | |
| 組換えヒト IgG1 Fc、CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体 | R&D Systems | G-102-C | |
| リン酸緩衝生理食塩水錠剤 | Sigma-Aldrich | P4417 | 固定および免疫染色に使用 |
| デュモン #5, biologie tips, INOX, 11 cm | agnthos.se | 0208-5-PS | 2組の鉗子が必要 |
| 虹彩はさみ, ストレート, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| ドレッシング鉗子, ストレート, デリケート, 13 cm | agnthos.se | 08-032-130 | |
| ペトリ皿 Nunclo Delta 処理 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 150679 | |
| TMTP01300 イソポア メンブレン フィルター、ポリカーボネート、親水性、5.0 & マイクロ;m、13 mm、ホワイト、プレーン | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 ウェル、平底 | Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| 顕微鏡カバーガラス 24 x 50 mm 厚み。No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| カバーグラス No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| スライド ~76 x 26 x 1, 1/2-w. グラウンドプレーン | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL 遠心分離管 | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL 遠心分離管 | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircosscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbered mice, 雄, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbered mice, female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| グリーノー実体顕微鏡 | ライカ | ライカ S6 E |
参考文献
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
- Peuckert, C., ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
