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方法論記事

マウス胎児腎臓の解剖および培養

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DOI:

10.3791/55715

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2017年5月17日

 , 
1Department of Neuroscience, Uppsala University, 2Department of Organismal Biology, Evolutionary Biology Center, Uppsala University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、マウス胚からのmetanephric基盤を単離および培養するための方法を記載する。

要約

このプロトコールの目的は、マウスのメタネフリカの基礎の解剖、単離および培養のための方法を記述することである。

哺乳動物の腎臓発達中、2つの前駆組織、尿管芽および間葉間葉は、最終的に腎臓の収集系およびネフロンを形成するために、細胞機構を伝達し相互に誘導する。哺乳動物の胚が子宮内で増殖し、したがって観察者が接近できないので、器官培養が開発されている。この方法により、腎臓器官形成の間に上皮間葉相互作用および細胞の挙動を研究することが可能である。さらに、先天性腎臓および泌尿生殖路奇形の起源を調べることができる。慎重な解剖の後、metanephricの手先は、培地上に浮遊するフィルター上に移され、数日間細胞培養インキュベーターに保持することができます。しかし、条件が人工的であり、組織内の代謝に影響を及ぼす可能性がある。また、外植片に存在する細胞外基質および基底膜のために、試験物質の浸透が制限される可能性がある。

器官培養の1つの主な利点は、実験者が器官に直接アクセスできることである。この技術は安価で簡単であり、生物学的に活性な物質の添加、遺伝子変異の研究、高度なイメージング技術の適用など、多数の改変が可能である。

概要

哺乳類の腎臓は、中胚葉起源の2つの原始構造、すなわち管状上皮尿管芽と後腎間葉に由来します。腎形成中、尿管芽は後腎間葉に侵入して枝分かれし、収集システムを形成します。後腎間葉は、ネフロンの上皮要素を生じさせます。これらのプロセスは、正確なタイミングで空間的に調整された方法で発生し、相互の誘導メカニズムによって開始されます。両方の組織成分が通信し、他方の細胞形態形成に影響を与えます。

1920年代に、ニワトリの中腎管の生体内閉塞を行ったのはボイデンであり、分離した腎芽球が分化に失敗するため、誘導性相互作用の最初の兆候を提供しました1。ほぼ同時期に、ニワトリのネフリック原始を吊り下げて培養する最初の成功した試みが発表されました。その後、哺乳類の器官形成における組織相互作用を研究するために、臓器培養が開発されました。1950年代、グロブスタインは、中腎の原始物をフィルターで培養できる技術を開発しました。この技術はSaxénによって修正され、彼は培養皿1のTrowell型スクリーンにフィルターを配置しました。長年にわたり、臓器培養のための多くの改良と応用が生まれてきました。ここで説明する方法は、Saxénの技術に基づいていますが、フィルターが培地上に自由に浮遊し、培養の直径がフィルターの直径をわずかに超えるだけで、フィルターの不要な動きが制限されるため、簡略化されています。

全臓器培養は、器官形成中の細胞プロセスと細胞間コミュニケーションを調査するための古典的で安価でシンプルですが強力なツールです。臓器培養では、成長因子、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ウイルス、ペプチドなどの生物学的薬剤や、医薬品化合物などの化学物質による治療が可能です。また、遺伝子機能は、遺伝子改変マウスに由来する外植片を用いて、またはCre-loxPシステムのような誘導性遺伝子不活性化技術を用いて研究することができる。これにより、腎臓の発達に先立って胚致死を引き起こす遺伝子変異の研究が可能になります。臓器培養は、遺伝子機能や系統追跡のための蛍光標識や、細胞の挙動のリアルタイムモニタリングを可能にする最新のイメージング技術と組み合わせることもでき2。

ここで紹介する具体例では、EphrinB2活性化Eph受容体シグナル伝達が尿管芽の分岐形態に及ぼす影響を調査しました。EphA4/EphB2ダブルノックアウトマウスの形態は、腎発生におけるいくつかの重篤な欠損を示唆しており、これらは胚11日目(E11)という早い時期に検出可能で、尿管芽、尿管、および総腎管3に関与していました。Eph受容体を介したシグナル伝達には、リガンド-受容体二量体4のクラスタリングが必要です。Ephシグナル伝達を過剰に活性化するために、E11.5マウス胚由来の腎臓原線維を、クラスター化組換えEphrinB2-Fcの存在下で培養しました。EphrinB2は、尿管芽tips3で発現するEphA4受容体の既知のリガンドです。

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プロトコル

マウスは、スウェーデンの規制およびEU法（2010/63 / EU）に従って維持された。すべての手続きはスウェーデン倫理委員会のガイドライン（C79 / 9、C248 / 11、C135 / 14の許可）に従って実施された。ハイデルベルク大学での動物被験者の手順は、ハイデルベルク大学のRegierungspräsidiumKarlsruheとAnimal Welfare Officersによって承認されています。

1.培養用試薬および材料の調製

注：汚染を最小限に抑えるために、層流フードを使用してください。

  1. 解剖の日に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の1：5のモル比で抗ヒトFcヤギ抗体と混合することにより、ヒトFcに融合されたヒトFcのみまたはヒトFcに融合された組換えキメラエフリンタンパク質を前もってクラスター化する。 37℃で1時間インキュベートする。5 。
  2. ダルベッコ改変イーグル培地：栄養素を補充して培地を調製する1％ペニシリン/ストレプトマイシン（v / v）、1％グルタミン（v / v）、1％インシュリン - トランスフェリン - セレン（v / v）、50μg/ mlのヒトホロ - トランスフェリン、および1.5μg/ mLのアンホテリシンを含む。
    注：16胚には培地10 mLで十分です。
  3. 20μg/ mLの最終濃度のクラスター化組換えエフリン溶液を培地に添加する。クラスター化されたヒトFcを対照として使用する。
  4. 無菌のコーティングされていない平底のポリスチレン4ウェルプレートの各ウェルに培地500μLを加えて培養プレートを調製する。
  5. 滅菌鉗子を使用して、培地の上に穴あたり5μmの孔径を有するポリカーボネート膜フィルターを注意深く1つ置きます。調製したプレートをインキュベーター（37℃/ 5％CO 2 ）に移す。フィルターが上面に濡れていて浮いていることを確認してください。
    注：2つの腎臓の癌細胞には1つのフィルターで十分です。
  6. かみそりの刃を使用して、およそ30個のピペットチップ（容量：100μL）を切断して先端から1mmの位置で、より広い開口部をもたらす。チップをピペットチップラックに戻します。

2. E11.5におけるメタネフリックルディメントの解体

  1. E11.5で妊娠しているマウスを頸椎脱臼により犠牲にする（または地元の倫理委員会で承認された方法を使用する）。
  2. ブラウンら 6 ）の記載に従って、子宮および胚を取り除く。この時点から、解剖顕微鏡下で作業する。
  3. 第5時計メーカーの鉗子を使用して、前脚のすぐ下に胚を切断します。各胚のために新しいペトリ皿を使用してください。胚の脚と尾を外す。これを行うには、削除する組織を1組の5番時計メーカーの鉗子でつかみ、2番目のペアの先端を使用して切断します。
  4. 腹側器官の塊を取り除くには、一対の鉗子の先端を使用して、胚の体壁を吻側 - 尾側方向に横に開く。
    1. 表面と平行、tに平行彼は背の大動脈。血液充填された、したがって目に見える背側大動脈を方向付けに使用する。閉鎖した鉗子の先端を用いて体壁の腹側部分を背側部分から注意深く分離し、胚を裏返す。体側の壁を吻側から尾側に切断し、前側と同様に背側の大動脈を使用して向きを決めます。
  5. 腹側の身体の壁が背側の身体から分離されたら、1対の鉗子でそれをつかんで、それを臓器塊とともに慎重に引き抜く。
    注：metanephric anlagenは、通常、背の体の壁に付着したままになります。それらは、後肢のレベルに位置する長さ約200μmの楕円形の構造である。
  6. 腹側を上にして、1対の鉗子で背側の身体の壁を保持する。他の鉗子のペアを使用して、その吻側の端で背部の大動脈をつかんで背部の体の壁から背部の大動脈を注意深く剥がす。
    注：両方のメタニュークリニック腎臓は、通常、背部大動脈に投与した。
  7. 1対の鉗子を用いて、大動脈を除去するために吻側に吻側に切断する。次に、慎重に鉗子の先端を使用して2つの腎臓のanlagenを分離します。
  8. 慎重に鉗子の先端を使用して腎臓のanlagenから不要な組織を剥がす。間葉系に損傷を与えないよう注意してください。破損は、さらなる分析から外植片の成長不良および排除を招く可能性があるためです。
  9. 4ウェルプレートのポリカーボネートメンブランフィルターに10μLのPBSにマイクロタイターピペットとワイドオープンピペットチップを使用して、腎臓のanlagenを別々に移す。
    注：表面張力のため、外植片は薄い培地層で覆われます。 2つの腎臓のマーカーには1つのフィルターで十分です。
    1. 2つの腎臓のそれぞれをフィルターの各半分の中央に置きます。プレートを37℃/ 5％CO 2のインキュベーターに戻します。プレートはインキュベーターの中に放置してください次の胚からのイメントは、フィルター上に置く準備ができている。
  10. 各胚についてステップ2.3〜2.9.1を繰り返す。
    注：いくつかの練習では、解剖の手順は、胚あたり約5分かかるでしょう。
  11. 37℃/ 5％CO 2で3日間、腎臓の蛍光物質をインキュベートする。

3.固定化および染色のための試薬の調製

  1. カルシウムとマグネシウム（w / v）を含まないPBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製するために、PFAを60℃でPBSに溶解し、連続的に撹拌する。室温まで冷却し、紙フィルターを使用して残りの粒子を除去する。分注し、すぐに使用する場合は4℃に保ち、長期間保存する場合は凍結してください。
    注意：PFAは有毒です。現地の安全基準に規定されている個人用保護具を着用し、ヒュームフードで作業してください。施設ガイドラインと指定廃棄物容器を使用して廃棄物を廃棄してください。
  2. 透過液を調製するために、希釈したTriton X-1000.3％（v / v）までのカルシウムおよびマグネシウムを含まないPBS中でインキュベートした。
  3. ブロッキング溶液を調製するために、5％（v / v）ヤギ血清および0.1％Triton X-100をカルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSに加える。アジ化ナトリウムを0.02％（w / v）の最終濃度まで添加する。 4℃で保存する。
    注意：アジ化ナトリウムは有毒である。現地の安全および環境保護規制に従ってナトリウムアジドを取り扱ってください。
    注：染色のために抗体を使用する場合、二次抗体が由来する種からの5％血清を用いてブロッキング溶液を作製する。
  4. ビオチン化Dolichorus biflorusアグルチニンをブロッキング溶液で1：200希釈する。 Alexa488結合ストレプトアビジンをブロッキング溶液で1：200希釈する。
  5. すぐに使用できる包埋培地（材料の表を参照）を調製するために、0.1M Tris-HCl（pH 8.5）中の25％（w / v）グリセロールに0.1gの水溶性ポリビニルアルコール系粘膜接着剤/ 。連続的に攪拌しながら50℃に1時間加熱し、冷却し、1を用いてpHを8.0-8.5に調整する。M NaOH。より高いNaOH濃度を避けてください。 100μg/ mLのN-プロピルガレートおよびチメロサールを0.02％（w / v）の最終濃度に加える。室温で30分間撹拌する。
    注意：チメロサールは有毒です。現地の安全および環境保護規制に従って取り扱ってください。
    1. 50 mLのチューブに包埋培地を満たし、ローターをバランスさせ、3,200 xgで室温で10分間遠心する。透明な溶液を15 mLチューブに移し、ペレットを捨てる。分注し、数週間-20℃で保存します。解凍後、溶液を4℃に保ちます。使用直前に約30℃まで暖めます。
  6. 外植片を取り付けるためのフィルターをガラススライドとして準備します。このためには、インスタント接着剤を使用してスライドガラスの両側に小さなカバースリップ（18 x 18 mm）を2つ貼り付けます。間に15 mmのスペースを残してください。

4.固定および染色

  1. 3の培養期間後in vitroでインキュベートし （div）、インキュベーターからプレートを取り出し、マイクロピペットを用いて各ウェルから培地を注意深く吸引する。フィルターに触れないで、先端開口部を井戸の壁の方に保つようにしてください。
  2. 500μLの4％PFA / PBSを各ウェルに加える。フィルターは固定液に浮かぶでしょう。マイクロピペットを使用して、注意深くPFA固定剤を滴下して、フィルターを水没させる。室温で30分間インキュベートする。
    注記：以降のすべての手順では、外植片をフィルターから洗い流さないように注意しなければなりません。井戸の壁に向かってピペットチップの開口部を保つ。
  3. PFAを除去し、500μLのPBSで2回洗浄し、フィルターを浸します。 500μLの透過処理溶液を各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートする。
  4. 500μLのPBSで2回すすぎ、500μLのブロッキング溶液を各ウェルに加えます。室温で1時間インキュベートする。
  5. ブロッキング溶液を250μLのビオチン化Dolichorus biflorus凝集素をブロッキング溶液で1：200に希釈し、4℃で24時間インキュベートする。
  6. Dolichorus biflorusアグルチニン溶液を除去し、1ウェルあたり500μLのPBSで2回リンスする。
  7. ブロッキング溶液で1：200に希釈したAlexa488結合ストレプトアビジン250μLを添加し、4℃で24時間インキュベートする。あるいは、室温で2時間インキュベートする。
    注：4℃でインキュベートすると、より良いシグナル対ノイズ比が得られます。
  8. 1ウェルあたり500μLのPBSで2回すすぐ。鉗子を使用して、外植片を上にして、準備したガラススライドにフィルターを移す。 〜50〜100μLの包埋培地でマウントする。長さ60mmの1.5号カバースリップで覆う。包埋媒体溶液を暗所で室温で2時間固化させる。イメージングに進むか、フォイルに包まれたスライドを4°Cで画像化するまで保存します。
  9. 広視野落射顕微鏡7 <（励起帯域、460〜495nm;二色性鏡、505nm、および発光バンドパス、510〜550nm）および20X Plan-Apochromatレンズ、0.75数値絞り。

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結果

Metanephric kidney anlagenは、E11.5で妊娠したBlack-6近交系マウスに由来し、培養した。 3日後、尿管芽は5回まで分岐し、最初はT字型の尿管芽が分岐した。各外植片を撮影し、分節世代を決定し、分枝あたりのエンドポイントの数を計算するために、セグメントおよびエンドポイントの数を定量化した（ 図1 ）。 ImageJ（ rd世代;第4世代は、移植外植片のわずか8％で到達したが、対照外植片の35％（ 図1b ）と比較して、分岐あたりのエンドポイント数およびmm 2あたりのエンドポイント数は、さらに、外植片の3分の1が尿管芽の先端に異常な形態を有していた（ 図1 ）ことから、EphrinB2には拘束効果がある可能性が示唆されたEphA4およびEphB2の順方向シグナル伝達を活性化することにより、尿管芽分岐プロセスにおいて、

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ディスカッション

この写本は、発達中のメタネフリカのanlagenをマウスの胚から単離し、器官を培養する方法を記述しています。この方法は、Grobstein 8とSaxén9,10によって開発された標準的な手法であり、多くの他者11,12によって適応され、変更されています。この方法の成功は、主に、外植片の生存および誘導電位の低下が切開時間の延長に伴う切開の持続時間に依存する。腎臓基底組織を周囲の組織から浄化する場合、間葉系を損傷しないように注意しなければならない。間葉間葉の損傷は、しばしば外植片の乏しい成長の理由である。しかし、解剖速度および精巧な運動能力は、実践によって大きく改善する。

提示されたプロトコールにおける化学的に規定された培地は、一次細胞およびインビトロ器官培養物中の血清含有培地中で培養し、外植片の成長および生存を支持するためにインスリントランスフェリンセレンを補充したDMEMおよびHam's F-12の1：1（v / v）混合物を含有する。グルコースおよびアミノ酸...

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開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

筆者はLeif OxburghとDerek Adamsの知識共有、Leif Oxburghの原稿への有用なコメント、StefanWölflとUlrikeMüllerのテクニカルサポート、Saskia Schmitteckert、Julia Gobbert、Sascha Weyer、Viola Mayerに感謝します。ラボこの研究は、Development、The Biology of Company （CPへ）によって支持された。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEM/F-12サーモフィッシャーサイエンティフィ21331020
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)サーモフィッシャーサイエンティフィ15140148
GlutaMAX サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィ35050061
DPBS、カルシウム、マグネシウムサーモフィッシャーサイエンティフィ14040117解剖に使用
Sigma-AldrichT0665
インスリン-トランスフェリン-セレン (ITS -G) (100x)サーモフィッシャーサイエンティフィック41400045
パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich158127
アムホテリシンB溶液Sigma-AldrichA2942
Triton X-100Sigma-AldrichX100
アジ化ナトリウムSigma-AldrichS8032
チメロサールSigma-AldrichT5125
没食子酸プロピルSigma-Aldrich2370
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381
グリセロールSigma-AldrichG5516
ビオチン化 Dolichorus Biflorus AgglutininVector LaboratoriesB-1035
Alexa488コンジュゲートストレプトアビジンジャクソン免疫研究016-540-084
組換えマウスエフリン-B2 FC キメラタンパク質、CFR&D Systems496-EB
組換えヒト IgG1 Fc、CFR&D Systems110-HG-100
ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体R&D SystemsG-102-C
リン酸緩衝生理食塩水錠剤Sigma-AldrichP4417固定および免疫染色に使用
デュモン #5, biologie
tips, INOX, 11 cm		agnthos.se0208-5-PS2組の鉗子が必要
虹彩はさみ, ストレート, 12 cmagnthos.se03-320-120
ドレッシング鉗子,
ストレート, デリケート, 13 cm		agnthos.se08-032-130
ペトリ皿 Nunclo Delta 処理サーモフィッシャーサイエンティフィ150679
TMTP01300 イソポア メンブレン フィルター、ポリカーボネート、親水性、5.0 & マイクロ;m、13 mm、ホワイト、プレーンMerckMilliporeTMTP01300
Nunclon Multidishes
4 ウェル、平底		Sigma-AldrichD6789-1CS
顕微鏡カバーガラス 24 x 50 mm 厚み。No.1.5H 0.17+/-0.005 mmnordicbiolabs107222
カバーグラス No.1.5, 18 mm x 18 mmnordicbiolabs102032
スライド ~76 x 26 x 1, 1/2-w. グラウンドプレーンnordicbiolabs1030418
VWR Razor BladesVWR55411-055
50 mL 遠心分離管Sigma-AldrichCLS430828
15 mL 遠心分離管Sigma-AldrichCLS430055
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, crepedSigma-AldrichWHA1213125
Fixed stage research mircosscopeOlympusBX61WI
Black 6 inbered mice, 雄, C57BL/6NTacTaconicB6-M
Black 6 inbered mice, female, C57BL/6NTacTaconicB6-F
グリーノー実体顕微鏡ライカライカ S6 E
ック ック ック ック ヒトのック

参考文献

  1. Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
  2. Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
  3. Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
  4. Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
  5. Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
  6. Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555(2011).
  7. Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
  8. Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
  9. Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
  10. Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
  11. Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
  12. Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
  13. Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
  14. Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
  15. Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550(2010).
  16. Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
  17. Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
  18. Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
  19. Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
  20. Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
  21. Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).

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