末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

サマリー

我々は、胚様体（EB）形成、線維芽細胞増殖および軟骨形成誘導を含む無組み込み法を用いて、誘導末梢血（PB）から誘導された多能性幹細胞（iPSC）を介して軟骨系統を生成するためのプロトコールを提示する。

要約

この研究では、統合された方法で誘導された多能性幹細胞（iPSCs）を介して軟骨細胞を産生するために、末梢血細胞（PBC）を種細胞として使用した。胚様体（EB）形成および線維芽細胞増殖に続いて、iPSCは、無血清および無細胞条件下で21日間軟骨分化のために誘導される。軟骨細胞誘導後、形態学的、免疫組織化学的および生化学的分析、ならびに軟骨形成性分化マーカーの定量的リアルタイムPCR検査によって、細胞の表現型を評価する。軟骨形成性ペレットは、アルシアンブルーおよびトルイジンブルー染色が陽性であることを示す。コラーゲンIIおよびX染色の免疫組織化学も陽性である。硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）含量および軟骨分化マーカーCOLLAGEN2 （ COL2 ）、 COLLAGEN10 （ COL10 ）、 SOX9およびAGGRECANは、hiPSCsおよび線維芽細胞と比較して非還元性のペレットが得られた。これらの結果は、PBCを軟骨修復のためのiPSCsを生成するための種細胞として使用することができることを示唆しており、これは患者特異的かつ費用対効果が高い。

概要

軟骨組織は、自己修復および再生の能力が非常に低い。様々な外科的介入および生物学的処置が、不十分な結果を伴って軟骨および関節機能を回復させるために使用される。最近の幹細胞技術の発展は、軟骨修復領域全体を変化させる可能性がある¹ 。様々な幹細胞が種細胞として研究されてきたが、拒絶反応を起こさずに多くのタイプの患者特異的細胞を提供することができるため、ヒト誘導性多能性幹細胞（hiPSC）が最も有望な選択肢であるようである² 。さらに、成人細胞の限られた増殖性を克服し、自己複製能および多能性を維持することができる。さらに、特定のタイプの軟骨細胞を得るために遺伝子ターゲティングを用いて遺伝子型を変えることができる。

再プログラミングの可能性も十分に研究されているので、繊維芽細胞はiPSCを生成するために広く使用されている。しかし、患者からの痛みを伴う生検や、線維芽細胞のin vitroでの拡大が必要であり、遺伝子突然変異を引き起こす可能性があるなど、まだ克服しなければならないいくつかの限界が存在する³ 。最近、PBCはリプログラミング⁴にとって有利であることが判明した。さらに、それらは一般に利用され豊富に貯蔵されていた。研究の焦点を皮膚からリダイレクトする可能性があります。しかし、私たちが知る限りでは、軟骨細胞への分化が続くPBCの再プログラミングに関する報告はほとんどありません。

現在の研究では、軟骨細胞の形成を模倣するために、iPSCをそれらをiPSCに再プログラミングし、次いでペレット培養系を介して軟骨系統に分化させることによって、PBCを代替源として利用する。

プロトコル

PBCsからhiPSCを生成するためのプロトコールは、我々の以前の研究^5に見出すことができる。この研究は、私たちの機関の機関審査委員会によって承認されました。

1.胚様体（EB）形成

1. 5％ウシ胎児血清（FBS）、1×非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、2mM L-メルカプトエタノール、2mM L-メチオニン、および2mM LPSを補充したノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） - グルタミン、および8ng / mL塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含む。
2. 50mLのEB形成培地を調製する：15％KSR、5％FBS、1x非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを添加したDMEM。
3. 20％FBS、1×非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを補充した基礎培地50mLを調製する。
4. ディスパーゼ溶液10 mLをノックアウトDMEMで1 mg / mLに調製する。
5. カルチュフィーダー細胞（ すなわち、照射されたマウス胚線維芽細胞の単層）を有する60mm組織培養皿上に再平滑化した。細胞が80〜90％コンフルエントである場合、細胞をディスパーゼで解離させ、4〜5日ごとにhiPSCs1：3を通過させる。 37℃および5％CO ₂インキュベーターに細胞を入れる。
6. iPSCsが80〜90％コンフルエントである場合、未分化hIPSCコロニーを火で引かれたガラス針を用いてより小さな断片（直径約50〜100μm）に解剖する。一般に、100mmのペトリ皿にEBを生成するために60mmの皿にhiPSCコロニーを使用します。
   1. 10mLのEB形成培地を含む100mmの付着していないペトリ皿に100個未満の小さなコロニーを培養する。皿を37℃および5％CO ₂インキュベーターに入れる。
7. 初期培地の約25％を2日ごとに等量の基礎培地に交換する。 EBを落ち着かせるためにディッシュを傾けます。注意深く3 mL新鮮な基礎培地4 mLを添加する。 EBを邪魔しないでください。
   注：EBは、コロニーの断片によって形態学的に特徴付けられ、顕微鏡下で滑らかな境界を有する丸い外観をとる。
8. 非粘着性のペトリ皿で10日間培養した後、使用前に37℃で30分間、4℃の0.1％ゼラチンで新しい100mm組織培養皿をコーティングする。
9. 培地とEBを100 mmの付着していないペトリ皿から15 mLコニカルチューブに移す。 EBを4〜5分間沈降させる。上清を注意深く吸引し、培地+ EBの0.5 mL未満を残す
10. 10mLの基礎培地を含む100mmのゼラチン被覆組織培養皿上に100個未満のEBを種子に接種する。皿を37℃および5％CO ₂インキュベーターに入れる。

細胞ペレット形成および軟骨細胞分化

1. 0.25％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）10 mLを調製する。 basの80 MLを作るα培養培地：20％FBS、1×非必須アミノ酸、55μM2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを補充したDMEM。
2. 10％インスリントランスフェリンセレン溶液（ITS）、0.1μMデキサメタゾン、1mMアスコルビン酸、1％ピルビン酸ナトリウム、および10ng / mLのトランスフォーミング増殖因子 - セレン溶液を補充したDMEM（高グルコース） β1（TGF-β1）である。
3. 48時間後に培地を10 mLの基礎培地で再び分けます。その後、10mLの基礎培地で3日ごとに培地をリフレッシュする。
   注：培養10日後、線維芽細胞の細胞の伸長はEBから拡大しているはずです。
   1. 使用前に、100 mmディッシュを4 mlの0.1％ゼラチンで30分間37℃でコートします。細胞上清を捨て、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で一度洗浄する。
   2. 細胞を37℃で5分間0.25％トリプシン/ EDTA 3 mLで消化し、4 mで中和するLの基礎培地を含む。
4. 5〜10回上下にピペッティングし、70μmナイロンメッシュに通すことにより、細胞を単一細胞に解離させる。細胞懸濁液を200xgで5分間遠心分離する。新しい100mmゼラチンコート組織培養皿に細胞を基礎培地10mLで再播種する。
5. 48時間後に培地を10 mLの基礎培地で再び分けます。その後、10mLの基礎培地で3日ごとに培地をリフレッシュする。
   注：細胞は、均一な線維芽細胞様形態を獲得する。
6. 約90〜100％のコンフルエンスに達したら（ すなわち、約5〜7日）、細胞を37℃で0.25％トリプシン/ EDTA 3mLで5分間採取する。基本培地4 mLで中和する。ピペットで5回上下させることにより、細胞を単一の細胞に解離させる。血球計算盤を使用して細胞数を数えます。
   1. 15mLポリプロピレンチューブに3×10 ⁵個の細胞を入れる。 200 xgで遠心分離機室温（RT）で5分間インキュベートする。 1mLの軟骨形成分化培地で細胞を再懸濁する。
7. 細胞を300xgで3分間再遠心分離し、小さなペレット形態で細胞を維持する。チューブを37℃および5％CO ₂インキュベーターに21日間入れる。蓋をしっかり締めてガス交換をしないでください。
8. 新鮮な軟骨形成分化培地で3日ごとに培地の3/4を交換する。
   注：培養21日後、hiPSC-軟骨形成ペレット（hiPSC-Chon）が形成されているはずである。陽性対照としてのヒト間葉系幹細胞（MSC）も回収し、軟骨形成性分化培地で21日間培養し、軟骨形成性ペレット（hMSC-Chon）を形成する。

3.軟骨分化の解析

1. 10％中性緩衝ホルマリン10 mLを調製する。
2. 50mLの0.1％アルシアンブルー試薬と50mLの1％トルイジンブルー試薬を調製する。
3. Pr一次抗体：コラーゲンII（1:50）に対するウサギポリクローナル抗体またはコラーゲンX（1:50）に対するマウスモノクローナル抗体の1mLを発現させる。また、抗ウサギまたはマウス二次抗体を調製する。
4. 1mLのパパイン溶液を調製する：0.1M酢酸ナトリウム、2.4mM EDTA、および5mM L-システインを含むPBS中10U / mL。
5. 100ミリリットルのジメチルメチレンブルー（DMMB）染料溶液を調製する：100μLの16mg / Lの1,9-ジメチルメチレンブルー、40mMのグリシン、40mMのNaCl、および9.5mMのHCl; pH3.0。
6. ペレット切片のアルシアンブルーおよびトルイジンブルー染色による軟骨形成分化を評価する。
   1. 1mLの10％中性緩衝ホルマリン中で24時間、1つのhiPSC-ChonペレットまたはhMSC-Chonペレットを固定する。
   2. ペレットをH ₂ O中の70％エタノール1mLに移す。ペレットを1mLの段階的エタノールシリーズ（ すなわち、 25,50,75,90,95,100および100％、それぞれ3分間）で脱水する。
   3. ペレットを1％100％キシレンで3回洗浄する。侵入者ペレットを65℃のオーブン中でパラフィンで1時間処理する。通常の組織学的手順⁶に従って、ペレットをパラフィンブロックに7×7×5mm ³ベース金型で埋め込む^。6 。
   4. 約4μmの厚さのミクロトームで隣接する切片を作る⁷ 。セクションをスライドガラスに貼り付けます。
   5. スライドを60℃で2時間オーブンで乾燥する。 100％キシレンを用いて3サイクル（各3分）で切片を脱パラフィンする。
   6. 再水和（ すなわち、 H ₂ O中100,100,95,95,70,50、および25％、それぞれ3分間）のために減少するアルコール系列を使用し、次いで5分間脱イオン水で最終的なすすぎを行う。
   7. 0.1％アルシアンブルー試薬または1％トルイジンブルー染色で4〜5時間染色した後、蒸留水ですすいでください。
   8. 段階的エタノールシリーズ（ すなわち、 25,50,75,90,95,100,100％、各3分）で脱水し、続いて3回連続して100％キシレンでの浄化のeps。スライドをマウントし、顕微鏡で視覚化します。
7. 免疫組織化学を行う。
   注：追加のペレット切片を免疫組織化学によってさらに評価する。
   1. 脱パラフィンおよび再水和後、スライドを1mM EDTA、pH8.0（オートクレーブで沸騰させた水中での防水）中で沸騰させる。それらを沸点以下の温度で8分間放置させ、次にスライドを室温で冷却させる。
   2. スライドを脱イオン水で3回すすぐ。切片をメタノール中の3％H ₂ O ₂溶液に室温で15分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックする。
   3. 脱イオン水でスライドをすすぎ、DPBSに5分間浸します。 50-100μLの適切に希釈した（1:50）一次抗体をスライド上の切片に適用し、次にそれらを加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートする。
   4. DPBSでスライドを3回（各5分）洗浄する。 saをインキュベートする対応する二次抗体（ すなわち、抗ウサギまたはマウス）と、RTで15分間掛けた。
   5. DPBSでスライドを3回（それぞれ5分間）洗浄する。顕微鏡下でDAB検出を行います。
   6. スライドをDPBSで3回洗浄する（各2分）。スライドをヘマトキシリン中に1〜2分間浸して細胞核を対比染色する。漸変エタノールシリーズ（25,50,75,90,95,100,100％;各3分）で脱水した後、キシレンで3回連続して清澄化する。最後に、スライドをマウントし、それらを顕微鏡下で視覚化する。
8. sGAGコンテンツを検出します。
   1. 60℃で2時間、パパイン溶液中の軟骨形成性のペレットを消化する。
   2. dsDNAアッセイキットおよび蛍光光度計システムを使用してDNA含量を決定する。 525 nmの⁸の吸光度を測定する下DMMB色素溶液と混合することによってのsGAG含量を測定します。
   3. 標準曲線に対するsGAGの濃度を計算するサメのコンドロイチン硫酸。
9. hiPSC-Chonペレット中の軟骨分化マーカーのリアルタイムPCR分析を実施する。
   1. 500μLの氷冷抽出試薬を1本のチューブに加えることにより、同じ軟骨形成性のペレットを3〜4回収穫する。徹底的にボルテックス。サンプルを室温で5分間インキュベートする。
   2. 0.1mLのクロロホルムを加える。サンプルを15秒間ボルテックスし、室温で3分間インキュベートする。 12,000 xgおよび4℃で15分間サンプルを遠心分離する。上水相（約250μL）を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移す。
   3. 25μLの酢酸ナトリウムと1μLのグリコーゲンをサンプルに添加する。 250μLのイソプロピルアルコールと混合してRNAを沈殿させます。徹底的に混合する。サンプルを室温で10分間インキュベートする。
   4. 12,000 xgおよび4℃で10分間遠心分離する。上清を完全に除去する。 RNAペレットを500μLの75％エタノールで2回洗浄する。
   5. 5分間遠心分離する7,500 xgおよび4℃で測定した。残りのエタノールをすべて除去し、RNAペレットを5〜10分間風乾します。 10μLのヌクレアーゼフリー水にRNAを溶解する。
   6. 逆転写酵素システムを用いてRNAをcDNAに変換する。定量PCRキットマスターミックス（2×）を用いて、リアルタイムPCRおよびリアルタイムPCRシステム⁹にcDNAサンプルを施します。
      注：プライマー配列は次のとおりです。
      h AGGRECAN -F：TCGAGGACAGCGAGGCC;
      h AGGRECAN -R：TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      hβ-ACTIN -F：TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      hβ-ACTIN- R：GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      h COL2- F：TGGACGATCAGGCGAAACC;
      h COL2- R：GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      h SOX9- F：AGCGAACGCACATCAAGAC;
      h SOX9- R：CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      h COL10- F：ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      h COL10- R：GGTAGTGGGCCTTTATGCCT。

結果

hiPSCsの軟骨形成分化：

EB形成培地および基礎培地を使用してhiPSCを間葉系統に分化させた。多段階培養法を用いた（ 図1 ）。最初に、hiPSCを10日間EB形成により自発的に分化させた（D10; 図2A ）。第2に、細胞はEBからさらに10日間（D10 + 10）逸脱した。これらの2つのステップの間、iPSCは徐々に元の形態を失い、紡錘形の形態を得た（ 図2B ）。その後、通過後に線維芽細胞の形態に変化した。第3に、継代培養後に細胞を単層で増殖させた（ 図2C ）。残りの未分化細胞は、この工程中に除外した。その後、細胞を増殖させ、線維芽細胞様細胞に曝露した。単層培養で5〜7日間（D10 + 10 + 7）。第...

ディスカッション

ここでは、iPSCを介してPBCから軟骨細胞を生成するためのプロトコールを提供する。 PBCはより一般的であり、臨床分野で広く使用されているので、それらは再プログラムのための潜在的な代替物として提示される。この研究では、エピソームベクター（EV）を用いて、Zhang らによって確立された方法に従って、PBCをiPSCに再プログラムした。 ¹¹ 。この統合のないアプローチは、臨床分野^12、13で幅広い効果を持つと考えられているウイルス関連遺伝毒性を、統合関与しません。この研究における血球からのインテグレーションフリーiPSCsの生成の再プログラミング効率が満足された。末梢血2mLから30個以上のiPSCを作製することができました。したがって、PBCは、軟骨工学および他の臨床応用のためのiPSCを生成するために使用される種細胞である可能性がある。

軟骨形成分化の主要なステップEB形成、E...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ノックアウトDMEM	Invitrogen	10829018	hiPSC培養およびEB形成培地に使用される基礎培地
ノックアウト血清補充(KSR)	Invitrogen	10828028	hiPSC培養およびEB形成培地に使用される、より明確なFBSフリー培地サプリメント
シ胎児血清(FBS)	Hyclone	sh30070.03	hiPSC培養およびEB形成培地に使用され、細胞に優れた価値を提供します培養
非必須アミノ酸	Chemicon	TMS-001-C	細胞増殖と生存率を高めるために、すべての細胞培養培地で増殖サプリメントとして使用され、
L-グルタミン	Invitrogen	TMS-002-C	細胞培養に必要なアミノ酸
基本的な線維芽細胞増殖因子(bFGF)	Peprotech	100-18B	ヒトiPS細胞の多能性と自己再生の維持に使用されるサイトカイン
Dispase	Invitrogen	17105041	継代培養のためのhiPSC解離に使用
DMEM	Gibco	C11960	MSC培養培地に使用した基礎培地
0.1%ゼラチン	ミリポア	ES-006-B	皿への細胞付着に使用
0.25%トリプシン/EDTA	Gibco	25200072	細胞解離に使用
DPBS	Gibco	14190250	細胞洗浄または試薬の調製に使用されるバランスの取れた塩溶液
2-メルカプトエタノール	invitrogen	21985023	すべての細胞培養培地で増殖サプリメントとして使用されます。
ITS	invitrogen	41400045	インスリン、トランスフェリン、セレン溶液。軟骨原性分化に使用されます。
アスコルビン酸	シグマ	4403	ビタミンCとして知られています。それは活発な成長を助け、抗酸化特性を持っています。
ピルビン酸ナトリウム	Gibco	11360070	グルコースに加えてエネルギー源として細胞培養培地に添加されます。
トランスフォーミング成長因子-ベータ1	Peprotech	AF-100-21C	細胞の増殖、成長、軟骨形成分化を調節するサイトカイン。
コラーゲンIIに対するウサギポリクローナル抗体	Abcam	ab34712	この抗体は、軟骨組織に特異的なII型コラーゲンと反応します。
コラーゲンに対するマウスモノクローナル抗体 X	Abcam	ab49945	この抗体は、高トロフィック軟骨細胞の産物であるX型コラーゲンと反応します。
パーマウント	フィッシャーサイエンティフィック	SP15-100	スライドの取り付けおよび長期保存用
トルイジンブルー	シグマ	89640	プロテオグリカンの検出に使用されます。
アルシアンブルー	アムレスコ	#0298	グルコサミノグリカンの検出に使用されます。
パパイン	シグマ	P4762-25MG	軟骨原性ペレットの消化に使用されます。
ジメチルメチレンブルー	シグマ	341088-1G	グリコサミノグリアンコン
ドロイチン硫酸ナトリウム塩	シグマ	C4384-250MG	sGAG含有量測定の標準曲線を描くために使用されます。
Qubit dsDNA HSアッセイキット	Invitrogen	Q32851 (100)	DNA含有量の測定に使用
TRIzol	Invitrogen	15596018	細胞からのRNA単離に使用
逆転写酵素システム	Promega	A3500	RNAをcDNAに変換するために使用
SYBR FAST qPCRキット Master Mix	Kapa	KK4601	リアルタイムPCRに使用