このプロトコルは、非接着性/間葉性乳房上皮細胞からの細胞外小胞（EVs）/エキソソームの精製、定量化および特徴づけ方法、ならびにこれらを用いて乳腺上皮細胞に乳腺形成能を転移させる方法を記載する。幹様乳腺上皮細胞に由来するEV /エキソソームは、この細胞特性をEV /エキソソームを摂取する細胞に移入することができる。
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方法論記事
細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達
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この記事について
サマリー
要約
細胞は、エキソソームを介して、タンパク質、脂質、および核酸を含む約100nmの細胞外小胞（EV）と通信することができる。非接着/間葉系乳房上皮細胞（NAMEC）由来の細胞外小胞は、示差的超遠心分離によってNAMEC培地から単離することができる。それらの密度に基づいて、EVは110,000×gでの超遠心分離によって精製することができる。超遠心分離からのEV調製物は、可溶性タンパク質の混入を防ぐために連続密度勾配を用いてさらに分離することができる。次いで精製されたEVを、調製物中の小胞のサイズおよび数を測定するナノ粒子追跡分析を用いてさらに評価することができる。 50〜150nmの範囲の細胞外小胞はエキソソームである。 NAMEC由来のEV /エキソソームは、乳腺上皮細胞によって摂取され得、これは、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡によって測定され得る。いくつかの乳腺幹細胞の特性（ 例えば、乳腺形成能）は、NAMEC由来EVs /エキソソームを介して、幹様NAMECから乳房上皮細胞に移され得る。単離された一次EpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺細胞は、マウス脂肪パッドに移植された後、乳腺を形成することができず、EpCAM lo / CD49fは、移植後に乳腺を形成する。 EpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺上皮細胞によるNAMEC由来EVs /エキソソームの取り込みは、脂肪パッドに移植された後に乳腺を発生させる。幹様乳腺上皮細胞に由来するEV /エキソソームは、EpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺上皮細胞に乳腺形成能を伝達する。
概要
エキソソームは細胞間の膜とサイトゾルタンパク質、脂質、RNAを伝達することで細胞間の伝達を媒介することができます1 。エキソソーム媒介性の伝達は、多くの生理学的および病理学的プロセス（ すなわち、抗原提示、寛容2の発生および腫瘍進行3 ）に関与することが実証されている。エキソソームはしばしば、それらを放出するソース細胞のものと同様の内容を有する。したがって、エキソソームは、供給源細胞から特定の細胞特性を運び、それらを摂取する細胞にこれらの特性を伝達することができる4 。
エキソソームは、50〜150nmの二重層膜ベシクルであり、特異的マーカー（ 例えば、 CD9、CD81、CD63、HSP70、Alix、およびTSG101）を提示する。したがって、エキソソームは、異なる側面のための様々な方法によって特徴付けられなければならない。透過電子顕微鏡法を用いて膜小胞を可視化することができる例えば、エキソソーム4,5 。精製されたエキソソームのサイズおよび数を測定するために、ナノ粒子追跡分析（NTA）および動的光散乱分析（DLS）が使用される。エキソソームの脂質膜含量は、密度勾配によって確認することができる。 CD....
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プロトコル
動物を含むすべての研究は、動物管理機関委員会によって承認されたプロトコールを遵守した。
1.細胞外小胞/エキソソームの単離および検証
- 培養乳房上皮基底細胞、NAMEC 4、500mLのMCDB170、pH7.4 + 500mLの重炭酸ナトリウム（0.2438％）を含むDMEM / F12からなる新鮮な無血清培地; EGF（5ng / mL）。ヒドロコルチゾン（0.5μg/ mL）;インスリン（5μg/ mL）。ウシ下垂体抽出物（BPE;35μg/ mL）;およびGW627368X（1μg/ mL）を15cmディッシュに入れた。
- 血球計数器で細胞を計数した後、0日目に15cmディッシュあたり12mLの培地に1.2x10 6個の細胞を4日間播種する4 。
- 培養4日後、卓上遠心分離機を用いて300 xgで5分間遠心します。上清をコニカルチューブに移す（ 図1 ）。
- 上清を遠心分離する。卓上遠心分離機で2,000 xg、20分間。上清を超遠心分離チューブに移し、死んだ細胞と細胞破片を残す（ 図1 ）。
- 上清を10,000 xgで30分間4℃で遠心分離します。上清を新しい超遠心チューブに移す（
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結果
PGE 2 / EP 4シグナル伝達を遮断することにより、乳房基底様幹細胞4からのEV /エキソソーム放出が誘発されることが示されているので、この研究は、誘発されたEV /エキソソームを乳房上皮基底細胞（NAMEC）培養から単離する方法を提示する。 NAMECは無血清培地で培養されるため、血清由来のEV /エキソソームは存在しない13 。血清含有培地で培養した細胞の場合、培地中の既存のエキソソームは、EV /エキソソーム5の収集のために培地を培養するために培地を使用する前に、110,000×gでの超遠心分離によって予め洗浄しなければならない。図1に示すように、4日間誘導したNAMEC条件培地からのEV /エキソソームを、示差的超遠心分離によって110,000×gペレットから単離することができる。単離された小胞の数およびサイズは110,000×gのペールナノ粒子追跡分析（NTA）を用いて.......
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ディスカッション
エキソソームは、それらを放出した細胞の特徴を有することが多く、放出されたエキソソームの量は、刺激によって誘発され得る4 。細胞の培養培地を回収し、EV /エキソソーム収集のための示差的超遠心分離に供することができる（ 図1 ）。現在のところ、EV /エキソソームを単離する理想的な方法に関する一般的な合意はない。ここで使用される最適な方法は、下流アプリケーション14によって決定されている。超遠心分離は、EV /エキソソームの生物学的活性を保存することができるEV /エキソソームの単離のための比較的速い方法である。しかしながら、超遠心分離によって単離された小胞は、一般に、エンドソーム区画を介して産生されるエキソソームおよび/または細胞膜からの出芽を介して産生される小胞を含むEVの混合物を含む。
小胞のサイズをNTAで分析することにより（ 図4A ）で.......
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開示事項
著者は何も開示することはない。
謝辞
この研究は、国立健康研究所（05A1-CSPP16-014、HJL）および科学技術省（MOST 103-2320-B-400-015-MY3、HJL）からの助成金によって支えられた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| MCDBの170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K 超遠心分離機 | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | ナノ粒子追跡分析 (NTA) |
| オプティプレップ | Sigma-Aldrich | D1556 | 水中のヨージキサノールの60%(w / v)溶液(滅菌)。 |
| CD81 | GeneTex | GTX101766 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 >C、一晩 |
| CD9 | GeneTex | GTX100912 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C、一晩 |
| CD63抗体 | Abcam Ab59479 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C、一晩 | |
| TSG101 抗体 | GeneTex | GTX118736 | 1:1,000 含有 5% w/v 無脂粉乳、1x TBS、0.1% Tween 20 at 4 >C、一晩 |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 >C、一晩 |
| CFSE(カルボキシフルオレセインスクシンイミジルジアセテートエステル) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | 蛍光細胞分析装置 | |
| コラゲナーゼIV型 | サーモ | 17104019 | |
| トリプシン | サーモ | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | 組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム |
| アキュターゼ | ebioscience | 00-4555-56 | タンパク質分解酵素活性およびコラーゲン分解酵素活性 |
| STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL | |
| 抗CD49f抗体 | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| 抗EpCAM抗体 | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| ヒト乳腺上皮細胞(HMLE細胞、NAMC) | ロバート・ワインバーグ博士からの贈り物 | ||
| パーマウント | サーモフィッシャーサイエンティフィック | SP15-500 | |
| 重炭酸ナトリウム | ザイメセット | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| インスリン | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE(ウシ下垂体抽出物) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | ケイマン | 10009162 | |
| 15cmカルチャーディッシュ | ファルコン | ||
| 卓上遠心分離機 | Eppendrof | 遠心分離機3415R | |
| 超遠心チューブ | ベックマン | 344058 | |
| PBS(リン酸緩衝生理食塩水) | コーニング | 46-013-CM | |
| BCA プロテインアッセイ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 23228 | |
| 透過型電子顕微鏡 | 立 | HT7700 | |
| ゼラチン | STEMCELL | 7903 | |
| 10cm培養皿 | ファルコン | ||
| 6ウェル培養皿 | Corning | 3516 | |
| 雌 C57BL/6 マウス | NLAC (国立動物実験動物センター | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| ゲンタマイシン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| ペン/連鎖球菌 | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorane | ハロカーボン | NPC12164-002-25 | |
| ホルムアルデヒド | マクロン | H121-08 | |
| EtOH (エタノール) | J.T. Baker | 800605 | |
| 氷酢酸 | Panreac | 131008.1611 | |
| 硫酸アルミニウム | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| キシレン | ライカ | 3803665 | |
| 0.22 μm メンブレン | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP 創傷クリップ、9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP 創傷クリップ Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ディープレッド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | C10046 | 原形質膜染色 |
参考文献
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
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