方法論記事

ネイティブ電気泳動、インゲルアッセイおよび電気溶出を用いたミトコンドリア電子輸送鎖のスーパーコンプレックスの解析

DOI：

10.3791/55738

⸱

2017年6月1日

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコールは、機能的ミトコンドリア電子輸送鎖複合体（Cx）IVおよびそれらのスーパーコンプレックスの、それらのアセンブリおよび構造に関する情報を明らかにするための天然の電気泳動の分離を記載する。天然ゲルは、イムノブロッティング、ゲル内アッセイ、および電気溶出による精製を受けて、個々の複合体をさらに特徴付けることができる。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミトコンドリア電子輸送鎖（ETC）は、様々な燃料の分解から誘導されたエネルギーを細胞のATPの生体エネルギー通貨に変換する。 ETCは、レスピラソーム（CI、C-III、およびC-IV）と呼ばれるスーパーコンプレックスと、電子輸送およびATP産生の効率を高めるシンターソーム（CV）にアセンブルする5つの巨大タンパク質複合体からなる。 ETC機能を測定するために50年以上にわたって様々な方法が用いられてきたが、これらのプロトコルは個々の複合体およびスーパーコンプレックスの集合に関する情報を提供しない。このプロトコールは、ETC複合体構造を研究するために20年以上前に改変された方法であるネイティブゲルポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）の技術を記載している。ネイティブ電気泳動は、ETC複合体の活性型への分離を可能にし、イムノブロッティング、インゲルアッセイ（IGA）、および電気溶出による精製を用いてこれらの複合体を研究することができる。また、ネイティブゲルPAGEの他のミトコンドリアアッセイの結果と比較すると、ETC活性、その動的なアセンブリおよび分解、およびこれがミトコンドリアの構造および機能をどのように調節するかについてのコンプリータ画像を得ることが可能である。この作業では、これらの技術の限界についても検討する予定です。要約すると、以下に示すイムノブロッティング、IGA、および電気溶出が続くネイティブPAGEの技法は、ミトコンドリアETCスーパーコンプレックスの機能性および組成を調べる強力な方法である。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATPの形態のミトコンドリアのエネルギーは、細胞生存に必須であるだけでなく、細胞死の調節にも必須である。酸化的リン酸化によるATPの生成には、機能的電子伝達鎖（ETC; Cx-1〜IV）およびミトコンドリアATPシンターゼ（Cx-V）が必要である。最近の研究は、これらの大きなタンパク質複合体が、レスピラソームおよびシンセサム1,2と呼ばれるスーパーコンプレックスに組織化されていることを示している。これらの大規模な複合体およびスーパーコンプレックスのアセンブリ、ダイナミクス、およびアクティビティの規制を分析することは困難です。分光光度計を用いて実施された酸素電極および酵素アッセイを用いた酸素消費測定はETC複合体活性に関する貴重な情報を与えることができるが、これらのアッセイはタンパク質複合体または関連するスーパーコンプレックスの存在、サイズおよびサブユニット組成に関する情報を提供することができない。しかし、青色で透明なネイティブ（BNおよびCN）PAGE 3は、複雑な組成およびアセンブリ/分解に関する重要な情報、ならびに生理学的および病理学的条件下でのこれらの生命を脅かす呼吸器複合体の超分子構成の動的調節に関する強力なツールを創出した4 。

これらの複合体を高次スーパーコンプレックスに集合させることは、ミトコンドリア構造および機能を調節するようである5 。例えば、レスピアソームアセンブリは、電子伝達の効率およびミトコンドリア内膜5にわたるプロトン原動力の生成を増加させる。さらに、シンサソームの集合体は、ATP産生の効率および細胞質2へのエネルギー等価物の移動を増加させるだけでなく、ミトコンドリア内膜を管状クリステイ6 、/ u> 7 。マウス胚における心臓発達中のスーパーコンプレックス集合体の研究は、心臓におけるCx-1含有スーパーコンプレックスの発生が、およそ胚の13。 8日に始まることを示している。他は、Cx-I含有スーパーコンプレックスの量が、老化または虚血/再かん流傷害のために心臓において減少すること、 9,10 、または神経変性疾患の進行に役割を果たす可能性があることを示している11 。

このプロトコールは、ETC複合体およびスーパーコンプレックスのアセンブリおよび活性を調べるために用いることができる天然のゲルPAGEのための方法を記載する。ミトコンドリアのスーパーコンプレックスのおおよその分子量は、CNまたはBNポリアクリルアミドゲル中のタンパク質複合体を分離することによって評価することができる。 CN PAGEはまた、ゲル中で直接的に全てのミトコンドリア複合体の酵素活性の可視化を可能にする（in-gelアッセイ;IGA） 12 。この研究は、IGAを介してNADHを酸化するCx-Iの能力およびIGAによるCx-VのATP加水分解活性に起因するシンサソームの存在を強調することによって、呼吸器の活性を実証している。 Cx-IおよびCx-Vを含む複数の複合体およびスーパー複合体はまた、タンパク質をニトロセルロース膜上に移し、イムノブロッティングを行うことによって実証することができる。このアプローチの利点は、BNまたはCN PAGEが一般に、それらの生理学的サイズおよび組成に基づいてタンパク質複合体を分離することである。膜への移動はこのバンドのパターンを保持する。 BNまたはCN PAGEにおけるタンパク質複合体の分析は、2D-PAGE（デモンストレーションのためにFiala ら 13参照）またはショ糖密度遠心分離14,15を用いて行うこともできる。特定のバンドをさらに分析するために、それをBN PAGEから切り出すことができ、このタンパク質複合体からのタンパク質を精製することができるそれらを自然条件下で電気溶出することにより、ネイティブの電気溶出は数時間以内に行うことができ、ゲルから周囲のバッファーへのタンパク質の受動拡散（参考文献16で使用されているような）に有意差を生じさせる可能性がある。

要約すると、これらの方法は、ミトコンドリア膜からの高分子量スーパーコンプレックスのさらなる特徴付けを可能にするいくつかのアプローチを記載する。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての実験は、C57BL / 6Nマウス（野生型）の心臓を用いて行った。マウスを頚部脱臼の前にCO 2で麻酔し、すべての処置を、ロチェスター大学の実験動物学部に厳密に準拠し、州法、連邦法、およびNIH方針に従って実施した。このプロトコールは、ロチェスター大学（動物資源学会）の機関動物管理および使用委員会によって承認された。

1. CNおよびBNページ

注：BNおよびCN PAGEに使用されるすべての機器には、洗剤が含まれていないことが必要です。これを確実にするために、全ての装置を0.1M塩酸で洗浄した後、脱イオンH 2 Oで広範囲にすすいだ。

  1. 準備
    1. 4℃で25 mMイミダゾール（pH 7.0）からなる陽極バッファーを調製する。 4℃で保存する。
    2. CNまたはBN PAGE用の陰極バッファーを準備する。
      1. CN PAGEには、7.5 mMイミダゾールと50 mMトリシンを使用します。 1リットルの緩衝液あたり0.5gのデオキシコール酸ナトリウムおよび0.2gのラウリルマルトシドを加える。 4℃でpHを7.0に調整し、4℃で保存する。
      2. BN PAGEの場合、7.5 mMイミダゾールと50 mMトリシンを使用し、4℃でpHを7.0に調整します。 4℃で保存する。
      3. 薄青色のBN陰極バッファーには、7.5 mMイミダゾールと50 mMトリシンを使用します。 4℃でpHを7.0に調整し、バッファー1リットルあたり20mgのクマシーを加える。 4℃で保存する。
    3. 50mM NaCl、50mMイミダゾール、2mMアミノカプロン酸、および1mM EDTAを含む抽出緩衝液（EB）を調製する。 4℃でpHを7.0に調整し、4℃で保存する。
    4. 75mMイミダゾールおよび1.5Mアミノカプロン酸を用いて3倍のゲル緩衝液（BNおよびCNゲルに使用）を調製する。 4℃でpHを7.0に調整し、4℃で保存する。
    5. Ponceau S 0.01g、グリセロール5g、H 2 O 5mLのローディングバッファー（LB）を調製する。温度。
    6. 1mLの500mM 6-アミノヘキサン酸に50mgのクマシーを添加してクーマシーブルーを調製する。 4℃でpHを7.0に調整し、4℃で保存する。
    7. H 2 O中に20 mMおよび200 mMラウリルマルトシドを調製する。200μLのアリコートを調製し、それらを冷凍保存する。使用前に洗剤を解凍する。
3％〜8％（ミニ） 4％〜10％（マキシ）
0.5ゲル（軽量） 0.5ゲル（重） 0.5ゲル（軽量） 0.5ゲル（重）
AAB（mL） 0.42 1.3 2.5 7.7
CN / BN緩衝液（mL） 1.6 1.6 8.5 8.5
H 2 O（mL） 2.7 1.4 14 6.3
グリセロール（g） 0 0.47 0 2.5
容量（mL） 4.72 4.77 25 25
APS（μL） 27 27 65 65
TEMED（μL） 4 4 10 10

表1：Mini-MaxiまたはMaxi-PAGEを1回注ぐのに必要な成分の量。この表で使用される体積は、1最小または1マキシゲル、厚さ1.5mmについて計算される。 AABの容量は、40％ストック溶液に基づく。軽くて重いものは集中者を指すAABのイオン。勾配混合機の各カラムにAAB溶液を充填した後にAPSおよびTEMEDを添加する。

  1. ゲルの注入および注入
    注：CNまたはBNゲルにはそれぞれ3-8％または4-10％アクリルアミド/ビスアクリルアミド（AAB）勾配を使用してください。 表1は、ミニゲル（85mm幅×73mm高さ×1.5mm厚）またはマキシ - ゲル（160mm）に使用される緩衝液、AAB、H 2 O、グリセロール、過硫酸アンモニウム（APS）およびテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）幅200mm×高さ1.5mm）。 CNまたはBNゲルを用いたガラスプレートのアセンブリは、数mLの1×ゲルバッファーで袋に入れて冷蔵保存したり、保存用に1×ゲルバッファーで湿らせたペーパータオルで包んだりできます。ゲルは、1週間まで使用すると安定しています。
    1. ゲルを注ぐために、勾配混合機を上昇した攪拌プレート上に置き、ゲルが重力によって調製されたゲルチャンバーに流れるようにします。
    2. グラジエントミキサーの流出チャンバーに4.77 / 25 mL（ミニ/マキシ）（AABの濃度がより高い）。
    3. 重いチャンバーと軽いチャンバーの間のストップコックの接続を静かに開き、溶液の一滴が反対側に流れるようにします。
      注：これにより、接続チューブとストップコックから気泡が押し出され、2つのチャンバ間の流れが防止されます。これは、両側がすでに満たされている場合には実行できません。等しい圧力がバブルの移動を妨げるからです。
    4. グラジエントミキサーのもう一方のチャンバーに軽溶液の4.72 / 25 mL（ミニ/マキシ）を充填する。
    5. 重い溶液で流出チャンバに攪拌棒を置き、攪拌を開始する。バブリングを起こさない撹拌棒の速度を使用してください。
    6. APSとTEMEDを各チャンバーにすばやく加えて重合を開始します。
    7. 勾配ミキサーの2つのチャンバーの間の接続を開き、流出チャンバーを開けてゲルを注ぐ前に数秒間混合を可能にする。
      ノート：重力両方のチャンバーを均等に排水し、重溶液中への光の混合は、アクリルアミド濃度をゲルの底部から頂部までゆっくりと減少させる。グラジェントミキサー内のコンテンツ全体を使用してゲルを注ぎます。
      1. 最後に、泡と層の混合を避けるために、ウェルをゲルの中に入れて慎重に櫛を取り付けます。
    8. 直ちに、グラジエントミキサーをエタノールで洗浄してゲルをすすいでください。水ですすぎ、第2のゲルを注ぐ。ゲルを重合させる（通常、ミニゲルには20分未満が必要）。
    9. ゲルを動かすには、それらを電極アセンブリクランプに取り付け、中央/上部チャンバをCNまたはライトブルーのBNカソードバッファーで満たす。アウター/下部チャンバーにアノードバッファーを加える前に、漏れをチェックするのを数分間待ちます。
      1. 静かにウェルの櫛を引き出し、シリンジまたはピペットを用いて陰極バッファーでウェルを洗浄する。
      2. 寒い部屋（4℃）でゲルを走らせたり、氷上で完全に詰めてください。
        1. CNミニページの場合、最初の1時間は100V、終了するまでは200Vを使用します。通常はさらに1〜1.5時間です。あるいは、CNミニページを30〜40Vで一晩実行してください。
          注：ここでは高分子量タンパク質複合体に焦点を当てているため、分子量が140 kDa未満のタンパク質複合体はゲルから使い果たされます。低分子複合体を保持するために、より短い電気泳動時間を使用することができる。
        2. BN maxi-PAGEについては、100Vを使用し、一晩（約18時間）ゲルを流す。
          注記：電流は非常に低く（<15 mA）、これらの条件に対応できる電源が必要です。この時点で、ゲルはIGAまたはイムノブロッティングに使用することができます。いくつかの場合、バンドまたはレーンは、電気溶出のためのガラスプレート上のカミソリの刃を用いてゲルから切り取ることができる。
  2. サンプル調製
    注：膜結合ミトコンドリアのスーパーコンプレックスは、内部ミトコンドリア膜。ミトコンドリアのスーパー複合体を保存するには、新しく単離したミトコンドリアまたは凍結および解凍したサンプルを1回だけ使用する。下記の計算/容量は、ミニゲル（1.5mm厚ゲルの10ウェルコームのウェルは35〜40μLを保持する）およびマキシゲル（15ウェルコームのウェルは200μL）。さらに、ローディングコントロールとして、電圧依存性陰イオンチャンネル（VDAC）の検出のために変性SDSゲル上で実行するために、各試料のアリコート（通常は10μL）を保存します。
    1. 単離されたミトコンドリアまたは組織ホモジネートの適切な量（ 例えば、ミニゲル用のタンパク質10〜50μgおよびマキシゲル用の50〜200μg）をマイクロチューブに入れ、4℃で10〜15分間17,000xgで遠心分離する。
      注：この手順は、可溶性ミトコンドリアのマトリックスおよび/またはサイトゾルタンパク質のいくつかを除去する。
    2. 吸引し、上清を捨て、所望の量に抽出緩衝液を加えるゲルに負荷する。静かに氷の上に沈殿物を再懸濁する。必要に応じて、この時点で一般的なプロテアーゼ阻害剤混合物を添加する。
      注記：ここで使用した装置に基づいて、ミニゲルには30μL、マキシゲルには100μLを使用し、タンパク質/バッファー比を1μLのバッファーに対して2μg以下に制限した。
    3. 界面活性剤（ 例えば、 2μgのラウリルマルトシド/1μgのタンパク質;詳細は、代表的な結果と考察を参照）を加えてください。
      注：一般にラウリルマルトシドが使用されますが、ジギトニンも使用できます。
    4. 氷上で20分間インキュベートする。インキュベーション中に、チューブを粉砕および/または撹拌することによって、初めおよび時々静かに混合する。
    5. 4℃で10分間、17,000×gで遠心分離して、膜および組織断片を除去する。
    6. 上清を新しいチューブに移す。 CNサンプルの場合は、10μLのサンプル量ごとに1μLのLBを加えます。サンプルの総量はappでなければなりませんミニゲルについては約40μL、マキシゲルについては130μLである。 BNサンプルの場合、色素と洗剤の比率が1：4（w / w）になるようにサンプルにクマシーを加えます。
    7. サンプルの30μLと120μLをそれぞれミニゲルまたはマキシゲルのウェルにロードする。ローディングコントロールとしてVDACを検出するために、変性SDSゲルの各サンプルから残りの10μLを使用してください。
    8. 分子量マーカーを調製するには、60μLのBN / CNゲルバッファーに高分子量較正ミックス（詳細については表を参照）の1バイアルを溶解し、120μLのH 2 Oおよび20μLのポンド。 1レーンあたり15μLをロードする。
    9. ステップ1.2.9.2で概説したようにゲルを流してください。

2. Cx-IおよびCx-Vのインゲルアッセイ

注：アッセイは室温で行います。ドキュメンテーションのために、開発中のバンドの写真、スキャン、または画像を撮影する。 （重要）タンパク質は一切転載できませんo IGA完成後のニトロセルロース膜。

  1. Cx-1アッセイ
    1. 準備。
      1. pH 7.4のH 2 O中の5mM Trisのアッセイ緩​​衝液を調製する;室温で保管してください。
      2. 10mgのNADHを1mLのアッセイ緩​​衝液に溶解する。使用するまで-20℃で100μLのアリコートで保存してください。凍結や解凍を避ける。
      3. マイクロチューブに25mgのNitroblueテトラゾリウムを秤量する。
      4. 95mLのH 2 O中に5mLの酢酸を希釈することにより固定剤を調製する;室温で保管してください。
    2. アッセイを行う。
      1. 10mgのアッセイ緩​​衝液を25mgのNitroblueテトラゾリウム（最終濃度：2.5mg / mL）および100μLの10mg / mL NADH（0.1mg / mL）と合わせる。これをゲル、レーン、またはCNゲルから切除された関心領域全体に加える。
        注：これは、透明なプラスチック容器またはガラス容器で行うことができます。このアッセイはBN PAGE後に行うことはできませんのでご注意ください。
      2. 穏やかな攪拌（ロッカー）の後、> 3分間、青いバンドの展開に従ってください。
      3. 10〜20 mLの酢酸溶液にゲルを固定するか、5 mM Tris、pH 7.4で洗浄して反応を停止させます。ドキュメンテーションのための写真を撮る（表の表を参照）。
  2. Cx-Vアッセイ
    注：Cx-Vアッセイは、Cx-V非依存性活性を示すために5μg/ mLオリゴマイシン（Cx-Vインヒビター）とともにインキュベートした2本のCNまたはBNゲルを使用して行う必要があります。
    1. 準備。
      1. 35mMトリスおよび270mMグリシンを含むアッセイ緩​​衝液を調製する;室温でpHを8.3に調整する。バッファーを50 mLのアリコートで凍結保存しますが、凍結および解凍後にpHを確認してください。
      2. H 2 O中1M MgSO 4を調製する;使用するまで4℃で保存してください。
      3. 27.28mgのPb（NO 3 ） 2をマイクロチューブに秤量する。
      4. マイクロチューブに60mgのATPを秤量する。
      5. 1mgのoを溶解する。リゴマイシンを1mLのエタノールに溶解した。使用するまで-20℃で保存してください。
      6. 50mLのメタノールを50mLのH 2 Oと混合することにより固定剤を調製する;室温で保管してください。
    2. アッセイを行う。
      1. BNまたはCNゲルからゲル、レーンまたは関心のある領域を10-20 mLのアッセイバッファ±5μg/ mLのオリゴマイシン（1 mg / mLの50-100μL）中で穏やかに攪拌（ロッカー）しながら2時間インキュベートする。 mL）を室温で加えた。
      2. インキュベーション後、緩衝液を14mLの新鮮なアッセイ緩​​衝液で置換し、190μLの1M MgSO 4 （14mM）、27.28mgのPb（NO 3 ） 2 （5mM）、60mgのATP 8 mM）および75μLのオリゴマイシン（必要な場合）を含む。
      3. オリゴマイシン処理されたゲル上のバンドがCx-Vに依存しないバンドを与えるので、穏やかな攪拌（ロッカー）でインキュベートし、白色沈殿物を観察する。
        注：沈殿物の外観は数時間かかることがあります。
      4. ゲルをメタノール -酸性溶液が鉛の沈殿物を溶解するため、メタノールベースの固定剤（ 例えば、 50％メタノール）を使用する。結果を写真にする。
        注：鉛の沈殿物は、ゲルのクマシー染色を妨げません。

3.ニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜へのタンパク質移動

  1. 25mM Trisおよび200mMグリシンのトランスファーバッファーを調製する。 pHを8.3に調整し、0.0005g / L SDSおよび200mL / Lメタノールを加える。室温で保管する。
    1. カミソリの刃またははさみで、ニトロセルロースまたはPVDF膜（孔径0.45μm）をゲルのサイズよりわずかに大きいサイズに切断する。
      注：ニトロセルロースメンブレンはPonceau S染色でタンパク質の負荷を評価し、PVDFメンブレンではより明確に定義されたバンドが得られます。
  2. プロトコル。
    1. ニトロセルロース膜、濾紙、およびスポンジを浸して転送バッファーで少なくとも10分。 PVDF膜を100％メタノール中に15秒間置くか、またはそれを移送緩衝液中に置く前に製造業者の推奨に従って。トランスファーキットのオープンカセットをトランスファーバッファー付きの平らなボウルに入れます。
    2. カセットの裏側にスポンジと濾紙の1-2層を置きます。気泡を取り除く。
    3. ゲルを濾紙上に置く。ゲルおよび/または膜の角を切り取ることによってゲルの配向を示す。
    4. 膜をゲルの上に置きます。すべての泡を取り除く。
    5. ろ紙とスポンジを膜の上に置きます。このサンドイッチのすべての泡を取り除く。
    6. カセットを閉じて、トランスファーキットのカセットホルダーに入れます。
    7. タンパク質を25Vで約12〜18時間移す。

4.イムノブロッティング

  1. 準備。
    1. Ponceau Stain（500 mL）に25 mLの酢酸と0.5gのポンソーSと475mLのH 2 O;室温で保管してください（再使用可能）。
    2. 200mM NaCl、25mM Tris-Base、および2.7mM KClを含むトリス緩衝食塩水（TBS）を調製する。 pHを8.0に調整し、室温で保存する。
    3. TBSに0.5mL / L Tween 20を加えてTBS-トウィーン（TBST）を調製する。室温で保管してください。
    4. 乳固形分5gをTBST 100mLに溶解して乳固形分/ TBSTを調製する。 4℃で保存し、3日以内に使用してください。
    5. 3gのウシ血清アルブミン（BSA、画分V）を100mLのTBSTに溶解してBSA / TBSTを調製する。 4℃で保存し、3日以内に使用してください。
  2. プロトコル。
    1. トランスファーが終了したら、膜をPonceau S溶液に入れて、転写されたすべてのタンパク質を可視化します。膜上のマーカーの位置を鉛筆で標識し、Ponceau-S染色された膜を写真またはスキャンによって記録する。
    2. 膜を各10分間3回洗浄する。静かに攪拌しながらTBSで洗浄した。
    3. メンブレンをミルク固体/ TBSTで室温で1〜2時間、または穏やかに攪拌しながら冷室内で一晩ブロックする。
    4. 穏やかに攪拌しながらTBSTで膜を10分間洗浄する。
    5. 穏やかに攪拌しながら低温室で一晩抗体と一晩インキュベートする。 BSA / TBST中で抗体（ 例えば、抗ATP5Aおよび-NDUFB6について1：1,000）を希釈する。
      注：ほとんどの抗体は、一晩インキュベートすると、ネイティブゲルからの膜でより良いシグナルを与えます。
    6. 穏やかに攪拌しながらTBSTで膜を10分間洗浄する。
    7. 静かに撹拌しながら室温で少なくとも60分間、二次抗体とインキュベートする。乳固形分/ TBSTで抗体（1：5,000〜1：50,000）を希釈する。
    8. 穏やかに撹拌しながらTBSTで室温で10分間膜を3回洗浄する。
    9. 最後の洗浄の間、マンファの指示に従って増強化学発光（ECL）基質を調製するcturer。
    10. 製造元の指示に従ってECL基質とメンブレンをインキュベートする。
    11. ECL基板の製造元が提供する指示を使用して、フィルム上の信号を検出します。

5.電気溶出

  1. 準備。
    1. 25mMトリシン、3.75mMイミダゾール（4℃でpH7.0）、および5mM 6-アミノヘキサン酸の溶出緩衝液を調製する。
      注：電気プロテクターとメンブレンキャップを取り扱っている間は、常に手袋を着用して外部タンパク質の混入を防ぎます。
  2. 電気溶流器を使用してから電気分解を行う日の前に、次の手順を実行します。
    1. 60℃で1時間溶出バッファーにメンブレンキャップ（カットオフ：3.5kDa）を浸します。新しい溶出バッファーにキャップを移し、冷蔵庫に12時間以上浸します。
      注：3.5kDaのカットオフ分子量は、小さなp関心対象のタンパク質複合体から容易に解離する可能性のあるロイテリン。
    2. 電気溶出モジュール、ガラス管、タンク、および蓋をエタノールで完全に洗浄する。水ですすぎ、機器を乾燥させます。
  3. ネイティブの電気溶出の日に、次の操作を行います。
    1. 使用する各ガラス管の底にフリットを置く。必要に応じて、ガラスチューブを溶出バッファーに入れ、フリットをチューブの内側から下方に押します。
    2. フリットの付いたガラス管を電気外科用モジュールのモジュールに押し込みます。グロメットを溶出バッファーで濡らし、ガラスチューブを所定の位置にスライドさせます。ガラス管の上部がグロメットで均等になっていることを確認してください。
    3. 空のグロメットをストッパーで閉じます。
    4. シリコーンアダプターの底に濡れた膜キャップを置き、溶出バッファーでアダプターを満たしてください。アダプターのバッファーをゆっくりとピペットで上下に動かし、透析膜の周囲の気泡を取り除きます。
    5. バッファ充填アダプターをガラス管の底にスライドさせます。ガラス管の内側にあるフリットに現れる気泡をすべて取り除いてください。
    6. 各ガラス管に溶出バッファーを充填する。
    7. BN PAGEの切り取られたバンドをガラス管に入れる（ステップ1.2.9.3参照）。大きな断片を小さな断片に分ける。ガラス管内の充填高さが約1 cmであることを確認します。
    8. モジュール全体をタンクに入れます。
    9. 約600mLの冷溶出用緩衝液をタンクに加える。透析膜の泡を防ぐために、シリコンアダプターのキャップがバッファーに入っていることを確認してください。
    10. タンクの底に撹拌バーを置きます。
      注：攪拌は、泡が透析膜の底にくっつかないようにします。
    11. 冷たい部屋でタンパク質を350Vで4時間溶出する。
    12. 溶出が完了したら、バッファタンクからエレクトロルーターモジュールを取り出し、シンクまたはボウルに入れます。
    13. ストッパーを使用した場合は、ストッパーを取り外して上部バッファーチャンバー内に配置される。それ以外の場合は、大きなピペットを使用してバッファーを取り外します。
    14. 各ガラス管から緩衝液を取り出し、廃棄する。シリコーンアダプターが所定の位置に留まり、フリットの下の液体が乱されたり動揺していないことを確認してください。
    15. ガラスチューブの底面からメンブレンキャップとともにシリコンアダプターを慎重に取り外します。シリコンキャップの内容物（約400μL）をマイクロチューブにピペットで移す。別の200μLの溶出緩衝液で、シリコンキャップをすすぎ、マイクロチューブに加える。すべてのガラス管について同じ手順を繰り返します。
    16. メンブレンキャップは再使用することができるので、0.5mg / mLのアジ化ナトリウムを含む溶出バッファーに入れてメンブレンキャップを保存してください。冷やす。
      注意：溶出液はタンパク質濃度が低く、遠心フィルター装置を使用して濃縮することができます。

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結果

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ミトコンドリアのスーパーコンプレックスを視覚化するために、マウスから新たに単離したミトコンドリアを使用した（ 17,18 ） 。ミトコンドリアのスーパーコンプレックスは、凍結融解の繰り返しサイクルに敏感であり、崩壊に至るが、これは一部の研究者にとって許容されるかもしれない。保存に凍結が必要な場合は、最良の結果を得るために、サンプルを凍結および融解のサイクルを2回以上行うべきではありません。

ミトコンドリアETC複合体をBN PAGEで可視化するために、単離された心臓ミトコンドリア由来のタンパク質100μgを4〜10％ゲルに負荷した（ 図1A ）。ローディングおよびカソード緩衝液中のクマシー染色は、実行中にタンパク質複合体を標識するのに十分である。スーパーコンプレックスは、コントラストをデジタル的に増加させた後に現れる（図示せ...

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ディスカッション

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機能的ETCは、ミトコンドリアATP生成に必要である。 ETCの複合体は、respirasomes（Cx-1、-III、-IV） 1とシンターソーム（Cx-V） 2の2種類のスーパーコンプレックスを形成することができます。 ETCをスーパーコンプレックスに編成することは、ETC全体の効率を向上させると考えられている5,22。これらのスーパーコンプレックスがどのように組み立てられ分解されるかはよく分かっていませんが、ここに提示されているプロトコールはこれらのプロセスをよりよく理解できるようにするかもしれません。

ETCアセンブリを研究することの主要な課題は、これらのタンパク質複合体のサイズである。例えば、ミトコンドリア呼吸器は、Cx-1（約880kDa）およびCx-III（460kDa）およびCx-IV（200kDa、二量体として活性）の1つ以上の分子から成り、その結果、分子とのスーパーコンプレックス約重さ2,000 kDa。さらに、Cx-Vは約600kDaの分子量を有するが、二量体、四...

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開示事項

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著者は何も開示することはない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、米国心臓協会創設者のアフィリエイト[12GRNT12060233]およびロチェスター大学の強力な児童研究センターからの助成金によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Protean IIミニゲルチャンバーBiorad1658004ミニゲル電気泳動を注いで実行するためのコンプリートセット
Protean XLマキシゲルBiorad1653189マキシゲル電気泳動を注いで実行するためのコンプリートセット
グラジエントメーカー、Hoefer SG15VWR95044-704ミニゲルグラジエントを注ぐ
グラジエントメーカー、マキシゲルVWRGM-100マキシゲルを注ぐグラジエント
トランスファーキットバイオラッド1703930膜へのタンパク質の湿式転写のためのコンプリートセット
エレクトロリューターモデル422バイオラッド1652976ネイティブまたはSDSページからのタンパク質の電気溶出
ガラスプレートバイオラッド1653308ショートプレート
ガラスプレートバイオラド1653312スペーサープレート
ガラスプレートBiorad1651823インナープレート
ガラスプレートBiorad1651824アウタープレート
電源Biorad1645070ネイティブ電気泳動に適した電源
ECL-Western Thermo Scientific32209Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West DuraThermo Scientific34075Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography filmGE Health care28906845Documentation of Western blots
Film processor CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640 CanonNAゲル、メンブレン、ブロットを記録するための写真撮影。
Canon Power Shot 640 カメラフード キヤノンライトテーブルでの撮影用遮蔽カメラ
アクリルアミド/ビサクリルアミドBiorad1610148 40% プレミックス溶液
GlycineSigmaG7403
SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)Invitrogen15525-017
Tris-baseSigmaT1503Buffer
TricineSigmaT0377
デオキシキレートナトリウムシグマD66750洗剤
EDTAシグマE5134
糖シグマS9378
MOPSシグマM1254バッファー
イミダゾールシグマI15513ラ
ウリルマルトシドシグマD4641洗剤
Coomassie G250Biorad161-0406
アミノヘキサン酸ΣO7260
Native  分子量キットGE Health care 17-0445-01ネイティブ電気泳動用の高分子量校正キット。
名前会社カタログ番号コメント
strong>NADHSigmaN4505
ニトロブルー テトラゾリウムΣ N6639
トリス HClΣT3253
ATP  シグマA2383
名前会社カタログ番号コメント
Lead(II)硝酸塩(Pb(NO3)2):Sigma228621
オリゴマイシンシグマO4876
名前<strong>会社カタログ番号コメント
Ponceau SSigmaP3504
anti-ATP5AAbcamab14748ATP合成酵素サブユニットATP5A
に対する抗体 anti-NDUFB6Abcamab110244Cx-1サブユニットNDUFB6
anti-VDACカルバイオケム529534 VDAC
に対する抗体 ECL HRPリンク抗体GE Health CareNA931VATP5A、NDUFB6、VDACに対する二次抗体
試薬Biorad170-6404
BSA
塩化ナトリウムSigmaS9888
塩化カリウムSigmaP9541
EGTASigmaE3889
名称企業名カタログ番号コメント
銀染色キットInvitrogenLC6070
製ショバッファー抗体 ブロッキング

参考文献

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