ビオチン化細胞表面タンパク質の精製 Rhipicephalus microplus上皮腸細胞

サマリー

Rhipicephalus microplus腸組織から上皮細胞を単離するために、改変密度遠心分離勾配に基づく方法論を利用した。表面結合タンパク質をビオチン化し、下流の用途に利用するためにストレプトアビジン磁気ビーズで精製した。

要約

Rhipicephalus microplus - 家畜ダニ - いくつかの病原体のベクターとしての家畜への経済的影響の観点から、最も重要な外部寄生生物である。ダニ腸管上皮細胞の表面上に位置するBM86などのワクチン候補の発見に焦点を当てて、その有害な影響を減少させるための牛ダニ制御に努力が払われてきた。現在の研究は、他のワクチン候補をスクリーニングするために、cDNAおよびゲノムライブラリーの利用に焦点を当てている。ダニ腸細胞の単離は、ダニ腸細胞膜上の表面タンパク質の組成を調べる上で重要な利点を構成する。この論文は、半エンボスされたR. microplusのダニの腸内容物から、上皮細胞を単離するための新規かつ実行可能な方法を構成する。このプロトコルは、上皮細胞を上皮支持組織から放出させるためにTCEPおよびEDTAを使用し、不連続密度遠心分離グラジエント他の細胞型から上皮細胞を分離することができる。 FACSまたはLC-MS / MS分析での下流の適用を可能にするストレプトアビジン結合磁気ビーズを用いて、細胞表面タンパク質をビオチン化し、ダニ消化管上皮細胞から単離した。

概要

それはウシダニ熱（バベシア症）、アナプラズマおよびウマピロプラズマ病^{1、2、3、4を}ベクターとして牛がダニリピセファルスmicroplusは 、熱帯及び亜熱帯地域の家畜産業上の経済的影響の点で最も重要な外部寄生虫です。化学殺ダニ剤の使用のような従来の方法は、ミルクおよび肉の化学的残留物の存在、化学的に耐性のあるマダニの有病率の増加などの暗黙の欠点を有するが、有害作用を減少させるために、ウシのダニ防除に努力が払われてきた^5、6、7。その結果、耐性牛、生物学的防除（バイオ農薬）およびワクチンの使用など、ダニ防除の代替法の開発が研究されているINES ^{4、5、6、7、8、9。}

ワクチン候補として利用できるタンパク質の追求において、現在の研究はダニの腸に焦点が当てられている。中腸壁は、基底板の外側が筋肉のネットワークを形成しながら、薄い基底板上に載っている上皮細胞の単一層から構築される。光および電子顕微鏡観察は、中腸が予備細胞（未分化細胞）、分泌細胞および消化細胞の3つのタイプからなることを示している。細胞型の数は、生理学的相によってかなり異なる。分泌及び消化細胞は予備セル^18、19、20に由来両方。

cDNAライブラリーの構築ダニ腸の組成物は、潜在的なワクチン候補^2、3、4のように、そのようなBm86などの抗原性タンパク質の同定につながっている調べました。糖タンパク質Bm86はダニ腸細胞の表面に局在し、ワクチン接種された牛のウマダニ （ R. microplus ）に対する防御免疫応答を誘導する。免疫された宿主により産生された抗Bm86 IgGは、ダニによって摂取され、ダニ腸細胞の表面上でこの抗原を認識し、その後ダニ腸組織の機能および完全性を妨げる。 Bm86抗原に基づくワクチンは、萌芽雌の数、体重および生殖能力を低下させることにより、 R. microplusおよびRhipicephalus annulatusの効果的な防除を示し、その後のダニ世代において幼虫の蔓延を減少させる⁴ 。しかし、Bm86ベースのワクチンはすべてのティックステージに対して有効ではなく、R.のmicroplusのいくつかの地理的な株に対する不満足な有効性を示し、その結果、牛肉及び酪農産業が乏しいこれらのワクチン^2,4を採用しています。

ダニの腸から上皮細胞を単離する能力は、異なる環境条件下での形態学および生理学を含むタンパク質膜組成を決定する研究の進行を可能にする重要な革新である。本明細書に記載の方法は、キレート剤エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および還元剤トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を利用して、その上皮支持組織¹⁰から上皮を放出させる。上皮は、振盪による組織の機械的破壊、続いてPercollにおける不連続勾配遠心分離の後に回収される。本稿では、ダニ腸内分泌腺の単離のための実現可能かつ新規な技術について述べる。真菌細胞。これらの上皮細胞の表面から単離されたビオチン化細胞表面タンパク質は、その後、FACSおよび/またはLC-MS / MS分析などの下流の用途で分析され得る。

プロトコル

1. R. microplusからのGut上皮の解剖

1. 実験の日に牛の半虫歯のダニを集める。宿主から取り出した後24時間以内にダニを解剖する。
2. 92 mm×16 mmのペトリ皿の底にダクトテープのストリップを貼り付けます。スーパーグルーをテープに追加してください。ティックを腹側をスーパーグルーの上に置き、2分間乾燥させる。
3. 100mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）をペトリ皿に注ぎ、またはダニが完全に沈むまで。
4. サイズ11のメスを使用して、目の上から下の祝祭に、ダニの両側を切ります。
5. 滅菌鉗子を使用して、完全に内部の器官を公開するために、 傷跡とalloscutumを削除します。
6. 汚染を防ぐために、細かい白い糸状の器官（気管）および他の膜を除去する。
7. 鉗子を使用して腸を取り除き、上部領域をつまみ、カーカス。他の組織が解剖されていないことを確認して、残りの腸組織を除去する。
8. 塩化カルシウムおよび硫酸マグネシウムを含まない氷冷ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）にプロテアーゼ阻害剤カクテル（PIC）を入れて腸管を保管する。ガットをドライアイスで凍らせ、-20℃で保存する。
   注：腸内臓の切開および内臓器官の詳細を補助するために、D. Sonenshineの第3.1章、「生物学の目録」 ^{19を参照のこと} 。

2.上皮細胞の解離

1. 解剖した腸を50 mLチューブの中の70μmセルストレーナーに注ぎます。
2. 溶液が透明になるまで腸組織をPICで50mLの氷冷HBSSで洗い流し、腸が白く/澄んだ外観になるようにする。
3. PICを含む30 mLの氷冷HBSS中で腸を再懸濁し、穏やかに混合し、4℃で500 xgで10分間遠心して腸をペレット化する。上清を除去し、洗浄プロセスを3回繰り返す。
4. 懸濁液を250μmの細胞ストレーナでろ過し、フロースルーをボルテックスし、70μmの細胞ストレーナに通して残りのフロースルーを集める。
5. 懸濁液を4℃で500 xgで20分間遠心分離して、単一細胞をペレット化する。

密度遠心分離勾配を用いた単一上皮細胞の単離

1. AP15プレフィルターペーパーでろ過することにより、密度遠心分離勾配（ 例えば 、Percoll）を調製する。 mqH ₂ 0（v / v）中の40％および20％パーコールを調製し、4℃で1時間冷却してから、勾配を層状にする。
2. 蠕動の使用ポンプを最低速度でセットし、層3mLの40％密度遠心分離勾配を16mL超遠心管に入れ、氷上で15分間静置する。ポンプの速度は、1分あたり1mL未満の流速につながるはずです。
3. チューブを45°の角度に傾け、蠕動ポンプを使用して40％層の上に20％密度の遠心分離勾配を層状にする。ポンプの速度は1分あたり1mL以下の流量になるはずです。層を氷上で15分間静置する。
4. 蠕動ポンプを流速1mL以下で使用して、20-40％密度遠心分離勾配上にダニ腸細胞を含むDMEM培地3mLを層状にする。
5. 最大加速と最小減速のために遠心機をプログラムします。 600×gで10分間遠心分離する。 DMEM：20％密度遠心分離勾配と20％：40％密度遠心分離勾配との間の中間相を収集し、上皮単細胞を単離する。その後の分析のために収集した中間相を4℃で保存する。

4.細胞単離の評価

1. 血球計算盤
   1. 赤血球計スライドをアルコールできれいにする。
   2. 細胞を静かに上下にピペッティングして細胞を再懸濁する。 100μLの細胞懸濁液をピペットし、1.5mLのマイクロ遠心チューブに入れる。
   3. 400μLの0.4％トリパンブルーを加える。チューブを軽く叩いて軽く混ぜる。
   4. トリパンブルー処理した細胞懸濁液100μLをピペットして、血球計の両室をゆっくりと満たす。
   5. 10倍の対物レンズを備えた血球計のグリッドラインに焦点を当て、光学顕微鏡下に血球計を置く。
   6. ハンドヘルドタリーカウンターを使用して、16個の正方形のセット内の生きていない染色されていない細胞を数えます。同じ広場内で、青色の死んだ細胞を数えます。 16個の四角形の4つのセットがカウントされるまでカウントを続けます。
   7. 次の式を使用して、mLあたりの総細胞数を計算します。
      47eq1.jpg "/>
   8. 次の式を使用して、細胞の生存率を計算します。
      
2. 細胞分離の可視化
   1. 単離した細胞1μLをHBSS 9μLに1.5 mLのマイクロ遠心チューブで希釈します。微量遠心チューブを軽くたたいて混合します。
   2. スライドガラスの中央にHBSS中の単離された細胞5μLをピペットで加える。 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を用いて3滴のマウント媒体を塗布する。
   3. スライドを室温で5分間インキュベートする。気泡を避けて、慎重に準備の上にカバースリップを置きます。
   4. DAPIで染色した細胞を蛍光顕微鏡下で励起360nm、発光460nmで可視化する。

5.細胞表面タンパク質ビオチン化

1. ビオチン化ビオチン（タイプA）コンジュゲーションを用いた100μLの単細胞上皮細胞キットに、製造者の指示に従って、1：1の表面タンパク質とコンジュゲートのモル比
2. 細胞溶解のために、100μLのPBS、1％Triton X-100,10％グリセロール、100μM酸化型グルタチオンおよびPICをビオチン化細胞に加える。 10分ごとに穏やかに混合しながら、氷上で1時間インキュベートする。
3. ビオチン化細胞を20,000 xgで4℃で20分間遠心分離し、不溶性物質をペレットにします。細胞質およびビオチン化膜タンパク質を含む上清を集める。
4. Bradfordアッセイを用いてタンパク質濃度を決定する。

6.ビオチン化表面タンパク質の単離

1. 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに50μLのストレプトアビジン磁性ビーズを加えます。
2. チューブを磁気スタンドに入れ、ビーズをチューブの側面に集めます。上清を除去して捨てる。
3. 1000μLのTBS、0.1％Tween-20をチューブに添加する。静かに混ぜて、磁性スタンでビーズを集めるd。上清を除去して捨てる。
4. 40μgのビオチン化細胞表面タンパク質を、洗浄した磁気ビーズを含む1×PBS中で300μLに希釈する。撹拌しながら室温で2時間インキュベートする。
5. 磁気スタンドでビーズを回収し、上清を除去して捨てる。
6. チューブに300μLのTBS、0.1％Tween-20を加え、穏やかに混合してビーズを再懸濁する。ビーズを回収し、上清を除去し、廃棄する。この洗浄工程を2回繰り返す。
7. 100μLの0.1MグリシンpH2.0を磁気ビーズに添加し、室温で5分間インキュベートする。ビーズを回収し、溶出したビオチン化表面タンパク質を含む上清を除去する。
8. 4〜20％Tris-MOPS SDS-PAGEゲル上で分離した表面タンパク質を可視化する。

ビオチン化表面タンパク質の評価

1. ドットブロット
   1. ニトロセルロース膜の7cm×3cmのストリップを切断する。
   2. 合計10μgを適用するt含有量（上記1.8から）、および10μgのビオチン化表面タンパク質を膜に添加した。室温で15分間乾燥させる。
   3. 容器に移し、100mLのブロッキングバッファーに浸す。攪拌しながら室温で1時間インキュベートする。ブロッキングバッファーを破棄します。
   4. 攪拌しながら100μLのPBS、0.05％Tween-20中でニトロセルロース膜を5分間洗浄する。洗浄バッファーを捨て、洗浄を3回繰り返す。
   5. 100μLのPBS、0.05％Tween-20中の1/5000ストレプトアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を室温で2時間インキュベートし、残りの溶液を捨てる。
   6. ニトロセルロース膜を100μLのPBS、0.05％Tween-20中で5分間攪拌しながら洗浄する。洗浄バッファーを捨て、洗浄を3回繰り返す。
   7. 検出のために、4-クロロ-1-ナフトール1錠を10mLの氷冷メタノールに溶解する。メタノールストック4mLを20mLのTBSに加える。 10μLの新鮮な30％過酸化水素とイミドニトロセルロース膜に適用する。
   8. 基質が不溶性青色最終生成物を生成するまで、室温で攪拌しながらインキュベートする。これには2〜15分かかります。
   9. 検出溶液を捨て、膜を100μLのmqH ₂ Oで3回洗浄する。
2. ELISAアッセイ
   1. 200 ngの各サンプルを100 mM炭酸塩コーティングバッファー400μLで希釈し、ELISAプレート（平底ウェル）の最初の列（A＃）の2レーンをコートし、
   2. 列（BH）の他のすべての対応するウェルに100mM炭酸塩コーティングバッファー100μLを加えます。
   3. 行Aの各ウェルから100μLをピペッティングし、行Bに移すことによって、各サンプルの連続希釈物を調製する。ピペットで穏やかに混合し、泡を発生させない。行Hの各ウェルから最後の100μLを捨てて、各列の希釈を繰り返す。
   4. プレートをパラフィルムで覆い、4℃で一晩インキュベートする。
   5. 板を洗う200μLのPBS、0.05％Tween-20 /ウェルで3回洗浄した。
   6. コーティングしたウェルに200μLのブロッキングバッファーを加え、Parafilmで覆い、4℃で一晩インキュベートする。
   7. ブロッキング緩衝液中で1 / 15,000のストレプトアビジン-HRPを希釈し、100μLをプレートの各ウェルに加える。パラフィルムで覆い、4℃で一晩インキュベートする。
   8. ウェルあたり200μLのPBS、0.05％Tween-20でプレートを5回洗浄する。
   9. 検出するために、1ウェル当たり100μLのTMB試薬を加える。十分な発色の後、通常10〜15分の間に、100μLの1Mリン酸を加えて反応を停止させる。
   10. λ= 450nmで各ウェルの吸光度を読み取る。

結果

R. microplusの腸組織から上皮細胞を単離した（ 図1） 。 このプロトコールを用いて調製したダニ腸上皮細胞の代表的蛍光顕微鏡画像を図2Aに示す 2B。 セミエンゴールR.マイクロプラスで細胞単離を行うと、細胞は、特異的、球状、平滑な表面形態およびサンプル全体にわたって一貫したサイズとして現れる。腸の細胞集団のサイズとタイプの違いは、刻み目が充実した成人になると明らかになります。

単離された上皮細胞の核のDAPIによる蛍光染色は、細胞を視覚化するのを助ける。不十分な分離は、エピスの不完全な解離を含むように視覚化される変化する細胞サイ...

ディスカッション

蔓延をチェック牛が殺ダニ剤^1、4の使用に頼るコントロールの最も一般的な方法で、世界の熱帯・亜熱帯地域で家畜産業にとって大きな問題となります。 Bm86は、以前に起因するBm86地理的配列変異と通常は^4を昇圧する要件へのワクチン戦略として限られた成功を収め、R.のmicroplusの侵入に対する保護¹⁰抗原としてダニの腸上皮表面の中に同定されました。

上皮分離方法論に応じ焦点以前の刊行物は、主に、脊椎動物や昆虫種^{9、11、12、13、14}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.4% トリパンブルー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15250061
1.5 mL 微量遠心チューブ	Eppendorf	3322
100mM 炭酸塩緩衝液			3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml 蒸留水 pH 9.6
16 mL 遠心分離チューブ シーリングキャップ付き	Thermo Scientific	3138-0016	グラジエント
250 µM 細胞ストレーナー	サーモフィッシャー	87791
3,3′,5,5′-ELISA Sigma T0440 用 テトラメチルベンジジン (TMB) 液体基質システム			4C
30% 過酸化水素	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS ゲル	Gen Script	M42015
4-Chloro-1-naphthol 錠剤	Sigma-Aldrich	C6788
50 mL ファルコン チューブ	コーニング ブルー		30 x 115mm スタイル。ポリプロプライエン円錐管。
70 & マイクロ;M細胞ストレーナー	BD Falcon	352350
AP15 濾紙	ミリポア	AO1504200
ビオチン (タイプA) コンジュゲーションキット	アブカム	Ab102865
解剖顕微鏡	オリンパス	SZX7
DP マネージャー	オリンパス	2.2.1.195	セル画像ソフトウェア
ダクトテープ	ホーム便利屋		48mm x 25mmダクトテープ
ダルベッコ's Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - プロトコル
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
蛍光顕微鏡	オリンパス	BX51
フルオロシールド DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
鉗子	デュモン		#9 デュモン - Switerzland
グリセロール	Sigma-Aldrich	G5516	グリセロール >99%
シン	Sigma-Aldrich	410225
ハンドヘルド カウンター	オフィスワーク	JA0376230
ハンクs Balanced Salt Solution	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – 氷冷プロトコル用
血球計算計	Optik Lakor	-
-L-Glutathione 酸化	Sigma-Aldrich	G4376
磁気分離スタンド	Novagen-4-Tube		磁気分離ラック
メタノール	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	超純水用一体型浄水システム
ニトロセルロースメンブレン	ライフサイエンス	66485	30cm x 3M 純ニトロセルロースメンブレン
PageRuler 染色済みタンパク質ラダー	サーモフィッシャー	SM0671
PBS			1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml 蒸留水) pH 7.4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
蠕動ポンプ	Masterflex	7518-10
リン酸	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS ブロッキングバッファー	Thermo-Scientific	37573	4Cに保管 ブロッキングバッファー
プロテアーゼ阻害剤 カクテル	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	写真–-20 °C
クイック スタート ブラッドフォード ダイ 試薬 1x	Biorad	500-0205	ブラッドフォード アッセイ用
クイック スタート BSA スタンダード	Biorad	500-0207	ブラッドフォード アッセイ
メス	ラボ用 Co		サイズ 11 メス
SilverQuest TM 染色キット	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ 超遠心分離機	Thermo Scientific	46910
ストレプトアビジン (HRP)	Abcam	AB7403
ストレプトアビジン 磁気ビーズ	New England Biolabs	S1420S
瞬間接着剤 - 超高速ミニ	UHU		UHU 瞬間接着剤 1mg. 超高速ミニ
卓上遠心分離機	エッペンドルフ	22331
	TCEP サーモフィッシャー	20490
トリトン X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
ボルテック	Ratek	VM1
ウォーターバス	グラント	GD100