ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル

Summary

ヒト僧帽弁のタンパク質組成は、未分化であり、その分析は細胞密度が低く、したがって低タンパク質生合成によって複雑であるため、まだ未知である。この研究は、僧帽弁プロテオームの分析のためにタンパク質を効率的に抽出するためのプロトコールを提供する。

Abstract

細胞のプロテオームの解析は、複雑な生物システムに存在するタンパク質の大規模な同定と定量を可能にする技術の開発による疾患の根底にある分子メカニズムを解明するのに役立ちます。プロテオームアプローチから得られた知識は、疾病の根底にある病原性メカニズムをより良く理解し、新規の診断および予後の疾患マーカーの同定を可能にする。しかし、心臓僧帽弁は、プロテオグリカンおよびコラーゲン富化細胞外マトリックスの細胞性が低いため、プロテオーム分析のための非常に困難なサンプルである。これは、全体的なプロテオーム分析のためにタンパク質を抽出することを困難にする。この研究は、定量的プロテオミクスおよびイムノブロッティングのような後続のタンパク質分析と互換性のあるプロトコールを記載する。これにより、データの関連性を考慮することができますgタンパク質の発現を、定量的mRNA発現および非定量的免疫組織化学的分析に関するデータと比較した。実際、これらのアプローチは、一緒に実施されると、mRNAから翻訳後タンパク質改変まで、疾患の根底にある分子メカニズムのより包括的な理解につながるであろう。したがって、この方法は、心臓弁の生理病理学の研究に関心のある研究者に関連する可能性がある。

Introduction

最近の証拠は、mRNA合成後に生じる多くの調節機構の役割の理解を変化させている。実際、翻訳、転写後およびタンパク質分解プロセスは、タンパク質の存在量および機能を調節することができる。転写産物レベルがタンパク質存在量の主な決定因子であると仮定して、mRNA濃度が対応するタンパク質のプロキシであると言うドグマは部分的に改訂されている。細胞^1,2内のタンパク質を調節するために起こる。

さらに、タンパク質は最終的に細胞の機能を決定し、したがって自己分泌、傍分泌および内分泌因子に応答して動的変化を起こすことができるその表現型を指示する。血液媒介メディエーター;温度;薬物治療;病気が発症する。このように、タンパク質レベルに焦点を当てた発現解析は、プロテオームの特徴を明らかにするとともに、疾患病因の一部として起こる重大な変化を解明するのに有用である³ 。

したがって、既存の技術的課題にもかかわらず、プロテオミクスが健康状態や病状を明らかにする機会が大いにあります。プロテオミクスが貢献できる研究の特に有望な分野には、以下のものが含まれる：任意のレベル（ すなわち、細胞全体または組織、細胞内コンパートメントおよび生物学的液体）におけるタンパク質発現の変化の同定;疾患の診断および予後に有用な新規なバイオマーカーの同定、検証および....

Protocol

このプロトコルでは、正常な心エコー検査のパラメーターにかかわらず、技術的または機能的理由のために、臓器移植から除外された多臓器ドナーからの多臓器外植片（4〜12時間の冷虚血時間、平均6±2時間）の間にヒト心臓を収集する。彼らは、大動脈弁および肺動脈弁の銀行業務のために、ミラノの心血管組織バンクMonzino Cardiologic Centre（ミラノ、イタリア）に送られる。僧帽弁後小葉は臨床目的では使用されないので、ドナーの親族からインフォームドコンセントが得られた後、大動脈弁および肺動脈弁の隔離中に収集される。移植および研究のための組織は、親の同意の後にのみ収集される。倫理委員会のガイドラインに従い、人間の臨床使用（ すなわち、微生物学的、機能的および血清学的問題）に適していない場合にのみ、同意書上で心臓組織の使用を認可する（またはしない）モンティーノ心臓病センター。

1.僧帽弁の準備

1. 臓器の外植後（冷虚血時間は4〜12時間）、できるだけ早くヒト僧帽弁を採取する。
2. クリーンルームでは、冷たい（4℃）溶液（ すなわち、生理食塩水または平衡培地EurocollinsまたはWisconsin）を含む輸送用バッグから心臓を取り除く。それをバケツに入れて、バルブの準備を進めるために、バイオセーフティキャビネット（バイオハザード気流、クラスA、グッドマニュファクチャリングプラクティス（GMP）分類）に入れてくだ....

Results

ウレア緩衝液中のタンパク質の抽出および溶解は、等電点電気泳動（2次元電気泳動（2-DE） ¹¹および液相等電点電気泳動（IEF） ¹² ）に基づくプロテオーム法およびLaemmli緩衝液^13での希釈後のイムノブロッティングプロテアーゼ阻害剤カクテル^14を含有する。

ゲルフリー質量分析法（ すなわち、データ非依存性質量分析（LC / MS ^E ）および2次元LC / MS ^E （2D-LC / MS ^E ）に結合された液体クロマトグラフィー）尿素およびチオ尿素を除去するためにさらに処理される必要があり、これはその後のタンパク質消化および液体クロマトグラフィー分離を妨害する可能性がある.......

Discussion

このプロトコールの1つの重要なステップは、試料を凍結させ、粉砕システムを冷却するために液体窒素を使用することである。液体窒素の使用は生物分解を防ぎ、パウダー化を効率的に行うことができますが、安全な取り扱いのためには特別な訓練が必要です。

このプロトコールでは、標準的なモルタルおよび乳棒から小さなサンプルを回収することが困難であるため、サンプル粉砕用の粉砕システムが特徴です。この場合、小さな試料はモルタル表面上に微細な粉末として広がり、収集が困難になる。別の利点は、グラインダが電動化され、再現可能な方法でより多くのサンプルを処理することができ、疲労を増やさないことである。粉砕機の使用に関する1つの制限は、乳棒がモルタルに対して効果的に押されるためには小さくなければならない試料のサイズ（100mg以下）であることである。さらに、粉砕機の構成要素は、洗浄のための使用の間に室温に温めなければならない g。結果として、手順は時間がかかり、多くのサンプルが毎日処理される場合、多くのセットが必要となる。

さらなる重要なステップは.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
生理食塩水			0.9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	バランスの取れた臓器の輸送媒体。400 mLのEurocollins Aと100 mLのEurocollins Bを組み合わせて、バランスの取れた培地を得ます Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	Balanced organ's transport medium.400mLのユーロコリンズAと100mLのユーロコリンズBを組み合わせて、バランスの取れた培地を得る ユーロコリンズ
ウィスコンシン	ブリッジライフ	RM/N 4081	バランスの取れた臓器の輸送媒体
バイオハザード垂直流空気	バーディノーラ		クラスA GMP分類
デュワーフラスコ	サーモサイエンティフィック	ナルジーン 4150-1000
クライオグラインダーシステム	OPS診断	CG 08-01	乳鉢、乳棒、ドライバーを含むグラインダーシステム
ステンレス製鉗子
ステンレス製ヘラ
使い捨て滅菌メス	Medisafe	MS-10
ステンレス製ハサミ			オートクレーブ可能
ステンレス製ピック			オートクレーブ可能
使い捨て滅菌ドレープ	Mon&Tex	3.307.08
イソプロピルアルコール
過酸化			6% 過酸化水素
マイクロピペット、1 mL、チップ
15 mL 遠心分離管	VWR 国際	9278
1.7 mL 遠心分離管	VWR国際	PIER90410
尿素緩衝液			8 M尿素、2 Mチオ尿素、4 % w / v CHAPS、20 mM Trizma、55 mM ジチオトレイトール
尿素	Σaldrich	U6504-1KG	尿素緩衝液に使用する
チオ尿素	Σaldrich	T8656	尿素緩衝液
CHAPS	Σaldrich	C3023-5GR	尿素緩衝液に使用する
ジチオトレイトール	シグマ アルドリッチ	D0632-5G	尿素緩衝液
シリンジ 50 mL	PIC		尿素緩衝液
0.22 µ のろ過に使用。mフィルター	ミリポア	SLGP033RB	尿素緩衝液
PFTE乳棒、2mL	Kartell	6302	Potter-Elvehjemホモジナイザーの一部
ホウケイ酸ガラスモルタル	Kartell	6102	Potter-Elvehjemホモジナイザーの一部
攪拌	VELP scientifica	Stirrer DLH	Potter-Elvehjem
ブラッドフォードタンパク質アッセイによる均質化に使用されます	バイオ・ラッドの研究所	5000006
チューブローテーター	Pbi International	F205
液体窒素
アルミホイル
アイス
ポリスチレンボックス
ドライアイス
遠心分離機			1.7 mL遠心チューブの遠心分離用(13,000 x g
Freezer -80°);C
精密バランス
オートクレーブ			滅菌用
液体窒素
手袋
プロ仕様の強制換気と自然空気対流オーブン			滅菌用
プロテアーゼ阻害剤カクテル	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
Cytoscape		www.cytoscape.org version 2.7	Gene Ontology analysis
BiNGO	http://apps.cytoscape.org/apps/bingo	version 3.0.3	プラグイン遺伝子オントロジー解析用
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus	Biologicals	NBP1-97494	CryABに対するマウスモノクローナル抗体
Septin-11抗体	Novus Biologicals	NBP1-83824	セプチン-11に対するウサギポリクローナル抗体
FHL1	Novus Biologicals	NBP-188745	FHL-1
Dermatopontin抗体に対する	Novus Biologicals	NB110-68135	Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
ヤギ 抗マウス IgG HRP	Sigma aldrich	A4416-0.5ML	免疫ブロッティング用二次抗体
ヤギ 抗ウサギ IgG HRP	バイオ・ラッド ラボラト	170-5046	免疫ブロッティング用二次抗体