卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

Summary

マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス（ すなわち、トランスジーンのランダム組込み）およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。

Abstract

遺伝子改変マウスの使用は、生理学的および病理学的インビボプロセスの両方に関する研究に有意に寄与している 。受精卵母細胞へのDNA発現構築物の前核注入は、過剰発現のためのトランスジェニックマウスを生成するために最も一般的に使用される技術のままである。遺伝子標的化のためのCRISPR技術の導入により、受精した卵母細胞への前核注入は、ノックアウトマウスとノックインマウスの両方に拡大されている。この研究は、注射用DNAの調製と、遺伝子ターゲッティングのためのCRISPRガイドの作成について記述しており、特に品質管理を重視しています。潜在的な創始者の同定に必要な遺伝子型決定手順は重要である。本明細書では、CRISPRの「多重化」能力を利用する革新的な遺伝子型決定戦略を提示する。手術手順も概説されている。一緒に、プロトコルのステップは、世代の生成を可能にする免疫学、神経科学、癌、生理学、発達およびその他を含む多数の研究分野のためのマウスコロニーのその後の確立のために使用される。

Introduction

脊椎動物および無脊椎動物の両方における動物モデルは、アルツハイマー病^1,2などのヒト状態の病態生理学を調べるのに役立っている。彼らはまた、疾患修飾物質を探索し、最終的に治癒のために新しい治療戦略を開発するための貴重なツールです。各モデルには固有の制限がありますが、全身モデルとしての動物の使用は生物医学研究にとって不可欠です。これは、代謝および複雑な生理学的環境を組織培養において完全にシミュレートすることができないためである。

今日まで、マウスは遺伝的操作のために使用される最も一般的な哺乳動物種のままであるが、それはいくつかの利点を有するからである。疾患に関連する生理学的プロセスおよび遺伝子は、マウスとヒトとの間で高度に保存されている。マウスはヒトゲノムの1年前に完全ゲノム配列決定された最初の哺乳動物であった（2002）私（2003）。この豊富な遺伝情報とは別に、マウスは良好な育種能力、迅速な開発サイクル（受精から離乳までの6週間）、および合理的なサイズを有する。これらすべての利点は、異なるコート色（交差戦略に必要）などの生理学的指標と組み合わせて、マウスを遺伝子操作の魅力的なモデルにしました。特に、現代の遺伝学の非常に早い年齢で、グレゴールメンデルは植物に移動する前にマウスで作業を始めました³ 。

遺伝子移入技術は、ウイルスの....

Protocol

すべての手続きは、ニューサウスウェールズ州動物衛生倫理委員会の承認を受けています。

導入遺伝子の調製（ランダム・インテグレーション）

1. 分析用アガロースゲル電気泳動。
   1. 製造業者の推奨に従ってサーモサイクラー中で適切な酵素（1時間インキュベーション）または高速消化酵素（15〜30分間インキュベーション）を用いて導入遺伝子を消化するためにプラスミドを消化する（ 図2Aおよびその凡例参照）。
   2. 0.5〜1.0μg/ mLエチジウムブロマイド（EtBr）で染色した1％トリス - アセテート - エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）（TEA）アガロースゲルを流します。
      注記：EtBrを使用するときは注意してください。それは強力な変異原である。適切な個人保護具を使用してください（物質安全性データシートを参照）。
   3. 1kbの分子量マーカーをロードする。
   4. 線形化された断片（ すなわち導入遺伝子および骨格）をロードする。
   5. 電気泳動を100Vで45分間行う。
   6. 消化が完了したことを確認し、導入遺伝子（ すなわち、 7,338bp; 図2A参照）の正しいサイズを確認するため....

Results

以下に、ランダム組込みおよびCRISPR媒介遺伝子標的化の場合のマイクロインジェクションのワークフローを示す（ 図1 ）。

図1：遺伝的に改変されたマウスの典型的なワークフローランダム組み込みのために、精製されたトランスジーンは、卵管がプラグインされた雌の雌に移入される前に、受精卵母細胞の前核に注入される。後代の分析は、迅速なゲノムDNA抽出の後にPCRによって行う。 CRISPR遺伝子標的化のために、ここに記載された非クローニング法を用いてsgRNAを合成し、2つのガイドを受精卵母細胞の細胞質に同時注入する（Cas9 mRNAと共に）。この戦略は、その後のPCRに基づいて子孫を分析するために使用され.......

Discussion

プロトコル内の重要なステップ

遺伝子組み換えマウスの作製は技術的に困難であることが知られている。しかし、ここで提示されたプロトコルは、記録的な時間に技術をマスターし、トラブルシューティングを行うことを可能にする、最適化され単純化された方法である。この技法をうまく完了するためには、2つのステップが必要である。第一に、線状DNA鋳型（sgRNAの合成用）の合成は、塩化マグネシウム（MgCl ₂ ）なしで達成することができる。しかし、フォワードプライマーの部分的ハイブリダイゼーションは、MgCl _2が存在しない場合にしばしば防止されるので、マスターミックスにMgCl ₂を系統的に添加することが強く推奨される。さらに、ターゲティングされたゲノム配列がドナー鋳型のどの部分にも存在しないことが重要である（標的化された組み込みの場合）。そうしないと、Cas9ヌクレアーゼが切断してHDRの発生を防止する。

変更トラブルシューティング

遺伝.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
マイクロピペット 0.1-2.5 μL	Eppendorf	4920000016
マイクロピペット 2 - 20 μL	エッペンドルフ	4920000040
マイクロピペット 20 - 200 μL	エッペンドルフ	4920000067
マイクロピペット 100 - 1,000 μL	Eppendorf	4920000083
分子量マーカー	Bioline	BIO-33025	HyperLadder 1 kb
分子量マーカー	Bioline	BIO-33056	HyperLadder 100 bp
Agarose	Bioline	BIO-41025
EDTA buffer	Sigma-Aldrich	93296	10x - 1x
Ethidium bromide	に希釈 Thermo Fisher Scientific	15585011
SYBR Safe gel stain	Invitrogen	S33102
ゲル抽出キット	Qiagen	28706
PCR精製キット(Qiaquick)	Qiagen	28106
システム(マニホールド)	Promega	A7231
クレアーゼフリーマイクロインジェクションバッファー	Millipore	MR-095-10F
Ultrafree-MC 微量遠心フィルター	ミリポア	UFC30GV00
Cas9 mRNA	Sigma-Aldrich	CAS9MRNA
CRISPR 発現プラスミド (px330)	Addgene	42230
ヌクレアーゼフリーウォーター	Sigma-Aldrich	W4502
Phusion ポリメラーゼ	New England Biolabs	M0530L
T7 Quick High Yield RNA kit	New England Biolabs	E2050S
RNA精製スピンカラム(NucAway)	Thermo Fisher Scientific	AM10070
ssOligos	Sigma-Aldrich	OLIGO STANDARD
Donor plasmid	Thermo Fisher Scientific	GeneArt
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884
KSOMaa 胚培養培地	Zenith Biotech	ZEKS-100
鉱油	ゼニス・バイオテック	ZSCO-100
M2 ミディアム	Sigma-Aldrich	M7167
サイトカラシン B	Sigma-Aldrich	C6762
マウスピース	Sigma-Aldrich	A5177
ガラス製マイクロキャピラリー	サッター器具	BF100-78-10
Proteinase K	Applichem	A3830.0100
Dumont #5 鉗子	ファインサイエンスツール	91150-20
アイリスハサミ	ファインサイエンスツール	91460-11
ベッセルクランプ	ファインサイエンスツール	18374-43
巻き取りクリップ	ファインサイエンスツール	12040-01
クリップアプライヤー	ファインサイエンスツール	12018-12
ハサミ	ファインサイエンスツール	15000-03
焼灼器	ファインサイエンスツール	18000-00
非吸収性外科用縫合糸 (Ethilon 3-0)	Ethicon	1691H
5% CO2 インキュベーター	MG サイエンティフィック	ギャラクシー 14S
分光光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ナノドロップ 2000c
サーモサイクラー	エッペンドルフ	6321 000.515
電気泳動	BioRad のセットアップ	1640300
UVトランスイルミネーター	BioRad	1708110EDU
サーモサイクラー	エッペンドルフ	6334000069
立体顕微鏡	オリンパス	SZX7
倒立顕微鏡	オリンパス	IX71
2x マイクロマニピュレーター	エッペンドルフ	5188000.012
卵子マニピュレーター	エッペンドルフ	5176000.025
マイクロインジェクター (フェムトジェット)	エッペンドルフ	5247000.013
マウス C57BL/6J	株 オーストラリア バイオリソース	C57BL/6JAusb