慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

Summary

この研究では、最適化されたメチル-CpG結合ドメイン（MBD）配列決定プロトコルと、慢性リンパ球性白血病（CLL）患者において差別的にメチル化されたCpGリッチ領域を同定するための計算パイプラインについて記載する。

Abstract

癌における長い非コードRNA（lncRNA）の役割は、癌の発達および進行中のそれらの機構的機能の理解への関心の高まりから、最前線に来ている。それにもかかわらず、特に慢性リンパ球性白血病（CLL）において、lncRNAおよび癌における反復配列の全体的なエピジェネティックな制御は十分に研究されていない。この研究では、メチル結合ドメイン（MBD）タンパク質を用いた二本鎖メチル化DNA断片の免疫沈降に基づく捕捉、次世代シーケンシング（MBD-seq）に続くユニークなアプローチに焦点を当てています。 2つの予後サブグループ（5つのIGVH変異サンプル+ 5つのIGVH非変異サンプル）に属するCLL患者サンプルをこの研究で使用した。分析により、正常な健康対照と比較して5,800の過剰メチル化および12,570低メチル化CLL特異的差異的メチル化遺伝子（cllDMG）が明らかにされた。重要なことに、これらの結果は、いくつかのCLL特異的な、差異的にメチル化されたlncRNAを同定した鋭い要素、および予後の価値を潜在的に有するタンパク質コード遺伝子が含まれる。この研究は、CLL患者試料を用いた高度にCpGが豊富な領域における全体的メチル化プロファイルの包括的な解析のために開発されたMBD-seqおよびバイオインフォマティクスパイプラインの詳細なプロトコルを概説している。最後に、タンパク質コード遺伝子およびlncRNAを、パイロシーケンシングを用いて検証した。これは、CpGメチル化レベルを分析してMBD-seqプロトコールからの知見をさらに裏づける高度に定量的な方法である。

Introduction

近年、全世界のDNAメチル化プロファイルを解析するための次世代シーケンシング技術の使用が増えています。メチル化感受性制限酵素消化、およびメチルCpG特異的抗体を用いたメチル化DNAの免疫沈降に基づいて、ゲノムワイドメチル化アッセイ（マイクロアレイおよび非マイクロアレイベースの方法を含む）を開発した。

異常なDNAメチル化は、慢性リンパ球性白血病（CLL）を含む白血病およびリンパ腫の特徴の1つである。以前は、私たちを含むいくつかのグループが、ゲノムDNAの重亜硫酸塩変換、マイクロアレイベースの方法または全ゲノム配列決定1,2,3を用いて、異なるCLL予後サブグループおよび正常な健康なB細胞コントロールのDNAメチル化プロファイルを特徴付けた^{、 4。ゲノムDNAの重亜硫酸塩の変換は、修飾されていないシトシンのウラシルへの脱アミノ化をもたらし、修飾メチル化シトシンをゲノムに残す。一旦変換されると、DNAのメチル化状態は、マイクロアレイベースまたは全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（WGBS）のような異なる定量的または定性的方法を用いたPCR増幅および配列決定によって決定することができる。重亜硫酸塩変換に基づく方法は多くの利点を有し、DNAメチル化レベルを分析するために異なる癌型で広く使用されているが、この技術に関連するいくつかの欠点がある。 WGBSシークエンシングにより、より少ないDNA量で1塩基対の分解能が得....}

Protocol

CLLサンプルを収集するための倫理的承認は、2007年5月21日から、次の登録番号：EPN Gbg dnr 239/07である。すべてのCLL患者は最近改訂された基準⁸に従って診断され、サンプルは診断時に収集された。研究の患者は、書面による同意が得られた後、スウェーデン西部の様々な血液学部門から含まれていた。この研究では、白血病細胞の腫瘍パーセンテージが70％以上であるCLL末梢血単核細胞（PBMC）試料のみを選択した。

1.準備

1. 製造者の指示に従って、市販の単離キット（ 材料表参照）を用いて、CLLおよび正常な健康な末梢血サンプルからのDNA抽出のためのPBMCを単離する。
2. オートクレーブ1.5mLチューブ。メチル化DNA結合キットのすべての試薬を解凍します（ 材料表を参照）。
3. ビーズを洗浄し、キットで提供されるMBDタンパク質を希釈するために、DNaseフリーの水を使用して、キットが提供する5xストック洗浄バッファーから1xビーズ洗浄バッファーを調製します。
4. 以下の項目を事前に入手または準備する：3M酢酸ナトリウム、無水エタノール、およびDNA沈殿のための70％エタノール（ 材料表 ）。

Results

MBD-seqは最近、CLL患者および一致した正常な健常対照に対して行われ、CLL特異的差次的に過剰および低メチル化された遺伝子を同定した⁷ 。 CLLおよび正常な健康サンプルから生成されたデータを分析するために使用される実験的および生物情報パイプラインを図1Aおよび1Bに示す 。これらの分析は、IGHV変異およびIGHV非変異試料から対照試料と比較して有意に過剰/低メチル化されたいくつかのCLL特異的差異的メチル化領域（cllDMR）を同定した.p値は<0.00001であった。 図2Aは、正常なB細胞および正常なPMBCの両方の比較から得られたすべてのcllDMRを示す。 図2Bに示すように、全てのcllDMRをタンパク質コードおよび非コード遺伝子の異なるクラスにマッピングした。重要なことに、この分析では.......

Discussion

MBD-seqは、費用対効果の高い免疫沈降に基づく技術であり、完全なゲノムワイドカバレッジでメチル化パターンを研究するために使用できます。 MeDIP seq（メチル化DNA免疫沈降の後にシーケンシング）およびMBD-seqの両方が、CpGが豊富なメチル化DNAの濃縮をもたらす。しかしながら、MBD-seqは、MeDIP seq19と比較した場合、高度にCpGに富む領域への結合に対するより高い親和性を示す。メチル結合濃縮キットを用いて、DNAを高塩濃度緩衝液および低塩緩衝液でそれぞれ溶出することにより、DNAを高CpGおよび低CpGに富む領域に分けることができる。この調査では、CpG島の大部分をカバーする高度に濃縮されたCpGに富む領域を捕捉するために、単一の画分溶出のみが実施された。

MBD-seqは、CLLやその他の白血病の研究でよく使用されるWGBSの強力な代替物となりうる。 MBD-seqは重亜硫酸塩と比較して相対的に多量の入力DNAを必要とするにもかかわらず変換後のPCR増幅バイアスを作成せずに、5mCの修飾のみに特異的な全体的なメチル化の変化を調べることができます。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dneasy 血液および組織キット	Qaigen	69504
Lymphoprep 溶液	A X I S-S H I E L D
1114544 Nano drop 2000	Thermo Fischersceintific
TE バッファー pH 8	Sigma aldrich	93283
Bioruptor 標準超音波処理装置	Diagenode	UCD-200
TPX bioruptor チューブ 1.5mL	Diagenode	C30010010-300
3 M 酢酸	ナトリウム Diagenode	C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit	Thermo Fischersceintific	G6465EU
E-gel 2% Agarose gels	Thermo Fischersceintific	G441002
Methylminer メチル化 DNA 濃縮キット	Thermo Fischersceintific	ME10025
Labquake チューブシェーカー/ローテーター	Thermo Fischersceintific	415110
Dynal MPC-S	Thermo Fischersceintific	A13346
ボルテックスミキサー	VWR	12620-848
無水エタノール	任意の会社
70% エタノール	任意の会社
DNAse フリーウォーター	Milli Q
DNA 沈殿剤 (3M 酢酸ナトリウム)	Diagenode	C03030002
Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes	Eppendorf	4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fischersceintific	Q32851
Qubit 0.5 mL tubes	Thermo Fischersceintific	Q32856
Qubit	Thermo Fischersceintific	Q32866
イルミナ Hiseq2000 プラットフォーム	イルミナ
ウォーター バス	グラント、
ヒートブロック	グラント
、チューブローテーター	、ラボクエイク