血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

サマリー

この研究は、顕微鏡観察のための全マウント組織調製に続く、乳房脂肪パッド移植による血管内皮幹細胞（VESC）の増殖、分化および血管形成能を評価するための新規アプローチを実証する。 インビボでのVESCの挙動を調べる系統的な追跡戦略も提示される。

要約

内皮細胞（EC）は、血管構造の基本的な構築ブロックであり、適切な血管発達およびホメオスタシスを確実にするための血管成長およびリモデリングを媒介する。しかしながら、内皮系統の階層に関する研究は、アクセスを獲得し、インビボでのその行動を直接評価するためのツールがないため、依然として分かり難い。この欠点に対処するために、乳房脂肪パッドを用いて血管新生を研究するための新しい組織モデルが開発されている。乳腺は主に、思春期および妊娠を含む出生後の段階で発症し、その間に堅牢な上皮増殖が広範囲の血管リモデリングを伴う。乳房脂肪パッドは、成長する乳房上皮からの空間、マトリックス、および豊富な血管形成刺激を提供する。さらに、乳房脂肪パッドは、腹膜腔の外側に位置し、外因性細胞の血管新生能を評価するための容易に接近可能な移植部位となる。この作品はまた、効率インビボで血管内皮幹細胞（VESC）の標的とされた集団を特異的に標識するために蛍光レポーターマウスを用いるntトレースアプローチ。この系譜追跡法は、その後の組織全面顕微鏡法と組み合わせて、標的細胞およびその子孫の直接的な可視化を可能にし、増殖能力を定量化し、分化のコミットメントを運命マッピングすることができる。これらの方法を用いて、VESCを発現する二重性プロテインCレセプター（Procr）の集団が最近、複数の血管系において同定されている。新たなECおよび周皮細胞の両方を生じるProcr ⁺ VESCは、発生、ホメオスタシス、および傷害修復の間に血管新生に積極的に寄与する。全体として、この原稿は、VESCsの幹細胞特性を評価するために使用することができる新しい乳房脂肪パッド移植およびインビボ系譜追跡技術を記載している。

概要

発生およびホメオスタシスの間、血管の成長およびリモデリングは、臓器の成長および修復に従って忠実に起こる。血管新生は、既存の血管か​​らの新しい血管の発生を説明し、これらの動的な血管変化を媒介する主要な力とみなされる。各血管は内皮細胞（EC）の層で内張りされており、血管構造の基礎と思われる。長い間、恒常性の間にECプールが補充されるメカニズムは依然として不明であり、血管代謝回転が成熟EC増殖の結果であるか、または血管幹/前駆細胞活性の寄与であるかについて議論がなされた。直接の生理学的証拠の欠如のために、血管内皮幹細胞（VESC）の存在および細胞の同一性もまた議論の余地があった。

幹細胞の行動を確認するために使用される最も一般的なアプローチの1つは、移植計画推定上の幹細胞のレシピエントマウスへの導入。この方法は、 インビボで候補幹細胞の幹細胞の可能性を測定する。移植は、骨髄幹細胞¹の研究に最初に適用され、これは造血系^2の階層的特徴の確立に寄与した。内皮の分野では、側面皮膚の下に皮下に挿入された基底膜マトリックス（ 例えば、マトリゲル）プラグは、移植されたECの血管形成能力に対処するために使用される標準的なin vivo血管形成アッセイであった。 3D培養系及び移植におけるコロニー形成を含む、複数の実験方法は、潜在的....

プロトコル

実験手順は、承認されたプロトコールSIBCB-NAF-15-002-S335-003の下で、上海生化学および細胞生物学研究所の中国科学アカデミーのアニマルケアおよび使用委員会によって承認された。

1.マウス乳腺からのVESCの単離

1. 乳腺の収穫および組織消化。
   1. 組織ドナーとして、8週齢のアクチン-GFP成熟処女レポーターマウスを使用し、体重範囲は20〜25gです。
      注：ドナーから由来する細胞は、GFP発現によって容易に追跡することができる。
   2. RPMI1640中の5％ウシ胎仔血清（FBS）、1％ペン/ストレプ、および25mM HEPESからなる組織消化基礎培地を調製する。この混合物を0.22μmのフィルターで濾過し、滅菌し、これを水浴中で37℃に予熱する。
   3. CO ₂チャンバー内でマウスを犠牲にする。最初に垂直の皮膚を作ることによって、第4の鼠径乳腺の対を解剖する。メスを使用して下腹部の正中線（または外科用ハサミ）でncision。静かに片側に皮を剥がし、鉗子を使って鼠径乳腺を露出させます。両側から4番目の鼠径乳腺を得、はさみを用いて6cmのペトリ皿で細かく切る。
      1. 細かい組織の総重量を測定し、それを50 mLチューブに入れます。
         注：得られた組織の切れ端が、各部分のサイズが1 mm ^....

結果

乳腺VESC単離：

その結果の移植アッセイのための内皮集団を単離するために、成熟（8週齢）の未処理マウス乳腺をドナー材料として採取した。内皮細胞は、抗体に基づく細胞選別技術を用いて単離された。 8週齢のC57BL / 6乳腺ECにおけるVESC集団のFACS分析の代表的プロットを図1に示す（図^8は 、Yu ら ⁸ ）。

乳腺脂肪移植：

乳房脂肪パッドは、血管新生の研究に理想的な部位を提供する。 FACSに基づく単離の後、Procr ⁺

ディスカッション

血管新生アッセイは、血管動態を研究するための良好な実験的アプローチである。出生後に発症するマウス網膜血管系は、血管新生を研究する魅力的なモデルであることが証明されている¹² 。それが比較的接近可能であるにもかかわらず、網膜血管床内の実際の操作はむしろ困難である。これまでのところ、最もよく記述されているインビボ移植は、基底膜マトリックス塊の内部に細胞を封入し、外科的にインプラント/レシピエントマウスの側面領域に皮下注射するプラグアッセイであった。この血管形成アッセイは、埋め込み細胞の再生能および血管形成能を試験するのに有効である。しかし、植え込まれたマトリックスプラグの位置は、細胞内の比較的孤立した環境を作り出すため、最適な生理学的ニッチを提供しない。最近、サーファにフィブリンパッチを適用することにより、新しい肺血管新生モデルも開発されているマウス肺の¹³部位。しかし、この技術はマウスの胸腔の中で侵襲的に働くため、より一般化されたアッセイ設定で使用することが困難になるため、操作はさらに別のリスクをもたらす。 .......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05% トリプシン-エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (1x)	Gibco (Life Technologies)	25300-062	0.05% トリプシン
0.22 & マイクロ;m フィルターユニット	Merck Millipore Ltd.	SLGP033RB	0.22 & マイクロ;m フィルター
2-メチルブタノール-2, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	24, 048-6	tert Amyl
Alcohol 222, トリブロメタノール	Sigma-Aldrich	T48402-25g	222, トリブロメタノール
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)	Invitrogen	D1306	DAPI
70 µmセルストレーナーBD	FAL	352350	70 µm細胞ストレーナー
接着顕微鏡スライド	CITOGLAS	188105	ガラススライド抗
マウスCD105 APC	eBioscience	17-1051-82、クローンMJ7 / 18	FACSアナログ使用1 & マイクロ;g/mL
抗マウス CD201 ビオチン	eBioscience	13-2012-82	FACS analusis 用 2.5 µg/mL
抗マウス CD31 PE-シアニン 7	eBioscience	25-0311-82、クローン 390	FACS analusis 用 1 & micro;g/mL
BD FACSJazz セルソーター	BD バイオサイエンス	655489	FACS
ウシ血清 アルブミン	シグマ	100190332	BSA
遠心分離機	エッペンドルフ	5810R	遠心分離機
コラゲナーゼ 3 型	Worthington-Biochem	#LS004183	コラゲナーゼIII
共焦点顕微鏡	ライカ	SP8	共焦点
ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼ I	Sigma	D2463-5VL	Dnase I
Donkey anti-Rat Cy3	Jackson ImmunResearch	712-165-150	二次抗体、0.5 & micro;g / mL
デュモン鉗子	WPI	500342	フロセップス
デュモン鉗子-マイクロ鈍いヒント	FST	11253-20	鉗子
胎児ウシ血清	ハイクロン	SH30396.03	FBS
FITC Ms CD3 / Gr1 / CD11b / CD45R(B220)/ Ter-119	BioLegend	78022	FACS分析用の血統カクテル、25 & マイクロで使用。L per test
Glycerol	Sigma	G6279	Glycerol
Iscov's Modified Dulbecco's Medium	Gibco (Life Technologies)	12440-053	IMDM
Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora  647	Invitrogen	Z32450	Isolectin-647
Matrigel マトリックス(成長因子減少)	BD	356231	Matrigel
Mouse 系統 (Actin-GFP)	Jax Laboratories	3773	Actin-GFP
Mouse strain (C57BL/6)	SLAC	C57BL/6	C57BL/6
Mouse strain (BALB/cヌード)	SLAC	BALB/c ヌー	ドマウス
パラホルムアルデヒド	Sigma	P6148	PFA
ペニシリン ストレプトマイシン	Gibco (Life Technologies)	5140-122	Pen/Strep
Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x	Gibco (Life Technologies)	c20012500BT	PBS
PRIM1640	Gibco (Life Technologies)	c11875500CP	PRIM1640
ProLong Gold退色防止試薬	Life Technologies	P36934	Mounting Medium
Rat anti CD144	BD Biosciences	550548	for whole-mountanalysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 & micro;g/mL
ラット抗 CD31-ビオチン	BD Biosciences	553371	ホールマウント麻酔用、抗 CD31/PECAM1 抗体 内皮表面接着分子用、10 & micro で使用;g/mL
赤血球溶解バッファー	Sigma	R7767-100ML	赤血球溶解バッファー
ストレート/シャープ-ブラント/10cm	FST	14028-10	ファインハサミ
ストレプトアビジン eFluor 450	eBioscience	48-4317-82	FACS分析用 0.5 & micro;g/mL
タモキシフェン	シグ	マ 101551374	TAM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250ML	TritonX
ワックス コーティング 編組シルク (サイズ 5-0 USP (1 メートル法)、18 インチ (45 cm) BLACK on C-1 Needle)	COVIDIEN	S1173	縫合糸
滅菌ディスポーザブルスカプル	スワンモートン	#10
ベタジン	Yifengメディカル	20160101	消毒液

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