病変同定のための乳腺全体マウントの分割

サマリー

当初、スライド上に固定されていた乳腺組織を、全体のマウントとして、組織病理学的評価のために首尾よく除去、加工、切片化および染色する方法を開発した。この方法は、生殖および発育試験ガイドライン研究における乳腺全体マウントの採取および評価を促進し得る。

要約

正常な乳腺発達は、環境毒素および医薬品への暴露、ホルモンへの過剰な暴露、および遺伝子改変によって変更される可能性がある。乳腺マウント全体は、暴露後に起こる形態変化の進行を捕捉するための安価な方法である。しかし、後の人生では、異常がより発生しやすい場合、この1つの方法に依存するだけでは、異常の適切な診断を行うのに十分な情報を提供できない場合があります。歴史的に、化学的試験ガイドライン研究では、単一の乳腺が剖検時に除去され、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色セクションとして調製される。反対側の乳房全身収集および分析の導入は、偽陰性評価の可能性を減少させる。マウント全体の評価は、スライド上の1つまたは2つの乳腺全体の存在によって制限され、ある場合には、マウント全体で観察される異常は、H＆Eセクションで一様に表現されています。この研究の目的は、カバーされていない乳腺全体マウントをH＆E染色された切片に変換するためのプロトコールを開発し、そうしなければ欠落していたかまたは診断困難な病変を同定できるようにすることであった。ここでは、最初に全体のマウントとして準備された乳腺から、高品質でパラフィン包埋されたH＆Eセクションを生成する方法を詳述します。 H＆E切片化のために意図的に調製された組織と比較して、全体のマウントは、組織の除去および処理のためのさらなる準備を必要とする。しかしながら、この方法は、一般的なラボ試薬および追加の時間をほとんど必要としないので、安価であると考えられている。結果として、この方法は、化学的および環境的曝露がどのようにして正常な哺乳類の発達を変化させるか、ならびに遺伝子改変のために生じる変化の表示に関する貴重な情報を提供することができる。

概要

乳房全体のマウントは、正常および化学的に誘発された異常な発達の両方を理解するために、多くのラットおよびマウスの研究で実施される有用で安価な方法である。一般に、げっ歯類発達中の様々な段階（ すなわち、青年期、思春期、中期〜後期妊娠期、および退縮段階）で収集された乳腺は、パラクリン、内分泌およびオートクリン因子によって影響される組織および細胞構造の形態変化を示す¹ 。老化ラットでは、腺の上皮および間質部分がますます稠密になり、全体的に形態学的パラメーターを測定することが困難になる。したがって、顕微鏡レベルでの変化を同定するために組織学的評価のために腺を採取することが一般的なプラクティスである。両方のプロセスは、化学暴露（ すなわち、環境または薬学的）を伴う研究、または遺伝子改変を伴う形態学的変化を調べる研究において特に有用であるations。

リスク評価において乳腺を使用するための技術および能力は進化し続けている。全マウント準備ルーチンと標準化されながら、切片の変更は^2、3を続けます。いくつかの研究室が依然として皮膚⁴を介してクロスカット部を使用しながら、様々なバックグラウンド（ すなわち、学界、政府、産業界）から多くの研究グループが、好ましい方法として、乳房組織の縦/冠状切片を適応しています。後者の方法は、興味のある組織ではなく、表皮（皮膚）の過度の表現をもたらす：乳腺上皮² 。冠状部または縦断面は、正常組織^5の特徴付けに有用であり、存在する表面積および構造の数の増加による異常および病変の検出を大幅に改善する。全体的にみると、乳腺^1,2の比較組織病理学的評価のためUNT適した方法。マウスまたはラットを使用するかどうかにかかわらず、 ^第 4および^第 5鼠径部の腺の回収および保存は、対側H＆Eセクション全体との比較に強く推奨されます。

H＆Eセクションとマウント全体を組み合わせて使用​​すると、環境暴露によって引き起こされる細胞と形態変化を正確に説明することができます。これは、モデルが腫瘍形成に対する低い感受性を有するか、または腫瘍が肉眼で見えない特定のげっ歯類株において特に当てはまる。状況によっては、両方の技術（ すなわち、不十分な組織量、リソース、または予期しない実験結果）を使用して、必要な組織を得ることが常に可能であるとは限らない場合もある。本発明者らの場合、乳房全体の異常が観察されたが、組織病反対側のH＆E腺における論理的所見はほとんど正常であった。反対側の腺間の圧倒的な不一致は、我々がマウント全体の異常を特定するための経済的で効率的な手順を開発するように導いた。改良された処理および包埋手順を用いて、パラフィン包埋された全マウントから高品質のH＆E染色切片を調製した。我々は、このプロトコルが化学物質曝露効果の強力な検出ツールとなり、実験室間比較を強化することを想像している。

プロトコル

この研究のための全ての動物の使用および処置は、NIEHS実験動物

ケア・ユース委員会を設置し、

実験動物保護認定施設。

1.乳腺ホールマウント調製^{2、3、6、7}

1. 参考文献³に記載されているように、妊娠していないCD-1雌マウスの片側から鼠径乳腺を取り出し、それらを静電気帯電したスライド上に置く。
2. グランドを覆っていない紙やフィルムで覆い、別のスライドを上に置きます。滑り止めのためにグランドがスライドにくっつくように、グランドを平らに広げるためにスライドに圧力（ すなわち水の重量）を加えます。
3. スライドを固定液（ 例えば、エタノール、クロロホルム、氷酢酸を6：3：1の比で 100％）に浸し、室温で一晩インキュベートする。
4. 固定液から腺を取り出し、エタノールで15〜30分間洗浄する。 30分の洗浄後、エタノールの1/3を注ぎ水を加えて徐々に水に変えます。毎回約5分間洗っておき、水を3回加えることを繰り返す。
5. 12〜24時間、染色（ 例えば、カルミンミョウバン溶液）。
   注：厚い組織はより長い染色時間を必要とします。染色の詳細については、参考文献³を参照のこと。
6. 割り当てられた時間の後に汚れをはがし、水中で30秒間すすいでください。 70％エタノール中でスライドを15分間洗浄することにより組織を脱水し、続いて95％エタノール中で15分間洗浄し、100％エタノール中で最終洗浄を20分間行う。
7. 組織から脂肪を取り除くには、少なくとも24時間キシレンに入れてください。組織が厚い場合は、不透明または白色の部分が除去されるようにしてください。
8. 組織をキシレンから取り出し、すぐにm組織の脱水を避けるためにスライドに培地を滲ませる;カバースリップを上に置きます。スライドを少なくとも48時間乾燥させる。
9. ^2。で説明したように、異常がないかどうかを評価する。
   注：病変が全体的に検出され、識別が必要な場合は、以下の手順に従ってください。

2.ガラススライドからの乳腺全体の除去

1. 乳腺の全マウントスライドをキシレンで満たしたガラス染色ジャーに一晩浸して、カバースリップおよびマウント媒体を除去する。
   注：余分なマウントソリューションを持つ厚い組織やスライドは、カバースリップの取り外しに時間がかかることがあります。
2. 最初に一晩浸漬した後、新鮮なキシレンにスライドを置き、6時間浸す。新鮮なキシレンで一晩最終浸漬を行う。
   注：カバースリップは最後の浸漬後にスライドから容易に外れます。
3. agとスライドを保持し、慎重にそれが一体に取り外されることを確認するために鉗子のペアでカバースリップを削除します。
   注：カバースリップがガラススライドに取り付けられている場合は、少しでも取り除くことができるまで浸漬を続けます。
4. カバースリップが除去されたら、スライドをキシレンを含むガラスペトリ皿に垂直に保持し、注意深く鋭利な使い捨てのカミソリの刃をとり、スライドを1回の動きでブレードをスライドさせます。
5. 組織が除去されたら、速やかに乳房パッドをキシレンで満たされたガラスペトリ皿に沈め、組織が空気乾燥しないようにします。
   注：この手順に注意してください。マウント全体は薄く（1mm以下）、キシレン処理では壊れやすい。いずれの印象または涙も組織の形態を変化させ、後の評価を複雑にする可能性がある。

3.組織処理

1. 組織がペトリ皿に入ったら、慎重にそれを移す標識された組織学的カセットに移す。組織の損傷を最小限に抑えるために、鈍い鼻、鋸歯状の鉗子で脂肪パッドの端をつかみます。
   1. カミソリを使用して、より大きな組織（特にラットの場合）を半分にカットし、組織サイズに適合する2つの別々のラベル付きカセットにそれらを入れる。右に組織を置きます（参照としてリンパ節を使用してください）。リンパ節のない組織は、カセットに移したときに、直立した同じ位置に保持されていることを確認してください。
2. カセットをキシレンの容器に最大2時間入れてからティッシュプロセッサーに入れます。
   注：サンプルをカセットに入れた同じ日に処理することをお勧めします。キシレン中での長期浸漬は試験されていない。
3. 最大数のカセットを手で組織処理装置に装填する。
4. 開始前に、このプロセスで使用するすべての試薬をプロセッサの試薬リストに登録してください。動きを自動化するあるステーションから次のステーションへ、メニューオプションを使用して新しいプログラムを作成します。すべてのステップが完了したら、「OK」を選択して続行します。
   注：プロセッサは、開始する前にすべてのステーションの詳細を確認することができます。
   1. プロセッサーを自動化して、37℃で30分間キシレンに浸し、同じ条件下で新鮮なキシレンで2回浸漬します。プロセッサーを自動化して、キシレン溶液からカセットを取り出し、60℃に設定した1：1キシレン：溶融パラフィン混合物を含む次のステーションに組織を30分間移す。
      注：プロセッサは、カセットを溶融パラフィンが入った新しいチャンバーに1時間移します。 1時間後、試料は新しい溶融パラフィンの新しいチャンバーに自動的に移され、さらに2時間処理される。両方の工程を60℃で行う。
   2. 次いで、プロセッサは、カセットを溶融パラを含むステーションに移送する1時間ffin。次に、試料を新しい溶融パラフィンの最終ステーションに自動的に移し、さらに2時間処理する。両方の工程を60℃で行う。

4.処理された乳腺組織の包埋

1. 金型に組織を埋め込む準備が整うまで、包埋ステーションの58°Cパラフィン保持タンクにカセットを置きます。
2. カセットカバーを取り外して、組織の最適なモールドサイズを決定します。金型が組織を収容するのに十分な大きさであることを確認し、周囲にパラフィンの組織がない境界を有する十分な空間を残す。
3. 溶融パラフィン3〜4mmを金型に​​加え、スライドガラスの底面とカセットの底面に隣接している乳房全面マウント面を金型内に向けます。
4. 金型を冷却プレートに移し、必要に応じて金型bと平行になるように組織をすばやく調整しますオットム。
   注：パラフィンが硬化すると、組織は固定されます。
5. 温かい鉗子を使用して、ラベルの付いたカセットの下半分をモールドの上に置きます。鉗子をしっかりと押してください。
6. カセット全体を覆う連続的な動きでモールドに溶融パラフィンを追加します。金型を温かいプレートからコールドプレートに移動して、ブロックの硬化を完了させます。
7. パラフィンが完全に凝固して亀裂や気泡が発生しないように、モールドからブロックを取り外します。
   注意：パラフィン包埋した組織は、切片ができるまで室温で保管してください。

5.ミクロトーム上にパラフィン包埋された乳房組織を切片化する

1. 切片化する前にパラフィンブロックを-20℃で1時間インキュベートする。
   注：元のカバーガラス付き全マウントティッシュから、ブロック内に残っているマウントメディアがあります。ブロックを冷やすと、ブロックのセクションとリボンが改善されます。
2. マイクを準備する新鮮な蒸留水を入れた水浴をオンにし、温度を42〜45℃に調整することにより、ロトームを得る。新しく薄型のブレードをミクロトームに置き、4μmにセットします。
   注記：セクションの品質は、ティッシュに残っているマウント媒体があるため、4μmよりも厚いセクションでは減少します。
3. ワックスをブレー​​ドに向け、垂直面に合わせてブロックをミクロトームに挿入します。次に、冷水中のガーゼパッドの部分を湿らせ、ブロックに数分間置きます。
4. 粗い前進した車輪と組み合わせて、大きな輪を時計回りの方向に回転させて、ブロックの全面または代表部分が得られるまでブロックを切断する。
   注記：全マウントプロセス中にキシレンが除去されるため、ティッシュは薄いです。代表的なセクションを取得する際のカット数を最小限に抑えるため、ブロックをブレードと適切に揃えます。
5. リボンを選ぶ（45℃）のウォーターバス（前もって準備されています）にリボンを慎重に浮かせて、組織のしわが消散して清潔なガラススライド上に注意深く浮かせます。
6. 余分な水分を除去するためにスライドを乾燥ラックに直立させて置きます。スライドをわずかに開いたスライドボックスに37℃で一晩インキュベートする。

6.切片化乳腺組織の自動および手動H＆E染色

1. 染色前に、スライドを室温で保存する。
2. 自動染色の場合は、メインメニューの染色オプションからH＆Eを選択します。脱パラフィン、染色、および脱水はすべて、自動化された染色装置で完了する。マウントメディアとカバーガラスを使用してセクションをマウントします。
3. 手動でスライドを染色する場合は、スライドをキシレンに5分間浸漬して切片を脱パラフィンする。新しいキシレンに移し、5分間繰り返す。
4. thを浸してスライドを再水和する100％エタノール中でそれぞれ3分間2回、続いて新鮮な95％エタノール中で2回反復し、5分間毎に1X洗浄緩衝液中で2回洗浄した。
5. スライドを蒸留水ですすいでください。
6. スライドを1-2分間ヘマトキシリンに添加する。スライドを取り出し、水道水で5分間すすいでください。
   注：各使用前にヘマトキシリンをろ過する。
7. スライドを1％氷酢酸中に30秒間置いて色分化を促進させ、次いで水道水を1分間すすいですすいでください。
8. スライドを1X PBSに30秒〜1分間添加して組織切片を青色にし、続いて水道水で5分間すすぎ、次に95％アルコールで15〜20秒間すすぎます。
9. エオシン溶液で30秒〜1分間対比染色する。これに続いて、新鮮な95％エタノール中でスライドを2回脱水し​​、続いて100％エタノール中で2回新鮮な繰り返しを行う。各洗浄を5分間行う。
10. 5分間キシレンを2回変えて、キシレン中のスライドを透明にする。
11. Coverslip培地を載せた組織切片を室温で一晩乾燥させた。

結果

この方法は、乳房パッドの最初の反対側のH＆Eセクションが組織学的変化を示さなかった場合に欠けていたかもしれない診断を支援するのに有効である。しかし、組織学的評価のための組織の調製の間だけでなく、最初の全マウント調製中に注意を払う場合には、結果は有用である。パラフィン包埋は保護を提供し、将来の断裂のために組織を保存するのに役立つであろう。

乳房組織の理想的な厚さを決定するために、4μmおよび6μm切片を調製した。我々は、ミクロトーム上の±1μmの誤差のマージンよりも大きい深さを試験した。厚さ6μmのセクション（ 図1A ）は、コンパクトなセルで非常に密集していました。全体として、スライドには明確な細胞の詳細が欠けていたため、適切な識別情報ication。最適な厚さは4μmであった（ 図1B ）。これらの組織は、上皮および間質領域および対応する細胞型が容易に区別される最良の結果を提供した。...

ディスカッション

乳腺全体マウントは、内分泌かく乱物質を含む化学物質への暴露後に生じる可能性のある正常な乳腺発達および形態変化を説明するのに使用できる強力なツールである。同じ動物の全体のマウントとH＆Eセクションが一緒に評価されると、早期の変化の正確な視覚的スナップショットを提供することができ、より病的な状態に進化することができる。

この有用な情報を得る能力は、組織を除去するときに腺形態を保存し、妥協しないように注意することにある。げっ歯類は、背壁に沿って両側にあるいくつかの乳腺サイトを持っていますが、筋肉組織の回復を最小限にするために4 ^番目と5 ^番目の腺を収集することをお勧めします。有用な形態学的ランドマークとして役立つので、乳頭付着領域およびリンパ節も存在するはずである。腺も広げて伸ばすべきですインサイチュでの組織の自然な構造を密接に模倣するために、平らな表面（ すなわちスライドガラス、カードストック、または布）を横切って配置される。乳腺内の異常は、通常、腺がキシレンで脱脂されるか、またはカルミン染色されるまで見え...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
キシレン	Sigma-Aldrich	214736
パーマウント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SP15-100	マウント剤 (全体のマウントおよび H&Eセクション
ライカ 自動プロセッサ	ライカ バイオシステム	モデル # ST5020
HM 355S 自動ミクロトーム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	905200
パラフィン	ライカ バイオシステムズ	EM-400
スーパーフロスト プラス 顕微鏡スライド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4951PLUS-001	静電充電
フィッシャー ファイネスト 24x60x1	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12-548-5P	カバースリップ
バリステインジェミニ ES 自動スライドステイナー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A78000014
Sta-On	Leica Biosystems	3803107	液体接着剤; 切片化時に水浴で使用
改質ハリス ヘマトキシリン 72711	Richard-Allan Scientific (Thermo Scientific の一部)	72711
Eosin	Leica Biosystems	3801600
Lithium Carbonate	SkyTech Laboratories	LCQ500
Glacial Acetic Acid Thermo	フィッシャーサイエンティフィック	A38-500	ノイの固定剤
クロロホルム	マクロンファインケミカル	4440-04	ノイの固定剤
に必要な100%エタノール	ワーナーグラハムカンパニー	6505001050000	ノイの固定剤と洗浄スライド95
%エタノール	ナーグラハムカンパニー	6505011137320190
カーマインミョウバン	Sigma-Aldrich	C1022-25G
アルミニウム硫酸カリウム十二水和物、Sigma Ultra	Sigma-Aldrich	A7210-500G
オートメーション洗浄バッファー、20X	Biocare Medical	TWB945

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