ここでは、無血清胚様体（SFEB）と呼ばれるヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）から3次元（3-D）システムを開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、器質型のスライス培養のように、ヒトの皮質の発達をモデル化するため、および神経回路を発達させる生理学的な質問のために使用することができる。
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この記事について
サマリー
要約
hiPSCsを使用して多数のin vitro疾患モデルが開発されているが、これらの2次元（2D）システムは、疑わしい疾患の変異を有する罹患者の基礎的な細胞構造および機能の複雑さを表さない可能性がある。従来の2次元モデルは、インビボのような構造の不完全な表現であり、脳の複雑さを適切に捕捉しない。したがって、 in vivo系で見られる細胞相互作用および機能をよりよく再現できる、より多くの3-D hiPSCベースのモデルが必要となっている。
ここでは、無血清胚様体（SFEB）に基づく未分化hiPSCからの3-D系を開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、発達中の腹側新皮質の局面を反映しており、泳動、接続性、通信およびマットのような生きた神経細胞およびインタクトな組織に不可欠な機能への研究を可能にする期間。具体的には、本発明者らのプロトコールを用いたSFEBは、カルシウムイメージング、および凍結切除なしの多電極アレイ（MEA）記録のような生理学的に関連した高含量細胞ベースのアッセイを用いて調べることができることを示す。 MEA記録の場合、我々はSFEBが長期間の培養中にスパイク活性およびネットワークレベル破裂活性の両方を増加させることを示す。このSFEBプロトコルは、早期皮質発達の局面を捕捉する3-Dモデルにおけるネットワーク形成の発展の研究のための堅牢でスケーラブルなシステムを提供する。
概要
私たちはこれまで、ヒト由来の多能性幹細胞（hiPSCs）由来の患者由来の3次元モデルシステムを報告しましたが、これは早期皮質ネットワーク開発のいくつかの側面を再現しています1 。この3-Dモデル、無血清胚様体（SFEB）は、以前の単純な集約hiPSCモデル2,3に向上します。仕事の成長体は、5 /単層hiPSCモデル4私達のSFEBsような3-D構造が、神経発生のおおよその態様は、一般的にインビボおよび2次元（2-D）で観察されるより前の時点で観察されたことが明らかにされています。初期の研究は、生理学的複雑性2を示さずに3次元物体の自己組織化の複雑さに焦点を当てている2 。
本明細書に記載のプロトコルは、線維芽細胞由来の未分化hiPSCおよび末梢血単核細胞（PBMC）である。これらの細胞はγ線照射マウス胚性フィーダー（MEFs）上で維持される。これらのhiPSCコロニーを、自然に分化した細胞を手動で洗浄し、酵素的に採取し、Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632（ROCKi）を含....
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プロトコル
1.神経前駆細胞の作製
- 小分子を補充したヒトiPSC培地（材料表参照）中のγ-照射マウス胚性フィーダー（MEF）細胞層上の6ウェルプレート中の線維芽細胞およびPBMC由来のhiPSCを維持する。
注：毎日のメンテナンスは、以前に報告された手順1、16の修正版です。- 6ウェル組織培養グレードプレートの各ウェルに300μL/ウェルの推奨培地（製造業者のプロトコールに従って）に6×10 5個の MEFをプレートする。
- 48時間後、hiPSCを添加する前に、MEF培地を300μL/ウェルのhiPSC培地で1時間交換する。
- 37℃の水浴でhiPSCをすばやく解凍し、1mLのhiPSC培地をゆっくりと滴下します。 hiPSCと培地を15 mLコニカルチューブに移す。培地を加えて総容量を5 mLにする。 129xgで4分間遠心分離し、上清を吸引する1：1000濃度のROCK阻害剤を含む1mLのhiPSC培地中でペレットを静かに再懸濁する。
- MEF細胞層上に（典型的には30万細胞/ウェルで播種した）細胞懸濁液をプレートし、37℃、5％CO 2、湿度95％でインキュベートします。
- iPSC培養を光学顕微鏡を用いて密接にモニター....
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結果
本発明者らの技術を用いて増殖させたSFEBは、初期の発達中の皮質下脳室ゾーンに類似した形態学的特徴を有する組織をもたらし、広範囲のTuj1陽性ニューロンならびに神経前駆細胞（ 図3A ）が充満した。 SFEBの外層および内層には、数多くの発育中の皮質のロゼットが観察された（ 図3B ）。 SFEBの外縁は、分裂終了ニューロンを含む発達中の皮質プレートに似ている。これは、最も腹側の外側皮質層における神経前駆細胞のマーカーであるBrn2の発現によって支持される。発達中の皮質の外層で発現されるCajal-Retzius細胞またはそれらの前駆細胞であり得るリーリン陽性細胞も、SFEBにおいて観察される（ 図3C ）。このプロトコルを使用して増殖させたSFEBは、混合尾部（CGE）および内側神経節と一致するマーカーを発現するnic eminence（MGE）起源です。 CGEマーカーCouptf2およびM.......
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ディスカッション
本明細書に記載のプロトコルは、hiPSC供給源を、前頭皮質の初期発達段階を再現する3-D構造に区別するための条件を提供する。この手順は、電気生理学のために調べることができ、顕微鏡検査も受け入れやすい構造をもたらす。 SFEBの最終形態は、器官型脳スライス培養のものに似ており、高品質の詳細な共焦点イメージングを可能にする。このプロトコルは、線維芽細胞および末梢血単核細胞由来のhiPSCの両方からSFEBを首尾よく生成することができる。末梢血単核細胞由来hiPSCから作製されたSFEBは、線維芽細胞由来hiPSCから作製されたSFEBと類似の形態学的特徴を示す。
このプロセスは、他の3-Dスキームと同様に、小分子の細胞外手がかりを用いて細胞運命の決定を導く。これは、細胞間接触の固有の特性と組み合わされ、より現実的なネット環境を作り出します仕事の形成と神経の機能。他のレポートは、小分子の細胞外シグナルの適切な組み合わせは、中脳ドーパミン作動8、22、及び皮質介在ニューロン.......
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開示事項
著者には競合する金銭的利益はない。
謝辞
記事を校正してくれたElizabeth Benevidesに感謝します。私たちはDrsに感謝します。ジョン・ハスマンとジーン・ブラットが彼らの有益な議論とコメントのために語った。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| SFEBニューロン分化細胞培養培地。試薬。コンポーネント | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM MEDIUM (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| 名義 | >会社 | strongカタログ番号 | コメント |
| DM1 培地コンポーネント | |||
| D-MEM/F-12 (1x)、グルタマックス液、1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| ノックアウト血清補充 | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| ペン/連鎖球菌 | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM 非必須アミノ酸溶液 10 mM (100x)、液体 | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-メルカプトエタノール (1,000x)、液体 | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| 名 | 会社 | カタログ番号 | Comments |
| DM2 培地コンポーネント | |||
| D-MEM/F-12 (1x)、グルタマックス液、1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| グルタマックス 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| ペン/連鎖球菌 | 15140122 | 5 mL | |
| N-2 Supplement (100x)、液体 | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| 名前 | 会社 < | strong>カタログ番号 | コメント |
| DM3 培地成分 | |||
| NEUROBASAL 培地 (1x)、液体 | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 サプリメント マイナスビタミン A (50x)、液体 | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| グルタマックス 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| ペン/連鎖球菌 | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| >Small Molecules | |||
| チアゾビビン | ステムジェント | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| ドルソモルフィン | ステムジェント | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 組換えプロチエンス | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | カタログ番号 | コメント |
| コンポーネント/材料 | |||
| Cell Cultureインサート0.4 μM、直径30mm | ミリセル | PICM0RG50 | |
| マウス胚性線維芽細胞GlobalStem | GSC-6301G | ||
| 96ウェルV底、蓋付き、 | エバーグリーン | 222-8031-01V | |
| StemProアキュターゼ細胞解離試薬 | サーモフィッシャー | A1110501 | |
| TritonX-100 | モフィッシャー85111 | リン酸 | |
| 緩衝生理食塩水(PBSの) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| 名 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 抗体 | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&Dシステム | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| TBR1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
参考文献
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al.
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