このプロトコルでは、上気道から邪魔されず粘膜被覆液のサンプリングのための非侵襲的技術について説明します。それは、すべての年齢層の被験者でタンパク質メディエーター、サイトカイン、ケモカインなどの生体内レベルの定量化を実行する使用できます。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
このプロトコルでは、妨げられていない上部気道粘膜内層流体の非侵襲的サンプリングについて説明します。それはまた刺激プロシージャ (よく、他の技術によって使用される) を必要とせず、気道局所の免疫署名に関する流体波における免疫メディエーターの分析の前に使用される抽出手順の詳細します。フィルター ペーパーのストリップの粘膜内層液をサンプリング下鼻甲介と吸収の 2 分間左の前部で置かれました。検体用濾紙から溶出され、同じサンプルの低レベルと高レベル分析の高感度定量を可能にする、電気化学発光を用いたイムノアッセイ法によって抽出された蛋白質基づいた溶出を分析します。上部気道粘膜における情報伝達システム特定の免疫に関連する 20 あらかじめ免疫メディエーターの体内レベルを測定したが、技術はその特定のパネルまたはサンプリング サイトに制限されていません。技術は、アレルギー性鼻炎小児2000 (COPSAC2000) コホート研究における喘息のコペンハーゲンの前向き研究から 7 歳児に最初実装されました。それはその後 1 ヶ月、2 歳、6 歳、急性呼吸器症状のインスタンスをサンプリング、縦の COPSAC2010出生コホートで使用されました。いくつかのサンプル (中央 (四分範囲 (IQR)) として報告測定検出限界以下であった我々 は正常に取得し 700 1 か月児の 620 (89%) からサンプルを分析した; します。各調停の (すなわち0 から検出下限値の設定ポイント) の検出限界以下のサンプル数は、29 (7.25 119.5) だった。この技術は、誕生からin vivo気道粘膜免疫プロファイルの数量化できる、縦、適用することができます、遺伝学と初期の生活環境暴露、病態、endotyping、および呼吸器疾患と開発と新規治療薬の評価の監視の影響に関する研究に適用することができます。
概要
鼻の粘膜内層液上部気道系の液体の一部を占めています。調停に由来する上皮および侵入の微生物に対する防御の最初の行を構成する免疫細胞間の相互作用の複雑なマトリックスで構成されています。鼻の粘膜は簡単にアクセスできる、鼻と気管支1の免疫学的機能の強い関係があります。この区画は幼年期、生命に後でより普及しているその他の呼吸器系疾患の範囲にも喘息やアレルギー性鼻炎などでは一般的な気道疾患に関連して特別な関心。
ここでは、サンプル邪魔されず鼻腔から流体をライニング粘膜フィルター紙ベース、非侵襲的手法としてそれに続く抽出プロシージャを使用して、その定量化する前にフィルター ペーパーからの検体の蛋白質ベースの溶出に使用するメソッドの実装について述べる.この手法は、生体内で健康な個人と様々 な呼吸器疾患を持つ個人の免疫の署名を取得するたとえば、使用できます。さらに、特定免疫署名の重要性の露出を確認し、予測または発病後の調停の場合を評価することが可能です。
粘膜内層液は、鼻洗浄2がよく付いている鼻チャレンジ テスト、炎症性応答3,4を刺激するために高いレベルでのアレルゲンが導入される以前受けた。ただし、鼻洗浄技術....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
ヘルシンキ宣言の基本理念に基づき、研究を行った。(KF 01-289/96 COPSAC2000 ) および H-B-2008-093 COPSAC2010のコペンハーゲン、デンマークのデータ保護局の倫理委員会から承認が得られたし、入学前に各教科の親の両方から書面によるインフォームド コンセントを得た。
1. 実験装置
- フィルターの紙のシートを使用して、(線維の水酸化ポリエステル シート材料の表を参照してください)6,7。
- お子様や大人 (5 × 20 × 10 mm (L の短い腕)) ためストリップ 3 × 15 mm 1 ヶ月歳の子供のための大きさで、L 字型にカットします。
- 鉗子を用いた幼児各鼻孔にフィルターの紙一枚を挿入します。下鼻甲介 (新生児の鼻と他のすべての年齢のため 1.5 cm 内側約 1 cm) の前方の部分にろ紙を置きなさい。
- ベッドの上に新生児を置くし、快適さのための砂糖水を与えます。
注: 他のすべての年齢の子供たち、サンプリングが実行されます最も簡単に件名が椅子に座っているの。 - お子様のためには、各鼻孔に L 形のフィルター紙の長い腕を挿入します。 ....
- ベッドの上に新生児を置くし、快適さのための砂糖水を与えます。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
気道免疫プロファイルのベースライン特性：
COPSAC2010コホートに登録された700人の子供のうち、620人（89%）において、生後1か月時点の上気道粘膜免疫メディエーターレベルに関する完全なデータが得られた。10人の新生児は手法が確立される前に登録されており、19人は生後1か月の受診に至らなかった。さらに、パイロット研究で使用された別の研究室で抽出および測定が行われたため47サンプルを除外したほか、輸送中に4サンプルが紛失した（研究フローチャート、図1を参照）。コホートのベースライン特性を表1に示す。
ほとんどのメディエーターは、検出レベルが低かった。 <10 pg/mL（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17A、TGF-β1、I.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ここで示した手法、体内上部気道粘膜免疫プロファイル以前行われていない時代の 1 ヶ月という早い時期から子供を決定することができました。気道細菌がその存在や周産期曝露と同様、ピコルナ ウイルス7,11, pre が新生児の気道の免疫プロファイルにミラー化されたを見ました。さらに、我々 は高用量ビタミン d の微量栄養素の無作為化試験の作用機構の研究これらの気道の免疫プロファイル データを使用これらの結果とその気道免疫メディエーターの後体内の定量化のための非侵襲的サンプリング手法として粘膜内層の流体技術の有用性に下線を引きます。
次の点がメソッドの実装前に考慮に値する: 粘膜内層流体マトリクスにおけるサイトカインを測定するために電気化学発光のプロトコルによって提供されるようの高感度に基づく免疫測定法の方法論を使用することが重要です。酵素イムノアッセイの使用は吸光度読み出しの推論につながることができます。さらに、鼻と気管支の強い関係があ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
すべての著者には、この原稿の内容に関する潜在的な知覚、または実質利益相反の宣言しません。資金の機関設計と試験の実施で、役割はありませんでした。コレクション、管理、およびデータの解釈または、準備、レビュー、および原稿の承認。研究に関与する製薬会社がありませんでした。
謝辞
子どもと家族の COPSAC2010のコホート研究にすべての彼らのサポートとコミットメントに感謝の意を申し上げます。認識し、COPSAC 研究チームとサイトカインとケモカインの測定技術者 Lisbeth Buus Rosholm、デンマーク工科大学から技術の助けのユニークな努力に感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 繊維状ヒドロキシル化ポリエステルシート | Accuwik Ultra | SPR0730 | フィルター |
| ペーパーMilliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| 低タンパク質結合保存プレート | Thermo Scientific | CLS8161 | プレート |
| プロテアーゼ阻害剤 | Roche | 11873580001 | EDTAフリー プロテアーゼ阻害剤カクテル |
| リーダー | |||
| メソスケール | ヒト10プレックスTH1 / TH2サイトカインアッセイおよび9プレックスケモカインアッセイ、およびシングルプレックスIL-17A、TGF-&β;1 と TSLP です。説明はオンラインで見つけることができます www.mesoscale.com |
参考文献
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), Supplement 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflamm....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
