方法論記事

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

DOI：

10.3791/55800

⸱

2017年8月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood (COPSAC), Herlev and Gentofte Hospital, University of Copenhagen, 2Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of Denmark

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、上気道から邪魔されず粘膜被覆液のサンプリングのための非侵襲的技術について説明します。それは、すべての年齢層の被験者でタンパク質メディエーター、サイトカイン、ケモカインなどの生体内レベルの定量化を実行する使用できます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、妨げられていない上部気道粘膜内層流体の非侵襲的サンプリングについて説明します。それはまた刺激プロシージャ (よく、他の技術によって使用される) を必要とせず、気道局所の免疫署名に関する流体波における免疫メディエーターの分析の前に使用される抽出手順の詳細します。フィルター ペーパーのストリップの粘膜内層液をサンプリング下鼻甲介と吸収の 2 分間左の前部で置かれました。検体用濾紙から溶出され、同じサンプルの低レベルと高レベル分析の高感度定量を可能にする、電気化学発光を用いたイムノアッセイ法によって抽出された蛋白質基づいた溶出を分析します。上部気道粘膜における情報伝達システム特定の免疫に関連する 20 あらかじめ免疫メディエーターの体内レベルを測定したが、技術はその特定のパネルまたはサンプリング サイトに制限されていません。技術は、アレルギー性鼻炎小児2000 (COPSAC2000) コホート研究における喘息のコペンハーゲンの前向き研究から 7 歳児に最初実装されました。それはその後 1 ヶ月、2 歳、6 歳、急性呼吸器症状のインスタンスをサンプリング、縦の COPSAC2010出生コホートで使用されました。いくつかのサンプル (中央 (四分範囲 (IQR)) として報告測定検出限界以下であった我々 は正常に取得し 700 1 か月児の 620 (89%) からサンプルを分析した; します。各調停の (すなわち0 から検出下限値の設定ポイント) の検出限界以下のサンプル数は、29 (7.25 119.5) だった。この技術は、誕生からin vivo気道粘膜免疫プロファイルの数量化できる、縦、適用することができます、遺伝学と初期の生活環境暴露、病態、endotyping、および呼吸器疾患と開発と新規治療薬の評価の監視の影響に関する研究に適用することができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

鼻の粘膜内層液上部気道系の液体の一部を占めています。調停に由来する上皮および侵入の微生物に対する防御の最初の行を構成する免疫細胞間の相互作用の複雑なマトリックスで構成されています。鼻の粘膜は簡単にアクセスできる、鼻と気管支1の免疫学的機能の強い関係があります。この区画は幼年期、生命に後でより普及しているその他の呼吸器系疾患の範囲にも喘息やアレルギー性鼻炎などでは一般的な気道疾患に関連して特別な関心。

ここでは、サンプル邪魔されず鼻腔から流体をライニング粘膜フィルター紙ベース、非侵襲的手法としてそれに続く抽出プロシージャを使用して、その定量化する前にフィルター ペーパーからの検体の蛋白質ベースの溶出に使用するメソッドの実装について述べる.この手法は、生体内で健康な個人と様々 な呼吸器疾患を持つ個人の免疫の署名を取得するたとえば、使用できます。さらに、特定免疫署名の重要性の露出を確認し、予測または発病後の調停の場合を評価することが可能です。

粘膜内層液は、鼻洗浄2がよく付いている鼻チャレンジ テスト、炎症性応答3,4を刺激するために高いレベルでのアレルゲンが導入される以前受けた。ただし、鼻洗浄技術は、幼児に適さないことがし、5アッセイの検出限界値以下のレベルが落ちることができる希薄化後の調停者として、結果を混同する不明な希釈率を紹介します。また、不明な希釈倍率により鼻チャレンジ テストから測定試料応答が設定コホートで鼻洗浄法の有用性を制限すること、個人間に匹敵します。最後に、アレルゲンの挑戦は、鋭敏化の分野で適用されるだけ、ヒスタミンの挑戦など、その他の課題は生理学的関連性の高い、メディエーター遊離の天井の効果を引き起こす可能性がありますありません。これらの問題は、流体と検体レベルの個々 の分泌が個体間の差異に影響を与える唯一の要因を粘膜内層流体コレクションの紹介したフィルター紙ベース テクニックで回避します。

抽出中に、検体は、すべてのサンプルに、バッファーの同じボリュームの付加の後でフィルター ペーパーから溶出されます。これは、すべてのサンプルの希釈前のヴィヴォ同様優先されます。抽出手順にアルブミン ベース等張食塩水の抽出バッファーを使用します。蛋白質ベースのメディエーターの抽出と定量化の前に溶出蛋白質の以降凍結変性を抑えるタンパク質を安定できます。抽出段階でのタンパク質分解を避けるためには、プロテアーゼ阻害剤のカクテルは抽出バッファーに追加されます。

邪魔されない生体内での定量化を可能にする技術の実装-粘膜のサイトで生成された免疫メディエーターが非常に重要です。最初に、粘膜のサイトは体内最大の免疫臓器をなります。第二に、鼻の位置の気中暴露のプライマリ サイトで、肺1呼吸器免疫学的区画にしっかりと接続されています。第三に、非侵襲的手法でこの重要な器官の調査の可能性は健康と気道の病気に関連して重要な微生物免疫の相互作用軸情報の茄多を提供する可能性を開きます。第四に、この技術は、医薬品と栄養素のランダム化された、制御された試験のローカル免疫学的変化などの他の多くの可能なアプリケーションがあります。

喘息のコペンハーゲンの前向き研究の手法を実装されて最初幼年期2000 (COPSAC2000) コホート研究において、7 歳児健常者13対アレルギー性鼻炎の粘膜内層液の免疫のプロフィールを調べた。その後、我々 は正常に縦 COPSAC2010コホートと評価気道免疫プロファイルにこの手法を適用 1 ヶ月、2 歳、6 歳の時、急性呼吸器症状のインスタンスで。1 歳 1 か月の新生児からの結果は、免疫の署名と初期の生活環境暴露7,8,9,10、11,12間の重要な関連を示しています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヘルシンキ宣言の基本理念に基づき、研究を行った。(KF 01-289/96 COPSAC2000 ) および H-B-2008-093 COPSAC2010のコペンハーゲン、デンマークのデータ保護局の倫理委員会から承認が得られたし、入学前に各教科の親の両方から書面によるインフォームド コンセントを得た。

1. 実験装置

  1. フィルターの紙のシートを使用して、(線維の水酸化ポリエステル シート材料の表を参照してください)6,7。
    1. お子様や大人 (5 × 20 × 10 mm (L の短い腕)) ためストリップ 3 × 15 mm 1 ヶ月歳の子供のための大きさで、L 字型にカットします。
  2. 鉗子を用いた幼児各鼻孔にフィルターの紙一枚を挿入します。下鼻甲介 (新生児の鼻と他のすべての年齢のため 1.5 cm 内側約 1 cm) の前方の部分にろ紙を置きなさい。
    1. ベッドの上に新生児を置くし、快適さのための砂糖水を与えます。
      注: 他のすべての年齢の子供たち、サンプリングが実行されます最も簡単に件名が椅子に座っているの。
    2. お子様のためには、各鼻孔に L 形のフィルター紙の長い腕を挿入します。
  3. 不快感を最小限に抑えるため、フィルター ペーパーの偶然の損失を避けるために鼻孔の周りに鼻クリップを適用します。
  4. 吸収の 2 分後に、フィルター ペーパーを削除します。
  5. ラベルの付いたチューブでフィルター ペーパーを置き、-80 ° c. ですぐにそれらを凍結
  6. サンプリングの日に子どもに示す気道感染の症状のメモしておきます。
  7. どんなくしゃみ、持続的な泣き、またはサンプリングの 2 分の中に発生する鼻出血を記録します。

2. 気道免疫メディエーターの定量化

  1. 冷凍庫から 10 までのランダムなサンプルを取る。識別番号を記録します。全体の作業工程の中に氷のサンプルを保ちます。
  2. 氷の融解後没頭 (通院) フィルター ペーパー両方の鼻から 300 μ L 作りたてのバッファー (参照材料表) 含まれている 1 つ完全なプロテアーゼ阻害剤タブレット (材料の表を参照してください) 25 mL のバッファーあたり。
    1. フィルター ペーパーのサイズに従ってバッファーのボリュームを調整します。
      1. フィルター ペーパーのサイズ 3 × 15 mm のバッファーの 300 μ L を使用します。
      2. フィルター紙の 1 つだけの場合は、半分のバッファー量 (150 μ L) を使用します。
  3. タイマー 5 分使用プレート シェーカー (400 回転) にサンプルを転送します。
  4. 遠心機内に配置、酢酸セルロース チューブ フィルター (0.22 μ m 孔サイズ) のカップに湿ったフィルター ペーパーおよびアッセイバッファーを転送管 (材料の表を参照してください)。
  5. (4 ° C) で冷却遠心機で 5 分間 16,000 x g で遠心分離機の管にフィルター処理された鼻エキスを入手します。
  6. カップを削除し、低蛋白結合記憶板 (材料の表を参照してください) の井戸に早かったしながら氷の上管鼻のエキスを維持します。
  7. 解析まで-80 ° C で保存します。
  8. 高感度、electrochemiluminesce ベースの多重配列を用いた鼻抽出におけるサイトカインとケモカイン濃度を把握 (材料の表を参照してください)。
    注: 人間 10 プレックス TH1/TH2 サイトカインのアッセイ、9 プレックス ケモカイン アッセイとシングル プレックス IL 17A、TGF-β 1、TSLP を行ったここ。
    1. 試金、4 ° C で一晩鼻のエキスを孵化させなさい。標準メーカーごとプロトコル (材料の表を参照してください) として測定を行います。
      注: イムノアッセイ測定 1 までの高ダイナミック レンジがある (材料の表を参照してください) 通常 & 10,000 pg/mL である試金 100,000 pg/mL をすることができますが。これは、すべてのサンプルを他の同様のイムノアッセイにおける場合と同様、健康と病気における異種希釈の影響が少なくて、同じ希釈で実行できることを意味します。すべてのサイトカインの検出下限値 1 pg/mL であったまたはそれが 1 間遠隔以下、ケモカイン、& 50 pg/mL。1 カ月の年齢に TSLP がサンプルの 98% で検出可能でした。

3. 統計

  1. サイトカインおよびケモカイン レベルの正規分布の残差を取得する解析の前にデータを対数変換します。
  2. サンプルは 1 つ以上のバッチで分析し場合、は、対数変換データを中心に batch-wise のサイトカイン ・ ケモカインのデータを修正します。
    1. 全体的な平均と元の寸法の単位でデータを取得する逆対数変換を組み込みます。
      注: 分析を行うのセットごとに、サイトカインやケモカインのレベルに影響を与える変数を調整することを検討してください。これはサンプリング、兄弟、ホームなどでペットに有害事象、母乳育児における母親の影響 (例えば、アルコール消費量と妊娠中の喫煙) ことがでした。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

気道免疫プロファイルのベースライン特性:
生後1ヶ月での上気道粘膜免疫メディエーターレベルに関する完全なデータは、COPSAC2010コホートに登録された700人の子供のうち620人(89%)で得られました。この技術が確立される前に10人の新生児が登録され、19人は1か月の訪問に参加しませんでした。さらに、47のサンプルは、パイロット研究で使用された別の実験室で抽出および測定されたため、除外され、4つのサンプルは輸送中に失われました(研究フローチャート図1を参照)。コホートのベースライン特性を表1に示します。

ほとんどのメディエーターの検出レベルは10 pg/mL10 pg/mL（CXCL10、CCL2、CCL11、CCL26、およびCCL22)であったりしました（表2...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで示した手法、体内上部気道粘膜免疫プロファイル以前行われていない時代の 1 ヶ月という早い時期から子供を決定することができました。気道細菌がその存在や周産期曝露と同様、ピコルナ ウイルス7,11, pre が新生児の気道の免疫プロファイルにミラー化されたを見ました。さらに、我々 は高用量ビタミン d の微量栄養素の無作為化試験の作用機構の研究これらの気道の免疫プロファイル データを使用これらの結果とその気道免疫メディエーターの後体内の定量化のための非侵襲的サンプリング手法として粘膜内層の流体技術の有用性に下線を引きます。

次の点がメソッドの実装前に考慮に値する: 粘膜内層流体マトリクスにおけるサイトカインを測定するために電気化学発光のプロトコルによって提供されるようの高感度に基づく免疫測定法の方法論を使用することが重要です。酵素イムノアッセイの使用は吸光度読み出しの推論につながることができます。さらに、鼻と気管支の強い関係があ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての著者には、この原稿の内容に関する潜在的な知覚、または実質利益相反の宣言しません。資金の機関設計と試験の実施で、役割はありませんでした。コレクション、管理、およびデータの解釈または、準備、レビュー、および原稿の承認。研究に関与する製薬会社がありませんでした。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

子どもと家族の COPSAC2010のコホート研究にすべての彼らのサポートとコミットメントに感謝の意を申し上げます。認識し、COPSAC 研究チームとサイトカインとケモカインの測定技術者 Lisbeth Buus Rosholm、デンマーク工科大学から技術の助けのユニークな努力に感謝します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
繊維状ヒドロキシル化ポリエステルシートAccuwik Ultra SPR0730フィルター
ペーパーMilliplex Assay Buffer MilliporeL-ABBuffer
低タンパク質結合保存プレート Thermo ScientificCLS8161プレート
プロテアーゼ阻害剤Roche11873580001EDTAフリー プロテアーゼ阻害剤カクテル
リーダー
 メソスケールヒト10プレックスTH1 / TH2サイトカインアッセイおよび9プレックスケモカインアッセイ、およびシングルプレックスIL-17A、TGF-&β;1 と TSLP です。説明はオンラインで見つけることができます www.mesoscale.com
マルチスポットプレート メソスケール NA セクターイメージャー 6000 アッセイ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), Supplement 147-334 (2001).
  2. Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), Supplement 414-441 (2005).
  3. Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
  4. Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
  5. Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
  6. Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
  7. Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
  8. Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
  9. Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
  10. Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700(2013).
  11. Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
  12. Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
  13. Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
  14. Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
  15. Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
  16. Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
  17. Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
  18. Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

Mucosal Lining FluidUpper AirwayImmune Mediator QuantificationNoninvasive SamplingFilter Paper AbsorptionElectrochemiluminescence ImmunoassayNasal Extract AnalysisProtease Inhibitor SupplementLow Protein Binding StoragePediatric Respiratory Diseases

関連記事