方法論記事

光応答性高分子ナノキャリアからのsiRNA放出の時空間制御による遺伝子サイレンシングの予測

DOI：

10.3791/55803

⸱

2017年7月21日

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本発明者らは、検出可能なオフターゲット効果なしに遺伝子サイレンシングのより効率的な時空間制御のために光反応性ブロックコポリマーを使用する新規な方法を提示する。さらに、遺伝子発現の変化は、単純なsiRNA放出アッセイおよび単純な運動モデルを用いて予測することができる。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

遺伝子活性の正確な制御を必要とする広範囲の用途のための核酸の結合対放出をより良好に制御するために、新しい材料および方法が必要とされている。特に、遺伝子発現より時空間制御が改良された新規の刺激応答材料は、創薬および再生医療技術において翻訳可能なプラットフォームのロックを解除するであろう。さらに、材料からの核酸放出を制御する能力の向上は、ナノキャリア効果を先験的に予測する合理的な方法の開発を可能にし、送達媒体の迅速なスクリーニングをもたらす。本明細書では、遺伝子サイレンシング効率を予測し、モジュラー光応答性ナノキャリアシステムを介して遺伝子発現に対する時空間制御を達成するためのプロトコールを提示する。低分子干渉RNA（siRNA）は、mPEG- b-ポリ（5-（3-（アミノ）プロポキシ）-2-ニトロベンジルメタクリレート）（mPEG- b -P（APNBMA））ポリマーとfo安定したナノキャリヤを光で制御して、調整可能なオン/オフsiRNA放出を容易にすることができる。細胞内環境を模倣する溶液からのsiRNA放出の正確な定量化のために、蛍光相関分光法およびゲル電気泳動を用いる2つの相補的アッセイを概説する。これらのアッセイから得られた情報は、様々な光刺激条件に対する動的サイレンシング応答を予測するための単純RNA干渉（RNAi）動態モデルに組み込まれた。次に、これらの最適化照射条件は、遺伝子サイレンシングを空間的に制御するための新しいプロトコールの改良を可能にした。この方法は、細胞間分解能および検出可能なオフターゲット効果を伴わない遺伝子発現における細胞パターンを生成することができる。我々のアプローチは、遺伝子発現の動的変化を予測し、時空間でsiRNAの活性を正確に制御する使いやすい方法を提供します。この一連のアッセイは、様々なotを試験するために容易に適合させることができる生物医学研究および医学における多数のアプリケーションに関連する重要な課題に取り組むために、彼女の刺激応答システムを開発しました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

低分子干渉RNA（siRNA）は、事実上すべての標的遺伝子1に対して高度に特異的で強力で触媒的なRNAi経路を介して転写後遺伝子サイレンシングを仲介します1 。これらの有望な特性は、転移性黒色腫および血友病2、3を含む多数の疾患の治療のためのヒト臨床試験に進めるためにsiRNA治療剤を有効にしています。しかし、翻訳を妨げている重要な配送問題は依然として残っている4 。特に、送達媒体は安定したままでなければならず、siRNAを細胞外分解から保護しなければならず、ペイロードも細胞質に放出される5 。さらに、多くのRNAiアプリケーションでは、siRNA治療法7における副作用を軽減し、形質転換を可能にする空間および時間6における遺伝子サイレンシングを制御する改良された方法が必要とされている創薬8のための細胞マイクロアレイから再生骨格の細胞応答の調節に至るまでの用途における驚異9 。これらの課題は、siRNAナノキャリアにおける結合対放出をより良好に制御するための新しい材料および方法の必要性を強調している。

siRNAの放出を制御し、時空間調節を強化するための最も有望な戦略の1つは、刺激応答性物質の使用である10 。例えば、変化した酸化還元電位またはpH、または印加された磁場、超音波、または光11に応答して変化する核酸結合親和性を有する多種多様な生体材料が設計されている。これらの系の多くは、核酸活性に対する改善された制御を示すが、トリガーとしての光の使用は、その瞬間的な時間応答、正確な空間分解能、および調整性の容易さのために特に有利である 12。さらに、遺伝子発現を調節するための光感受性技術の可能性は、最先端の誘導性プロモーターおよび光生成制御システムによって実証されている。しかしながら、これらのシステムは、限られた内因性遺伝子を調節する能力は、そのような免疫原性などの安全性の問題、および多成分アセンブリ13、14、15を送達する際の困難を含む多くの課題に悩まされています。光応答性のsiRNAナノキャリアは、理想的には、これらの欠点を克服し、時空間的遺伝子発現16、17、18を調節するより簡単でより堅牢なアプローチを提供するために適しています。残念なことに、得られたタンパク質ノックダウン応答を正確に予測する方法は依然として分かりません。

重要な課題は、siRNA放出の定量的評価が、レア19、20、およびこれらの評価を行った場合であっても、彼らが、siRNA /タンパク質代謝回転のダイナミクスの解析に結合されていません。放出されるsiRNAの量およびその持続性/寿命は、得られる遺伝子サイレンシングダイナミクスの重要な決定因子である。そのような情報の欠如は、RNAi 21の用量応答の正確な予測を妨げる主要な切断である。この挑戦に取り組むことは、ナノキャリヤにおける適切な構造 - 機能関係の形成を促進し、生体材料設計22をより良く伝えるだろう。さらに、そのようなアプローチは、より効果的なsiRNA投薬プロトコールの開発を可能にする。ダイナミックなサイレンシング応答を理解しようとする試みには、いくつかのグループは、RNAi 23、24、25の数学的モデルを検討しました。これらのフレームワークは遺伝子発現におけるsiRNA媒介性変化の洞察を提供し、律速段階26を同定することに成功した。しかしながら、これらのモデルは、制御されたsiRNA放出ができない市販の遺伝子送達システム（ 例えば 、リポフェクタミンおよびポリエチレンイミン（PEI））にのみ適用されており、モデルの複雑さは、その有用性を著しく制限している27 。これらの欠点は、合理化された使い易い予測動態モデルと組み合わせて、正確に同調可能なsiRNA放出を可能にする新しい物質に対する満たされていないニーズを強調している。

我々の方法は、光感受性ナノキャリアープラットフォームと、結合siRNAとモデルRNAiのダイナミクスを定量する結合法を統合することにより、これらの課題を解決します。特に、我々のプラットフォームの正確に制御されたsiRNA放出28は、カプセル化されたものと un結合したsiRNA。これらのアッセイからの実験データは、先験的に遺伝子サイレンシング効率を予測するための単純な動態モデルに入力される29 。最後に、ナノキャリアのオン/オフ特性は、細胞の長さスケールの空間的制御を伴う遺伝子発現における細胞パターンの生成に容易に利用される。このように、この方法は、細胞挙動の時空間的調節から利益を得る多様な適用において遺伝子サイレンシングを制御および予測するための容易に適合可能な方法を提供する。

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プロトコル

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1. siRNAナノキャリアの処方

  1. pH 6.0で20mM 4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES）緩衝液で希釈した等容量のsiRNAとmPEG- b -P（APNBMA）の別々の溶液を調製する。
    1. 32μg/ mLの濃度のsiRNAを20mM HEPES溶液に添加する。
      注：siRNAは、標的化されていない普遍的な負の制御配列であった。しかし、siRNAは、目的の任意の遺伝子を標的とするように設計することができる。
    2. mPEG- b -P（APNBMA）ポリマーを20mMのHEPES溶液に溶解する。 N / P比（N、mPEG- b -P（APNBMA）; P上のアミン基、siRNA上のリン酸基）がN / P比になるように、適切な量のmPEG- b -P（APNBMA）を加えて220μg/ 4です。
      注：mPEG- b -P（APNBMA）ポリマーの合成プロトコールは他の場所で報告されている30 。
  2. mPEG- b -P（APNBMA）溶液を等体積に滴下するeをsiRNA溶液の中に入れ、ボルテックスで穏やかに混合する。ポリマーの添加後30秒間ボルテックスし続けます。サンプルを暗所で室温で30分間インキュベートする。

2.ゲル電気泳動を用いたsiRNA放出の測定

  1. ステップ1.1~1.2に従ってナノキャリアを処方し、所望のサンプル数に対応するように体積をスケールする。
  2. ナノキャリアをドデシル硫酸ナトリウム（SDS）と混合する。
    1. 水中に1mg / mLのSDS溶液を調製する。 S / P比（S、SDS上の硫酸基、P、siRNA上のリン酸基）が15である溶液を生成するのに必要な量のSDS溶液を分取する。
      注記：ポリプレックス溶液に1μgのsiRNAが含まれている場合は、13μgのSDSを加えて15のS / P比を達成する必要があります。
    2. ボルテックスで穏やかに混合しながら、各ナノキャリア溶液にSDS溶液を滴下する。 SDS添加後30秒間ボルテックスし続ける。
  3. 365 nmフィルターを使用してUVレーザーをキャリブレーションし、200 W / mの強度に設定します。光強度は、サンプル溶液の底が置かれる場所から測定されることを確認してください。
  4. ゴム製のガスケットで分離したガラススライドで構成されたガラスチャンバにナノキャリア/ SDS溶液をロードします。
    1. 予め洗浄したガラスを水中で7：3（v / v）エタノール/水溶液中でスライドさせ、完全に乾燥させる。ゴム製のガスケットに穴（〜2 x 3 cmの長方形）を切ってください。スライドガラスにゴム製のガスケットを置きます。
    2. ラバーガスケットの穴の内側のガラススライドにナノキャリア/ SDS溶液をピペットで注入します。ゴム製のガスケットとの接触を避けながら、余分な溶液（余分に20μL）をガラススライド上にロードする。
      注記：液体の中には、後続のステップで失われるものがあります。
    3. 2番目のガラスを置くスライドガスケットの上にスライドします。気泡の発生を避けるには、スライドの一端を下にしてから、もう一端をゆっくり下げてください。
    4. バインダークリップをガラスチャンバーの両側に取り付け、閉じたままにします。
  5. 200W / mの強度の365nmフィルターを備えたUVレーザーを使用して、所望の時間（ 例えば 、0〜60分間）試料を照射する。バインダークリップを外し、チャンバーを開きます。
  6. 25μLの照射されたナノキャリア/ SDSサンプルをマイクロ遠心管にピペットで入れる。溶液を暗所で室温で30分間インキュベートする。
  7. トリス/ホウ酸塩/ EDTA（TBE）緩衝溶液中、0.5μg/ mL臭化エチジウムで予め染色した2重量％アガロースゲルを標準的なプロトコール31に従って調製する。 3：7（v / v）グリセロール/水からなるローディングバッファーを調製する。
  8. 25μLの各ナノキャリア/ SDSサンプルに5μLのロードバッファー溶液を加えます。暗所でサンプルをインキュベートする室温で10分間。
  9. 30μLの各ナノキャリア/ SDSサンプルを2％アガロースゲルにロードする。暗所で100Vで30分間ゲルを泳動する。臭化エチジウムフィルターを用いたゲルイメージングシステムを使用してゲルを画像化する。ゲル画像ファイルを保存し、バンド強度定量化のためにステップ2.10に進む。帯域の明暗が明瞭に視覚化できるほど明るく、信号が飽和しすぎていないことを確認してください。
  10. 公的に入手可能なImageJソフトウェア32を用いてバンド強度を定量化する。
    1. ImageJのROIツールを使用して、各バンドの周りに長方形を描くことにより、各レーンの遊離siRNAバンドの蛍光強度を決定します。各車線の強度曲線をプロットし、強度曲線を横切る水平線を描き、囲まれた領域内のトレースワンドをクリックすることによって、曲線の下の領域を積分する。
    2. 各レーンの相対的な強度を、cusiRNA陽性対照（mPEG- b -P（APNBMA）を添加せず、SDSを添加していない）の曲線下の面積で各試料のrveを測定した。各サンプルの正規化バンド強度として放出されたsiRNAのパーセンテージを報告する。

3.蛍光相関分光法（FCS）を用いたsiRNA放出の測定

  1. センス鎖の5 '末端に単一フルオロフォアで標識されたsiRNAを得る。
    注：siRNAは、所望の位置に標識された標識を用いてプレアニーリングされた状態で購入することができる。フルオロフォアは、光安定性であり、mPEG- b -P（APNBMA）によるUV光消光およびエネルギー移動を避けるために、450〜750nmの間で吸収/放出するべきである。
  2. 標識されたsiRNAを用いて、ステップ1.1〜1.2に従ってナノキャリアを処方する。必要なサンプル数に合わせて音量を調整します。
  3. SDS中で溶液をインキュベートし、ステップ2.2~2.6に従って所望の時間照射する。
  4. 準備FCSサンプルチャンバのアターション。
    1. ガラススライドを7：3（v / v）エタノール/水溶液で洗浄し、ワイプと空気流を用いてガラスを完全に乾燥させる。
    2. 両面接着剤スペーサから紙片を取り出して、両面接着剤スペーサを露出させる。ガラスカバースリップにスペーサーを取り付けます。
    3. ナノキャリア/ SDS溶液を、接着剤スペーサから穴の中央のカバースリップにピペットで移す。
    4. スライドガラスをカバーガラスの上に置きます。ガラススライドを押して、スライドガラスとカバースリップがしっかりと取り付けられ、シールを形成するようにします。
  5. FCS測定には共焦点顕微鏡を使用する33 。開口数1.2の40X水浸アポクロマート対物レンズを使用してください。試料34当たり10秒毎の少なくとも30回の測定値を収集するために適切な励起レーザチャネル（488 nm）を使用します。レーザー強度と検出器の位置合わせが残っていることを確認する各サンプルについて同じ。
    1. 実験サンプルに加えて、以下を含む測定コントロール：標識siRNAを含まないブランクサンプル;および標識されたsiRNAを有するがmPEG- b -P（APNBMA）を含まない遊離siRNA試料を含む。
  6. FCS特有のソフトウェアを使用してデータを分析する。ナノキャリアが共焦点容積29を通過していない時間中の安定した計数率を決定することによって、各サンプルのベースライン計数率を特定する。
    1. すべてのサンプルベースラインカウントレート値からブランクサンプルのカウントレートを減算します。得られた値を遊離siRNAコントロールに標準化し、遊離siRNA 35のパーセントを計算します。

4.遺伝子サイレンシングを予測する動態モデリング

  1. 遺伝子サイレンシングを予測するための単純な微分方程式を使用して数学的プログラミング言語でスクリプトを作成する29。
    注：スクリプトは要求に応じて利用可能にすることができます。
    1. 常微分方程式の集合を次のように書く：
      figure-protocol-1 （1）
      figure-protocol-2 （2）
      figure-protocol-3 （3）
      注記：式1~3に関して、用語k mRNA 、k siRNA 、およびk protは、それぞれ、mRNA、siRNAおよびタンパク質の産生のための速度定数である。 k m、deg 、k s、deg 、およびk p、degという用語は、それぞれmRNA、siRNAおよびタンパク質の分解速度定数である。分解速度定数は、成分の半減期に基づいて計算され、生産速度定数は、mRNAおよびタンパク質の定常状態値が、f siRNA。
      1. 参照36または文献から記載されているように、目的の遺伝子（単数または複数）のmRNAおよびタンパク質の半減期を決定し、いずれかの実験（ 考察を参照されたいです）。また、細胞株の倍加時間を決定する。これらの値を適切な分解速度式に入力します。
      2. siRNAが導入されない場合、遺伝子発現レベルが100の正規化値で安定したままであるように、生産速度定数を調整する。具体的には、[mRNA]と[タンパク質]が100％の初期正規化値の1％以内にとどまるまで、[siRNA]をゼロに設定し、k mRNA 、k siRNA 、およびkpro生成速度定数の値を変化させるシミュレーション。
      3. 前述のゲル電気泳動およびFCSアッセイから放出された相対量のsiRNAを推定値として使用して、スクリプト中のsiRNAの初期相対濃度を調整する。具体的には、[siRNA]は放出されたsiRNAの相対量に比例し、100の値は最大量29に相当する。

5.細胞培養およびインビトロ siRNA送達

  1. 培養NIH / 3T3ネズミ胚線維芽細胞を、供給者からのプロトコールに従って、単離する。
    1. 増殖培地（10％熱不活性化ウシ胎仔血清および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））中で細胞を増殖させる。 5％CO 2を含む加湿環境下で37℃で細胞を維持する。
  2. 6ウェル組織培養処理プレートに細胞を播種する。
    1. サプライヤーから推奨される継代培養手順に従ってください。血球計数器を用いて細胞を数える。補充された増殖培地中の細胞を75,000細胞/ mLの濃度に希釈する。
    2. 2mLの細胞懸濁液（75,000細胞s / mL）を6ウェルプレートの各ウェルに加える。細胞を付着させ、インキュベーター内で24時間回復させる。
  3. リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄し、血清および抗生物質を含まないトランスフェクション培地（ 表の表を参照）1.5mLを各ウェルに加えることにより、トランスフェクションのための細胞を調製する。
  4. ステップ1.1-1.2に従ってsiRNAナノキャリアを処方する。 30 pmolのsiRNAを含むナノキャリア溶液25μLを各ウェルに添加する。ゆっくりとメディアをピペットで上下にミックスします。細胞をインキュベーター内に3時間置く。
  5. トランスフェクション培地を除去し、各ウェルをPBSで洗浄する。補充された増殖培地1mLを加え、細胞をインキュベーターに入れて30分間回復させる。
  6. 光刺激による処理のために細胞を調製するために、補充された増殖培地を除去する。 1mLのトランスフェクション培地（フェノールレッドなし）を各ウェルに加える。
    注：トランスフェクション培地にフェノールレッドが含まれていないことを確認してください。
  7. 365 nmフィルターを使用してUVレーザーをキャリブレーションし、200 W / mの強度に設定します。光の強さは、細胞プレートの底が置かれる位置から測定されることを確認してください。
  8. 37℃に設定したホットプレート上に細胞を置く。セルのプレートカバーを取り外します。 200W m -2の強度の365nmフィルターを備えたUVレーザーを使用して、所望の時間（最大20分間）プレートの上から細胞を照射する。
  9. トランスフェクション培地を除去し、2mLの補充増殖培地を添加する。さらなる分析（ 例えば 、qPCRについては24時間、ウエスタンブロッティングについては48時間）までインキュベーター中に置く。
    1. ウェスタンブロッティング37およびqPCRのような様々な技術を用いて遺伝子発現の変化を測定する。 GFPなどの可視信号を有する遺伝子38は 、蛍光顕微鏡29を使用します。
      注：これらのテクニックは、使いやすさと正確さのために提案されています遺伝子発現の定量化における

時空間の様式での遺伝子サイレンシングの制御

  1. ステップ5.1-5.7に従って、細胞を培養し、種を分け、トランスフェクトする。
  2. 365 nmの光を完全に遮断し、反射を最小限に抑えるフォトマスクを準備します。
    注：この場合、10×10cmのアルミニウム箔と黒色の建設紙を使用して、光を遮断し、反射を減らしました。アルミニウム箔と建設紙を接着して単一のユニットを形成した。
    1. 所望の形状をフォトマスクに切断/パンチ/機械加工する。たとえば、シャープエッジのブレードと穴あけ機を使用して、フォトマスクに直線パターン（長さ約5 cm）と円形パターン（直径約7 mm）をそれぞれ形成します。
  3. 反射防止面を有する細胞を含むウェルの下に中心を置いたパターンを有する6ウェルプレートの底にフォトマスクを接着する（ 例えば 、黒色のc施工用紙）を配置する。接着剤がパターンの端（3mm以内）の近くに置かれていないことを確認してください。
  4. 2つのリングスタンドを約25 cm離して設置し、プラットフォームが同じ高さになるように各リングスタンドにプラットフォームを取り付けます。プレートをプラットフォームの上に置いて、2つのスタンドの間に細胞プレートを懸垂させます。プレートが水平であることを確認します。
  5. 200W / m 2の強度で365nmのフィルターを備えたUVレーザーを用いて、所望の時間（最大20分間）、サンプルの下から細胞を照射する。
  6. トランスフェクション培地を除去し、2mLの補充増殖培地を添加する。インキュベーターに入れて少なくとも24時間回復させる。画像29を説明するように、蛍光顕微鏡を用いて細胞。

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結果

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ナノキャリアの処方後、 インビトロトランスフェクションに用いる照射条件を知らせるためにsiRNA放出アッセイを行った。放出されたsiRNAのパーセントを決定するために、様々な用量の光を適用した。最初のアッセイは、ポリマーとまだ複合体化/会合しているsiRNA分子から遊離siRNA分子を分離するためにゲル電気泳動を使用した。光で処理されなかったナノキャリアは安定したままであり、siRNAを放出しなかった。照射時間の増加に伴い、遊離siRNAバンドの蛍光強度が増加した。画像解析ソフトウエアを用いてバンド強度を定量すると、siRNAの約15％が光照射の20分後に遊離することが示された。

第2のsiRNA放出アッセイは、ゾル中で自由に拡散したsiRNA分子のパーセントを測定するためにFCSを使用したution。光に曝露されなかったナノキャリアを含有するサンプルのベースライン計数率は、ブランク緩衝液対照サンプルの計数率と同じであり、遊離siRN...

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ディスカッション

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この方法には、特に重要ないくつかのステップがあります。ナノキャリアを製剤化する場合、成分の添加の順序および混合速度は、有効性に影響する2つの重要なパラメータである39 。このプロトコールでは、カチオン性成分、mPEG- b -P（APNBMA）をアニオン性成分であるsiRNAに、ボルテックスしながら滴下方式で添加する必要がある。総処方量に依存して、この混合プロセスは3〜6秒かかる。ナノキャリアが適切に形成されたかどうかを試験するために、動的光散乱などの技術を用いてサイズ分布を測定する。 -P B MPEG-（APNBMA）/ 4のN / P比を有するsiRNAナノキャリアは、〜0.2の28〜140 nmであり、多分散の平均直径を有します。さらに、異なるサイズ/安定性を有するポリプレックスを得るためにN / P比を変化させることができる。これらの研究でN / P比4が選択されたのは、それが完全な隔離を可能にする最も低い比であり、エリエチジウムブロマイド染色の採取。

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、助成金番号P20GM103541および助成金番号P20GM10344615の下、制度開発賞（IDeA）を通じて財政的支援のために国立衛生研究所（NIH）の国立総合医学研究所に感謝します。ここの記述は、NIHの見解を反映していない。また、デラウエアバイオテクノロジー研究所（DBI）とデラウェア経済開発オフィス（DEDO）は、バイオテクノロジーセンター（Bioscience CAT）賞（12A00448）を通じて財政的支援を受けていることも認めています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
siRNASigma-AldrichSIC001non-targeted, universal negative control
mPEG-b-P(APNBMA)SynthetedN/A光応答性高分子
HEPESFisher ScientificBP310-100
sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich436143
ゴムガスケットMcMaster-Carr3788T210.5 mL 厚
UV レーザー Excelitas TechnologiesOmnicure S2000メートレンズと365nmフィルターは
、アガロースFisher ScientificBP160-100
ethidium bromideFisher ScientificBP1302-10
siRNAは、Dy547GE Healthcare Dharmacon, Inc.でカスタムオーダーの蛍光色素は、センスストランド
顕微鏡スライドフィッシャーサイエンティフィック12-550-A3事前に洗浄されたガラス
セキュアシールスペーサーライフテクノロジーS24735両面接着剤
LSM 780 Carl ZeissN/A共焦点顕微鏡
ZEN 2010Carl ZeissN/AFCS解析ソフトウェア
MATLABMathWorksN/Aプログラミング言語
NIH/3T3 cells ATCCATCC CRL-1658
DMEMMediatech10-013-CV増殖培
ウシ胎児血清Mediatech35-011-CV熱不活化
ペニシリン-ストレプトマイシンMediatech 30-002-CI
6 ウェルプレートFisher Scientific08-772-1B
Opti-MEMLife Technologies11058021トランスフェクション培地
in our lab コリを使用 標識されています。地

参考文献

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